朱志成

(遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心省種業(yè)發(fā)展中心，遼寧 沈陽 110034)

玉米是我國的重要作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。玉米種子質(zhì)量直接影響產(chǎn)量，玉米種子純度是評價種子質(zhì)量的重要指標(biāo)[1]。實踐中，我國玉米種子純度鑒定仍以籽粒形態(tài)鑒定、幼苗鑒定和田間小區(qū)種植鑒定為主體，輔以同工酶和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)[2]。

利用種子、幼苗或者株型等形態(tài)差異鑒定純度的方法費時費力，受環(huán)境和基因顯隱性等的影響較大，檢測結(jié)果易出現(xiàn)偏差。同工酶和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)具有簡單、快速、成本低等優(yōu)點，然而，隨著玉米品種數(shù)量的逐年增多，種質(zhì)資源狹窄，同質(zhì)化問題愈顯突出，難以找到雜交種特征帶，難以進(jìn)行有效的品種純度檢測。

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對玉米品種純度鑒定的優(yōu)越性在于：SSR分子標(biāo)記數(shù)量大，特異性高，可鑒定表型難于鑒別的品種；SSR分子標(biāo)記不受任何環(huán)境因素的影響，可在生長發(fā)育的任何階段取材鑒定；SSR分子標(biāo)記呈共顯性遺傳，操作靈活、簡便、快速，易于分析；利用SSR分子標(biāo)記鑒定品種，不僅準(zhǔn)確可靠，而且還便于實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。

本研究利用20對SSR基本引物對玉米品種“良玉88”進(jìn)行篩選，以期獲得對玉米品種“良玉88”具有雙親互補帶型的特異性引物，并對其進(jìn)行純度鑒定[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

本研究供試材料的玉米雜交品種“良玉88”及其雙親，由丹東登海良玉種業(yè)有限公司提供(見表1)。

表1 雜交種及其雙親

1.1.2 SSR基本引物

參考NY/T1432-2014標(biāo)準(zhǔn)，采用20對SSR基本引物[4,5]。

表2 20對SSR基本引物

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用植物基因組DNA分子試劑盒提取玉米單粒種子DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

1.2.2.1 擴(kuò)增體系

反應(yīng)各組分見表3。

表3 擴(kuò)增反應(yīng)體系

1.2.2.2 PCR程序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：設(shè)置94℃，預(yù)變性5min，再進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增；在94℃條件下，運行40s；60℃條件下，運行35s；72℃條件下，運行45s；1次循環(huán)結(jié)束。擴(kuò)增循環(huán)設(shè)置為35次，在72℃條件下，5min，擴(kuò)增結(jié)束。在4℃條件下保存待測。

1.2.3 PAGE膠電泳

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠上，電泳分離觀察擴(kuò)增結(jié)果。先用PCR儀在94℃條件下，運行5min后，使DNA雙鏈變性為單鏈。將制備好的4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠裝上電泳槽，設(shè)置90W的恒功率，運行20min；再將變性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，設(shè)置80W的恒功率，運行40min，進(jìn)行電泳分離SSR引物擴(kuò)增出的DNA片段。用冰醋酸配制10%固定溶液，浸泡聚丙烯酰胺凝膠5min，進(jìn)行固定，用AgNO3配制0.2%的染色溶液，浸泡聚丙烯酰胺凝膠5min，對上述DNA片段進(jìn)行染色；將凝膠漂洗于雙蒸水中2次，每次10s；用1.5%的NaOH和0.4%甲醛配制顯影液，浸泡聚丙烯酰胺凝膠直至顯影；用10%固定溶液固定。

2 結(jié)果

由圖1所示，可以觀察到umc1705w1引物擴(kuò)增玉米品種“良玉88”和父母本的PAGE膠電泳圖譜，1～3為父本S122的PCR擴(kuò)展片段，1條較小的譜帶，20～27為母本M54的PCR擴(kuò)展片段，1條較大的譜帶；umc1705w1引物擴(kuò)增的父本譜帶和母本譜帶有明顯差異；玉米品種“良玉88”的PCR擴(kuò)展片段，有2條譜帶，1條譜帶與父本相同，1條譜帶與母本相同。結(jié)果表明umc1705w1引物為玉米品種“良玉88”的具有親本互補帶型的特異性引物，可以鑒別玉米品種“良玉88”和其父母本雙親，表明umc1705w1引物可以對“良玉88”進(jìn)行品種純度鑒定。

由圖2所示，可以觀察到bnlg1702k1引物擴(kuò)增玉米品種“良玉88”和父母本的PAGE膠電泳圖譜，1～3為父本S122的PCR擴(kuò)展片段，1條較大的譜帶，20～27為母本M54的PCR擴(kuò)展片段，1條較小的譜帶；bnlg1702k1引物擴(kuò)增的父本譜帶和母本譜帶有明顯差異；玉米品種“良玉88”的PCR擴(kuò)展片段，有2條譜帶，1條譜帶與父本相同，1條譜帶與母本相同。結(jié)果表明bnlg1702k1引物為玉米品種“良玉88”的具有親本互補帶型的特異性引物，可以鑒別玉米品種“良玉88”和其父母本雙親，表明bnlg1702k1引物可以對“良玉88”進(jìn)行品種純度鑒定。

3 結(jié)論與討論

本研究利用20對SSR基本引物對玉米品種“良玉88”進(jìn)行篩選，獲得umc1705w1引物和bnlg1702k1引物對玉米品種“良玉88”具有親本互補帶型的特異性，并對其進(jìn)行純度鑒定。在玉米品種制種過程中，由于田間管理不當(dāng)、母本花期去雄不及時、父本砍除不凈等原因，造成玉米雜交種中含有母本和父本籽粒，影響玉米大田產(chǎn)量。通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)對玉米品種進(jìn)行品種純度鑒定，要剔除偏父型和偏母型的引物，既只能區(qū)別父本和雜交種或母本和雜交種的引物，不具有親本互補帶型特征。同時，品種純度鑒定所選的引物還要具有較高的等位基因頻率，這樣有利于異品種的鑒定。本研究不僅為玉米品種遺傳圖譜的建立奠定基礎(chǔ)，同時也為玉米品種基因定位提供參考。