侯麗，王國偉，孫曉霞，高冉冉

山東省醫(yī)療器械產品質量檢驗中心; 國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評價重點實驗室；國家藥品監(jiān)督管理局藥品包裝材料質量控制重點實驗室；山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室，濟南市，250101

0 引言

免疫原即醫(yī)療器械中所含有的，可以刺激機體發(fā)生免疫應答的異源性物質。對于醫(yī)療器械而言，聚合材料、陶瓷制品及金屬材料可能具有的溶出物、磨損或可降解部分能夠與宿主蛋白結合。生物源性的材料，如膠原、天然乳膠蛋白、白蛋白和動物組織等都可以刺激機體發(fā)生免疫應答[1]。目前，評價醫(yī)療器械免疫毒性主要依據GB/T 16886.20—2015[2]，該標準為醫(yī)療器械免疫毒理學試驗提供了指南。目前，鑒于生物科學新方法新技術的研究更加深入，評價醫(yī)療器械免疫學毒理學試驗方法也不斷涌現。

流式液相多重蛋白定量技術（CBA）是基于熒光微球技術與“雙抗體夾心”液相檢測技術的結合，特異性捕獲樣品中或標準品中的目的蛋白，捕獲微球、目的蛋白與加入的檢測抗體形成雙抗體夾心的“三明治”結構復合物，利用流式細胞儀對該復合物的熒光強度進行檢測，從而實現多種可溶性蛋白同時定量檢測。

本研究為充分評價CBA技術，以臨床常見的動物源醫(yī)療器械作為研究對象，對生物醫(yī)用材料產品體液免疫評價中的免疫球蛋白進行檢測，為深入研究CBA技術在醫(yī)療器械免疫毒理學提供了研究數據。

1 材料

1.1 試劑

磷酸鹽緩沖液(PBS)、牛血清白蛋白(BSA)、完全弗氏佐劑(CFA)、LENGENDplexTMMulti-Analyte Flow Assay Kit(Cat No.740493)。

1.2 器具和儀器設備

流式細胞儀、生物安全柜、離心機、電動渦旋儀、搖床等。

1.3 試驗動物

Balb/C小鼠，6～8周齡，共50只，雌雄各半。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2 試驗方法

2.1 實驗組

將受試樣品（牛源異種脫細胞真皮基質）植入小鼠，設高、中、低劑量組，植入劑量分別為3.28、1.64、0.82 cm2產品/只小鼠。

2.2 植入方式

戊巴比妥鈉（55 mg/kg）腹腔麻醉小鼠，在其背部脊柱兩側剃毛，面積約2 cm×2 cm，碘伏消毒，用眼科剪剪約5 mm直徑切口，用眼科鑷在皮膚切口部位制備皮下囊，將被測樣品植入囊內并縫合。植入周期為28 d。

2.3 對照組

陰性對照組：除不用受試樣品進行處理以外，與實驗組的實驗動物進行相同的操作和處理方式。

陽性對照組：采用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為陽性對照。免疫前，取3 mg BSA和9 mL PBS（pH=7.4）制成混合溶液。充分混勻后，取3 mL混合溶液與3 mL弗氏完全佐劑等體積混合。取0.12 mL混懸液注射到小鼠皮下，從試驗第一天開始，每周免疫一次，免疫3次，于免疫后第2周對陽性對照動物進行評價。

2.4 血清制備

試驗第1天時，將試驗樣品植入BALB/C小鼠背部皮下（記為植入第1天），在植入第29天時采取小鼠摘眼球取血法，收集外周血至1.5 mLEP管中，4 ℃靜置30 min后，2 000 g離心20 min，收集上層血清。

2.5 試劑及準備

試驗前將所需beads超聲1 min，渦旋30 s。將20×Wash Buffer靜置恢復室溫后，混勻使其中鹽分充分溶解。用去離子水將其配制成1×Wash Buffer。用250 μL Assay Buffer溶解Standard Cocktail，充分混勻后靜置10 min，然后轉入EP管中，標記為C7。取7個EP管，分別加入75 μL Assay Buffer，4倍倍比稀釋。從C7中取25 μL進行梯度稀釋，直到稀釋到C1為止，C0為Assay Buffer(0 pg/mL)。取血清血漿樣本，試驗前需要用Assay Buffer進行稀釋，稀釋50 000倍。

2.6 試驗過程

所有樣品孔/標準孔中加25μL Assay Buffer，取25 μL稀釋好的標準品/樣品分別加入對應的孔中；試驗前渦旋beads 1 min，渦旋后每孔加入25 μL beads。避光，室溫300 r/min震蕩孵育2 h；孵育結束后，300 g離心5 min，棄上清；每孔加入200 μL Wash Buffer保持1 min，離心棄上清；每孔加入25 μL的檢測抗體，避光，室溫300 r/min震蕩孵育1 h；孵育結束后，直接向每孔中加入25 μL的SA-PE，避光，室溫300 r/min震蕩孵育30 min；每孔中加入150 μL 1×Wash Buffer，重懸beads準備上機檢測。在流式細胞儀上開啟流式細胞儀分析軟件獲取數據。將獲取的數據在LEGENDplexTM軟件上進行分析，根據已知濃度的標準品的平均熒光強度（MIF）制作標準曲線，依據樣本的平均熒光強度（MIF）計算出樣本的可溶性蛋白濃度。

2.7 統(tǒng)計學分析

所有實驗結果都以平均值±標準差的形式展示，采用Student's t(等方差，單尾) 進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05 時認為兩組之間具有顯著性差異。

3 實驗結果

3.1 繪制標準曲線

以標準品濃度做為橫坐標，平均熒光強度（MFI）為縱坐標，通過五參數擬合模型繪制出標準曲線。曲線R2值均大于0.99（如圖1～6所示）。

圖1 IgG1標準品繪制標準曲線Fig.1 The standard curve of IgG1

圖2 IgG2a標準品繪制標準曲線Fig.2 The standard curve of IgG2a

圖3 IgG2b標準品繪制標準曲線Fig.3 The standard curve of IgG2b

圖4 IgG3標準品繪制標準曲線Fig.4 The standard curve of IgG3

圖5 IgA標準品繪制標準曲線Fig.5 The standard curve of IgA

圖6 IgM標準品繪制標準曲線Fig.6 The standard curve of IgM

3.2 各實驗組免疫球蛋白含量

應用流式液相多重蛋白定量技術對實驗各劑量組以及對照組小鼠血清中IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM的含量進行同時測定。與陰性對照組相比，陽性對照組中IgG3、IgA含量未見明顯差異，而IgG1、IgM、IgG2b含量顯著性高于陰性對照組(P＜0.01)，表明本試驗系統(tǒng)運行正常。被測樣品植入低、中、高劑量組IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM含量沒有明顯變化(P＞0.05)。各實驗組中血清免疫球蛋白濃度數據見表1。

4 討論

隨著生物醫(yī)用材料的不斷發(fā)展與應用，人們對醫(yī)療器械的安全性和有效性提出了更高的要求。其中，醫(yī)療器械或生物材料與機體免疫系統(tǒng)的相互作用也日益受到關注。若醫(yī)療器械所含材料的化學特性提示有免疫毒性的數據或任何化學物具有不可知的潛在免疫毒性時，都應考慮進行免疫毒性試驗[2]。特別對動物源性醫(yī)療器械評價時，需進行免疫原性方面的安全風險分析。目前，雖然GB/T 16886.20給出了進行醫(yī)療器械免疫毒性試驗的指導，但并未給出具體的試驗方法。YY/T 1465.7系列標準已給出了醫(yī)療器械免疫原性評價系列方法供使用方選擇。其中ELISA法測定血清免疫球蛋白和補體成分以及用流式細胞儀測定動物脾臟淋巴細胞亞群等方法已作為標準化方法得到日益廣泛應用[3-4]。但由于通常采用小鼠作為實驗動物模型，獲取的樣本量過少導致不能滿足多個指標的同時觀察，從而進一步造成實驗動物資源浪費。

表1 植入28天后小鼠血清中免疫球蛋白濃度 (±S,μg/mL,n=10)Tab.1 Immunoglobulin concentrations in serum of mice 28 days after implantation

表1 植入28天后小鼠血清中免疫球蛋白濃度 (±S,μg/mL,n=10)Tab.1 Immunoglobulin concentrations in serum of mice 28 days after implantation

CBA技術是基于流式細胞檢測系統(tǒng)，集ELISA和細胞流式技術優(yōu)點為一身的液相蛋白檢測技術可通過對應的微球分別標記有不同強度的熒光，每一種微球分別耦聯(lián)對應目標抗原的捕獲抗體，同時，通過標準品繪制標準曲線，可實現對待測樣本中多種可溶性蛋白的定量檢測,目前在藥物毒理研究的應用已日益廣泛[5]。

與傳統(tǒng)的ELISA檢測相比，流式液相多重蛋白定量技術對樣本量需求小，特別是珍貴樣本獲取困難，利用該技術可大大緩解樣本量的難題；可同時對樣本中多個目標蛋白進行檢測，具有一定的經濟性并且大大減少時間與人力的消耗；檢測靈敏度高檢測范圍更寬。同時，該技術操作步驟簡化,檢測結果的重復性好，并易于標準化。IgM、IgA是評價體液免疫功能的重要指標，IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，其作用大多通過IgG亞型來完成，不同亞型功能不同，由于一種IgG亞型水平的降低可以伴有一種或幾種其他亞型水平的提高，從而使IgG總量水平保持正常，故有必要測定IgG亞型的水平[6]。本研究中，取少量血樣即可應用流式液相蛋白定量技術同時測定小鼠血清中不同類型免疫球蛋白含量，為今后在同組動物中測量不同時期血液指標變化趨勢提供基礎。牛血清白蛋白（BSA）是對生物醫(yī)用材料產品體液免疫評價時一種常用的陽性對照物[7]，本實驗中陽性對照組IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM含量顯著高于陰性對照組，說明通過CBA技術可以檢測出在適宜的免疫刺激下的免疫球蛋白指標的變化。綜上所述，本方法可以替代ELISA法測定生物醫(yī)用材料產品體液免疫評價中免疫球蛋白含量。