王鈺 王文文 謝深涵 袁夢 丁曉倩 閆喜武 秦艷杰

摘要：在灘涂養(yǎng)殖和運輸過程中，菲律賓蛤仔經(jīng)常處于干露狀態(tài)。筆者研究了蛤仔在干露脅迫和隨后的恢復(fù)過程中酶活力和免疫相關(guān)物質(zhì)含量的變化，初步揭示了灘涂貝類耐干露的生理學(xué)機制。在蛤仔干露12、24、48 h，以及恢復(fù)培養(yǎng)2、6、12、24 h時分別取蛤仔鰓和內(nèi)臟團，測定酶活力及免疫相關(guān)物質(zhì)含量，設(shè)持續(xù)海水養(yǎng)殖的蛤仔為對照組。結(jié)果表明，蛤仔在干露脅迫12 h和24 h時，內(nèi)臟團AKP活力顯著高于對照組（P<0.05）；CAT活性在整個實驗中與對照組差異不顯著（P>0.05），鰓中AKP和CAT活力與對照組差異不大；內(nèi)臟團SOD活力在干露12 h時顯著升高，而鰓中SOD活力在恢復(fù)期顯著升高（P<0.05）；內(nèi)臟團中MDA含量在干露24 h時顯著高于對照組，鰓中MDA含量在干露12 h和24 h時顯著低于對照組；內(nèi)臟團NO含量在恢復(fù)海水后6 h時顯著高于對照組（P<0.05），而鰓在干露48 h時NO含量顯著高于對照組。分析認為，干露過程中，蛤仔呼吸代謝減慢，鰓的生理機能維持平穩(wěn)或受到抑制，代謝和免疫保護作用主要由內(nèi)臟團來完成?；謴?fù)培養(yǎng)時，隨著呼吸作用和血液循環(huán)的恢復(fù)，鰓逐漸承擔(dān)起部分抗氧化功能，使機體迅速恢復(fù)到正常生理狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：灘涂養(yǎng)殖；菲律賓蛤仔；干露；酶活力；免疫指標；MDA；NO

中圖分類號：S917.4文獻標志碼：A論文編號：cjas2020-0157

The Effects of Air Exposure and Recovery on Immune Parameters of Ruditapes philippinarum Wang Yu1， Wang Wenwen1， Xie Shenhan1， Yuan Meng1， Ding Xiaoqian1， Yan Xiwu1，2， Qin Yanjie1，2

（1College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian 116023， Liaoning， China；

2Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding in Liaoning Province， Dalian 116023， Liaoning， China）

Abstract： Manila clam （Ruditapes philippinarum） is often exposed in air during the cultivation and transportation. In order to detect the physiological features of clams suffered from air exposure， we studied the changes of enzyme activities and immunity substances during air exposure and recovery stages. The gills and visceral masses were sampled at 12 h， 24 h and 48 h after air exposure and at 2 h， 6 h， 12 h and 24 h after recovery in sea water. The enzyme vitalities and the important immune related substances were tested by the kits， and the clams cultured in sea water all along were considered as controls. The AKP activities of the visceral mass in air exposed clams for 12 h and 24 h were significantly higher than those in control （P<0.05）. CAT activities in visceral mass were not different from those of controls. AKP and CAT values in gills were relatively stable during the whole experiment. SOD values were significant higher in visceral mass at 12 h of air exposure， and in gills during recovery for 2 h. MDA levels were significantly higher in visceral mass at 24 h of air exposure， and lower in gills during recovery for 12 h and 24 h than those in controls. NO showed the maximum value at 6 h after recovery in visceral mass and at 48 h of air exposure in gill. According to the results， it is concluded that the antioxidation and immunization are exercised mainly by visceral mass during air exposure. And during recovery process， along with the recovery of respiration and circulation， the gill exercises the antioxidation to some extent， and then the clams quickly return to the normal physiological level. Keywords： Mudflat Aquaculture； Ruditapes philippinarum； Air Exposure； Enzyme Activity； Immunity Index； MDA； NO

0引言

近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，灘涂資源合理的開發(fā)利用逐漸受到重視。中國淺海灘涂分布廣泛，總面積約220萬hm2，灘涂開發(fā)以養(yǎng)殖業(yè)為主[1]。在自然條件下，受潮汐、自然遷徙或運輸?shù)纫蛩赜绊?，潮間帶生物經(jīng)常會處于干露狀態(tài)。研究潮間帶生物耐干露的能力，以及干露過程中的生理生態(tài)學(xué)變化，有助于揭示潮間帶生物獨特的生理學(xué)特征。貝類是潮間帶生物的主要群體。一般貝類離水后，能在一個相當長的時間內(nèi)維持生命力，這種離水后能維持生命活動的時間，稱為“露空時間”[2]。露空時間越長則水生動物的干露耐受能力越強，但過長時間的干露會打破動物體細胞內(nèi)外的水分平衡，動物因不能再從周圍環(huán)境中獲得足夠的氧氣而窒息死亡[3]。貝類的露空時間與種類、大小有關(guān)，相同種類，成貝比稚貝更耐干露[4]。近年來，有關(guān)水生生物尤其是稚貝，在干露條件下生長和存活的報道較多[5]。貝類的先天性免疫防御主要包括體液免疫和細胞免疫2個方面[6]。在貝類的細胞免疫程中，血細胞會通過吞噬作用和水解酶與抗氧化酶的釋放來抵擋異物入侵[7]。而血細胞分泌的凝集素、溶血素、抗菌肽、非特異性免疫相關(guān)酶系及各種行使調(diào)控作用的蛋白因子作為體液免疫在機體中起到重要作用[8]。現(xiàn)有研究表明，貝類體內(nèi)免疫相關(guān)活性的溶酶體酶含量會在受到異物刺激后產(chǎn)生顯著變化[9]。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase， AKP）是溶酶體重要組成部分[10]，存在于貝類的血細胞和血清中，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]。血細胞在吞噬異物的過程中會發(fā)生呼吸爆發(fā)（Respiratory burst），即大量活性氧（Reactive oxygen species， ROS），如超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）羥（基）氫氧基和硝酸鹽超氧化物陰離子（Peroxynitrite anions）產(chǎn)生的過程[12-13]。氧自由基會在發(fā)生免疫作用的同時削弱血細胞活性，而貝類產(chǎn)生的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）、過氧化氫酶（Catalase， CAT）、一氧化氮（Nitric Oxide， NO）組成的抗氧化體系可以減輕ROS對機體的毒害作用[14]。很多研究已經(jīng)證實CAT、SOD和NO除了具有清除氧化自由基的作用外，還參與貝類的免疫反應(yīng)[15-17]。

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）隸屬于軟體動物雙殼綱、簾蛤目，于中國南北海區(qū)廣泛分布[18]。在菲律賓蛤仔的養(yǎng)殖和運輸過程中經(jīng)常會處于干露狀態(tài)中。本實驗在干露及復(fù)養(yǎng)條件下對菲律賓蛤仔鰓和內(nèi)臟團中AKP、SOD、CAT酶活力以及丙二醛（malonic dialdehyde， MDA）、NO含量的變化進行分析，以期揭示菲律賓蛤仔應(yīng)對干露脅迫的生理學(xué)適應(yīng)機制。

1實驗材料與方法

1.1實驗材料

實驗所用菲律賓蛤仔殼長（2.8±0.1） cm，殼寬（1.8±0.1） cm，殼高（1.0±0.1） cm。蛤仔養(yǎng)殖實驗在大連海洋大學(xué)遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心50 L水槽內(nèi)進行。實驗前將蛤仔于15～16℃條件下暫養(yǎng)7天，暫養(yǎng)期間，每天投喂螺旋藻粉一次，持續(xù)通氣，并及時挑出死亡個體。待死亡率穩(wěn)定并接近于0時開始實驗。

1.2實驗方法

1.2.1干露實驗實驗組蛤仔從海水中撈出，擦干水分，置于19 L電子制冷冰箱中進行干露實驗，溫度設(shè)置為15℃[實測溫度為（15.4±0.8）℃]。干露48 h后，將所有蛤仔重新投入15～16℃自然海水中進行復(fù)養(yǎng)。對照組蛤仔一直放于50 L水槽中海水養(yǎng)殖，溫度為15～ 16℃。對照組和實驗組蛤仔起始數(shù)量均為100只，實驗平行進行3次。整個實驗期間不投餌。

1.2.2取樣及酶活力指標測定干露實驗組分別在干露12 h（A12h）、24 h（A24h）和48 h（A48h），以及放入海水中2 h（W2h）、6 h（W6h）、12 h（W12h）和24 h（W24h）取樣，每次每個平行組取9只蛤仔樣品，用解剖刀剖開蛤仔雙殼后在冰盤上迅速解剖，分別剪取內(nèi)臟團和鰓組織，每3只蛤仔各組織分別混合，稱量組織塊質(zhì)量，加入9倍體積的0.9%生理鹽水，用組織研磨器低溫下研磨。低溫高速離心機4℃2500 r/min，離心10 min取上清液測定AKP活力、NO及MDA的含量。取上清液用生理鹽水按1：9稀釋成10%組織勻漿，用來檢測蛋白濃度。取上清液用生理鹽水按1：1稀釋成50%組織勻漿，用來測定組織中CAT和SOD酶活力。AKP、CAT、SOD酶活力、MDA及NO的含量均采用南京建成生物工程有限公司試劑盒進行測定，按照說明書操作。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果均為各個平行實驗樣本的平均值。采用SPSS 16.0軟件進行方差分析和多重比較，以P< 0.05為差異顯著水平。

2結(jié)果

2.1實驗過程中蛤仔AKP活力的變化

干露實驗過程中蛤仔AKP活力的變化如圖1所示，對照組AKP活力基本保持穩(wěn)定，平均值為30.17 U/mg。內(nèi)臟團實驗組在干露過程中AKP活力高于對照組，在干露12 h和24 h時與對照組差異顯著（P<0.05），復(fù)養(yǎng)后活力降低趨于平穩(wěn)。鰓實驗組AKP活力基本保持穩(wěn)定，與對照組差異不顯著（P>0.05）。整個實驗期間，蛤仔內(nèi)臟團中AKP酶活力顯著高于鰓中AKP酶活力（P<0.05）。

2.2實驗過程中蛤仔抗氧化酶活力的變化

實驗過程中蛤仔鰓和內(nèi)臟團中CAT酶活力相差不大（圖2），干露24 h及恢復(fù)2 h時，實驗組蛤仔內(nèi)臟團中CAT酶活力出現(xiàn)短暫升高[分別是（84.26±2.39） U/mg和（90.53±10.78） U/mg]，但與對照組差異不顯著（P> 0.05），其余時間內(nèi)CAT酶活力均與對照組持平。與對照組相比，實驗組蛤仔鰓中CAT活力在整個實驗過程中有降低的趨勢，但與對照組差異不顯著（P>0.05）。

實驗過程中蛤仔鰓和內(nèi)臟團中SOD酶活力相差不大（圖3），干露過程中蛤仔內(nèi)臟團SOD活力高于對照組，在干露24 h時最高[（74.64±15.71） U/mg， P< 0.05]。恢復(fù)期與對照組差異不顯著。干露期蛤仔鰓中SOD酶活力與對照組持平，恢復(fù)期2 h時顯著高于對照組（P<0.05），之后恢復(fù)對照組水平。

2.3干露實驗過程中蛤仔MDA和NO含量的變化

實驗過程中蛤仔鰓和內(nèi)臟團中MDA含量相差不大（圖4）。干露12 h和24 h時，蛤仔內(nèi)臟團中MDA含量顯著高于對照組[分別是（15.40±0.79）μmol/mg和（18.10±1.31）μmol/mg，P<0.05]，而鰓中MDA含量則顯著低于對照組[分別是（7.98±1.37）μmol/mg和（8.47±0.92）μmol/mg，P<0.05]，干露48 h及恢復(fù)期內(nèi)，鰓和內(nèi)臟團中MDA含量均與對照組差異不顯著（P>0.05）。

實驗過程中蛤仔鰓和內(nèi)臟團中NO含量相差不大（圖5）。整個實驗過程中，對照組NO含量基本保持穩(wěn)定。實驗組蛤仔內(nèi)臟團NO含量在干露時保持穩(wěn)定，與對照組無顯著差異，在恢復(fù)期先升高后降低，在復(fù)養(yǎng)6 h時達到最大值[（6.20±0.93）μmol/mg]，與對照組差異顯著（P<0.05）。實驗組蛤仔鰓NO含量在干露狀態(tài)下普遍高于對照組，且在干露48 h時達到最大值[（4.44±0.80）μmol/mg]，與對照組差異顯著（P<0.05），恢復(fù)期逐漸恢復(fù)至對照組水平。3討論

3.1干露對蛤仔堿性磷酸酶活力的影響

AKP是貝類免疫中較為重要的水解酶，直接參與體內(nèi)磷酸基團的代謝和轉(zhuǎn)移，與營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收相關(guān)[19- 21]。從本次實驗研究的結(jié)果來看，內(nèi)臟團的AKP活力高于鰓，說明內(nèi)臟團是免疫、代謝和營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所[11]。有研究表明，海洋生物在缺氧脅迫下，糖酵解是主要功能反應(yīng)，而與魚類、甲殼動物不同的是，貝類還會發(fā)生糖酵解的異化反應(yīng)[28]。因此，研究認為，貝類耐低氧能力較強[29-30]。干露期間蛤仔處于缺氧狀態(tài)，主要通過糖酵解作用來供應(yīng)能量，而AKP對糖酵解有重要作用[22]。實驗組內(nèi)臟團AKP酶活性在干露期A12h和A24h時顯著高與對照組（P< 0.05），推測是干露脅迫激活了蛤仔免疫系統(tǒng)，使得AKP活性增強，以應(yīng)對干露期間的能量供應(yīng)；恢復(fù)期AKP酶活性降低并恢復(fù)平穩(wěn)，這可能是因為解除干露脅迫后蛤仔機體代謝恢復(fù)正常，能量供應(yīng)恢復(fù)，使得AKP活性降低。這與關(guān)于三疣梭子蟹的研究結(jié)果不同[23]，可能是蛤仔長期生活于灘涂的特殊環(huán)境中，適應(yīng)干露所產(chǎn)生的獨特生理特征。

3.2干露對蛤仔抗氧化酶活力的影響

從本次實驗研究的結(jié)果來看，對照組蛤仔內(nèi)臟團和鰓的SOD和CAT酶活力相當，說明鰓和內(nèi)臟團在抗氧化過程中都起到重要作用。其中內(nèi)臟團的CAT和SOD酶活力在蛤仔干露過程中有上升的趨勢，其中SOD酶活力達到顯著水平，恢復(fù)初期（2 h）也有小幅上升。段海寶[14]關(guān)于青蛤的研究結(jié)果也表明干露脅迫下抗氧化酶活力先上升后下降，與本文的研究結(jié)果相似，但與三疣梭子蟹的耐干露研究結(jié)果[24]相反，可能是由于青蛤、蛤仔均屬于雙殼灘涂貝類，且耐干露能力都比較強，且與甲殼類耐干露的生理機理不同造成的。本研究發(fā)現(xiàn)干露過程中蛤仔鰓中2種酶活力在干露過程中沒有顯著變化，分析認為干露過程中鰓無法進行呼吸代謝，主要的抗氧化作用由內(nèi)臟團來完成。而在恢復(fù)期間，鰓中SOD酶活力出現(xiàn)顯著升高的過程，推測蛤仔重新入水，呼吸代謝異常旺盛，從而使鰓承擔(dān)了清除氧自由基的主要作用。

3.3干露對蛤仔MDA和NO含量的影響

MDA是由機體脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的最終產(chǎn)物，其含量的變化能反映細胞膜氧化損傷的程度，是評價細胞膜氧化損傷的一種指標[25-26]。實驗組蛤仔在干露12 h和24 h時，蛤仔內(nèi)臟團中MDA含量顯著高于對照組（P<0.05），說明蛤仔內(nèi)臟團細胞膜氧化損傷程度升高這種現(xiàn)象在黑足鮑干露過程中也有報道[27]。相對來講，蛤仔內(nèi)臟團中脂質(zhì)成分較多，推測是由于干露脅迫使蛤仔內(nèi)臟團無氧呼吸代謝加強，生成大量的負氧離子破壞了細胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞質(zhì)膜受損。而鰓中MDA含量則顯著低于對照組（P<0.05），鰓內(nèi)細胞的細胞質(zhì)膜損傷程度降低，側(cè)面說明了干露時蛤仔鰓的代謝維持較低水平以保護機體。干露48 h及恢復(fù)期內(nèi)，鰓和內(nèi)臟團中MDA含量均與對照組差異不顯著（P> 0.05），說明蛤仔代謝逐漸恢復(fù)正常水平。

NO是鏈式阻斷劑，一類存在于生物各組織的極不穩(wěn)定的生物自由基，具有抑制脂質(zhì)過氧化和清除自由基的作用，在生理條件下，結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶合成適量的一氧化氮。與體內(nèi)的氧自由基結(jié)合，生成強氧化基，對機體起保護作用[23]。整個實驗過程中，對照組NO含量基本保持穩(wěn)定。實驗組蛤仔內(nèi)臟團NO含量在干露時保持穩(wěn)定，與對照組無顯著差異，結(jié)合之前MDA的實驗結(jié)果，推測是干露時內(nèi)臟團內(nèi)的氧自由基增多，機體為保護自身，產(chǎn)生了過量的NO與之結(jié)合，使得所測得的NO含量保持不變造成的。NO在恢復(fù)期先升高后降低，在復(fù)養(yǎng)6 h時達到最大值，與對照組差異顯著（P<0.05），說明在恢復(fù)期氧自由基迅速減少，過量的NO還未調(diào)節(jié)到正常水平，所以在復(fù)養(yǎng)6 h時升高到最大值，隨后恢復(fù)正常。實驗組蛤仔鰓NO含量在干露狀態(tài)下普遍高于對照組，且在干露48 h時達到最大值，與對照組差異顯著（P<0.05），推測是干露脅迫后鰓內(nèi)也釋放了大量的NO，而代謝產(chǎn)生的氧自由基含量少，所以未與氧自由基結(jié)合，使得所測的NO含量較高?；謴?fù)期鰓的代謝恢復(fù)正常，含有的NO水平恢復(fù)正常至對照組水平。

4結(jié)論

通過干露及恢復(fù)海水培養(yǎng)實驗，發(fā)現(xiàn)蛤仔干露過程中，鰓組織中各種酶活力和MDA保持平穩(wěn)或受到抑制，主要是由于其呼吸作用適應(yīng)性減慢造成的，此時蛤仔免疫和抗氧化作用主要由內(nèi)臟團來完成。而恢復(fù)海水培養(yǎng)過程中，隨著呼吸作用和血液循環(huán)的恢復(fù)，鰓逐漸承擔(dān)起部分抗氧化功能，從而使機體迅速恢復(fù)到正常生理狀態(tài)。從NO含量的變化也可以推測，蛤仔鰓和內(nèi)臟團2種組織在干露和恢復(fù)培養(yǎng)過程中發(fā)揮作用存在明顯差異。

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