曹 靜，何 苗，羅 頌，劉 輝(湖南省兒童醫(yī)院藥學(xué)部，長沙 410007)

慶大霉素(GM)是臨床治療革蘭氏陰性菌的常用藥物[1]，在腎臟中呈高濃度分布與代謝，可導(dǎo)致不同程度的腎損傷，約10%～25%的GM使用者會發(fā)生腎毒性，部分患者會出現(xiàn)急性腎衰竭(AKI)[2]。GM誘導(dǎo)的AKI機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與壞死、自噬等途徑均參與了其誘導(dǎo)急性腎損傷的發(fā)生過程[3]，其中氧化應(yīng)激通路的激活在調(diào)控炎癥和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)中發(fā)揮作用[4]。銜接蛋白p66shc是調(diào)控氧化應(yīng)激和生命周期的關(guān)鍵蛋白，主要存在于線粒體膜間隙中[5]。調(diào)節(jié)p66shc介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能成為治療GM誘導(dǎo)AKI的關(guān)鍵，對探尋、預(yù)防與治療AKI的藥物具有重要意義。

鼠尾草酸(CA)是酚型二萜類化合物，是迷迭香中的主要活性成分，具有抗氧化、抑菌、抗癌、神經(jīng)保護(hù)和抗炎等多種藥理活性[6-7]。鼠尾草酸可通過激活核因子E2相關(guān)因子2 (Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)以及抑制核因子-κB(NF-κB)通路改善糖尿病腎病的進(jìn)展[8]，可通過抑制蛋白激酶B/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亞單位4 (AKT/Nox4)通路減輕單側(cè)輸尿管梗阻引起的腎臟纖維化[9]。本文研究了鼠尾草酸對GM誘導(dǎo)的AKI的保護(hù)作用，為鼠尾草酸的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1儀器 Western Blot儀(美國Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)；全自動(dòng)生化儀(武漢精誠偉業(yè)醫(yī)療設(shè)備有限公司)；RM-2135型石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；勻漿機(jī)(沃信儀器制造有限公司)。

1.2試藥 鼠尾草酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；p-p66shc抗體，NOVOUS公司；RIPA裂解液，BCA法蛋白定量試劑盒，丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、超氧化物歧化酶(SOD)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)測定試劑盒，均購自碧云天生物技術(shù)公司；β-actin抗體，p66shc抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗兔二抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)和腫瘤壞死因子α(TNF-α) Elisa試劑盒，均購自博士德生物公司；腎損傷分子1(KIM-1)抗體，購自Abcam公司；腎衰寧片，德元堂制藥集團(tuán)；羧甲基纖維素鈉(CMCNa)，北京索萊寶科技有限公司。

1.3動(dòng)物 雄性SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量為220～250 g(湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度為19～25 ℃，相對濕度為40%～70%，光照交替12 h。大鼠自由飲食，適用性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1動(dòng)物分組及處理 將SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、陽性對照組(腎衰寧0.93 g·kg-1)以及鼠尾草酸低、中、高劑量組(50，100，200 mg·kg-1)。鼠尾草酸劑量參考已有文獻(xiàn)[10]，根據(jù)動(dòng)物種屬間等效劑量體表面積的折算表，大鼠臨床等效劑量=成人藥量×0.018×5，成人給予腎衰寧的最大劑量為10.32 g·d-1，因此大鼠腎衰寧的給藥劑量為0.93 g·kg-1。造模前12 h禁食、自由飲水，除對照組外，其他各組大鼠連續(xù)7 d腹腔注射GM(140 mg·kg-1·d-1)。鼠尾草酸用5 g·L-1CMCNa混懸，給藥組大鼠均于造模第1天開始灌胃給藥，對照組和模型組灌胃相應(yīng)體積的CMCNa，連續(xù)給藥7 d。收集各組大鼠24 h尿液后，采集血液和腎臟組織，待檢。

2.2血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)測定 采用全自動(dòng)生化儀測定血清中SCr和BUN的水平。

2.3蘇木精-伊紅(HE)染色 腎組織用4 g·mL-1多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎小球形態(tài)學(xué)變化。

2.4免疫組化 石蠟切片脫蠟，2 g·mL-1H2O2清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，檸檬酸鹽修復(fù)液微波修復(fù)，5 g·mL-1山羊血清封閉，滴加一抗KIM-1，4 ℃孵育過夜。次日滴加二抗(辣根過氧化物酶)室溫孵育，DA顯色后用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，封片，顯微鏡觀察。

2.5炎癥指標(biāo)檢測 取適量組織，剪碎后用勻漿機(jī)研磨，4 ℃條件下以12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，采用Elisa法測定上清液中MCP-1和TNF-α的含量。

2.6氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定腎臟組織提取液中SOD和iNOS的酶活力以及MDA和H2O2的含量。

2.7Western Blot分析 提取腎臟組織中的總蛋白，用10 g·mL-1SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5 g·mL-1脫脂奶粉封閉1 h后，分別加一抗(p66shc、p-p66shc和β-actin)4 ℃孵育過夜。洗滌后加入二抗，室溫下孵育1 h，ECL發(fā)光液顯影成像。Image J圖像分析系統(tǒng)對光密度進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1鼠尾草酸對GM誘導(dǎo)AKI的影響 與對照組比較，模型組大鼠SCr和BUN水平均明顯升高；與模型組比較，鼠尾草酸中、高劑量組和陽性對照組均能顯著降低GM致AKI大鼠的SCr和BUN水平，見表1。

表1 鼠尾草酸對GM致AKI腎功能的影響

3.2鼠尾草酸對炎癥指標(biāo)的影響 與對照組相比，模型組大鼠腎臟組織中炎癥因子MCP-1和TNF-α含量均顯著升高；與模型組比較，鼠尾草酸中、高劑量組和陽性對照組均能顯著降低GM誘導(dǎo)AKI大鼠腎臟組織中炎癥因子MCP-1和TNF-α的含量，見表2。

表2 鼠尾草酸對腎臟組織中炎癥因子表達(dá)的影響

3.3鼠尾草酸改善腎臟損傷 見圖1。由圖1可知，HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠囊腔比例增大，腎小管出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常、細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，鼠尾草酸能顯著降低腎損傷大鼠的腎小管和腎小球變性；免疫組化后觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中KIM-1的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，鼠尾草酸中、高劑量組和陽性對照組大鼠腎臟組織中KIM-1的表達(dá)明顯下降。

圖1 鼠尾草酸對腎臟組織的影響(400×)

3.4鼠尾草酸對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中MDA和H2O2的含量以及iNOS的酶活力顯著升高，而SOD的酶活力顯著降低；與模型組比較，鼠尾草酸中、高劑量組和陽性對照組均能顯著降低AKI大鼠腎臟組織中MDA和H2O2的含量以及iNOS的酶活力，同時(shí)升高SOD的酶活力，見表3。

表3 鼠尾草酸對腎臟組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

3.5鼠尾草酸對腎臟p-p66shc含量的影響 與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中p-p66shc含量明顯升高；與模型組比較，鼠尾草酸低、中、高劑量組以及陽性對照組均可顯著降低p-p66shc的含量，見圖2。

圖2 鼠尾草酸對p-p66shc含量的影響

4 討論

AKI是由不同原因(如缺血、藥物和毒素)導(dǎo)致的臨床常見危重疾病，其特征是腎小球?yàn)V過率突然降低、SCr含量增加以及少尿，病理表現(xiàn)為腎小管上皮損傷[11]。約20%的住院患者會發(fā)生AKI，主要并發(fā)癥包括容量超負(fù)荷、電解質(zhì)紊亂以及尿毒癥并發(fā)癥[12]。GM是氨基糖苷類抗菌藥物，臨床使用廣泛，對革蘭陰性菌、腸球菌等感染療效顯著[13-14]。但GM易引發(fā)腎毒性，連續(xù)使用GM 7 d以上的患者易發(fā)生AKI，發(fā)病率約為20%[15]。目前針對急性腎損傷的具體治療以預(yù)防和控制并發(fā)癥的對癥治療為主。因此，尋求AKI預(yù)防或治療的有效藥物具有重要意義。

鼠尾草酸是源于迷迭香的強(qiáng)抗氧化劑，鑒于氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷和死亡。因此，減少病理狀態(tài)下的氧化應(yīng)激水平可有效治愈和減輕由不同原因引起的AKI。已有研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾草酸可通過抑制氧化應(yīng)激，促進(jìn)核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1 (Nrf2/HO-1)信號傳導(dǎo)和削弱TGF-β1/Smad/膠原Ⅳ信號傳導(dǎo)來減輕鎘誘導(dǎo)的腎毒性[16]，鼠尾草酸還可減輕順鉑誘導(dǎo)的大鼠腎臟損傷[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾草酸能夠降低GM致AKI大鼠血液中SCr和BUN的水平，改善腎臟結(jié)構(gòu)損傷，降低KIM-1的表達(dá)，還能降低GM誘導(dǎo)的腎臟炎癥因子的含量。

p66shc是細(xì)胞中控制氧化還原反應(yīng)的重要蛋白，其36位絲氨酸的磷酸化在p66shc活化中是必須的[17]，活化后的p66shc與線粒體電子呼吸鏈相互作用調(diào)控活性氧(ROS)的生產(chǎn)[18]。p66shc與腎臟疾病的發(fā)展密切相關(guān)，大鼠敲除p66shc可降低糖尿病大鼠尿蛋白和腎小球硬化的發(fā)生[19]，系膜細(xì)胞敲減p66shc的表達(dá)可降低高糖誘導(dǎo)ROS水平，減少細(xì)胞凋亡[20]。研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾草酸可降低GM對p-p66shc的活化作用，而對p66shc的表達(dá)無影響；同時(shí)，鼠尾草酸也可降低腎臟組織中氧化應(yīng)激(如H2O2和MDA)的水平，升高SOD的酶活力。結(jié)果表明，鼠尾草酸可通過調(diào)控p66shc的磷酸化調(diào)節(jié)腎臟氧化應(yīng)激的發(fā)生，但其確切機(jī)制需進(jìn)一步研究。

本文研究了鼠尾草酸對GM誘導(dǎo)AKI的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)鼠尾草酸可明顯降低GM誘導(dǎo)的AKI，為進(jìn)一步合理開發(fā)鼠尾草酸在AKI中的作用奠定了基礎(chǔ)。