馬曉乾，葛 君，王 琪，趙紅盈，孫 妍，高 宇，申國濤，于文喜

(1.黑龍江省林業(yè)科學院森林保護研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)屬鞘翅目(Coleoptera)天?？?Cerambycidae)，是一種危害多種闊葉樹的蛀干性害蟲，國內外廣泛分布，主要以幼蟲在樹干內蛀食坑道阻斷輸送養(yǎng)分和水分而導致樹木衰弱和死亡[1-3]。據報道，已有18屬的樹木受到光肩星天牛危害，由于其危害具有隱蔽性強、防治難等特點，給世界林業(yè)造成巨大的經濟損失[3-6]。糖槭(Acersaccharum)又名羽葉槭，原產于加拿大，是我國北方城市的主要綠化樹種之一，光肩星天牛對其危害非常嚴重[7-8]。

從昆蟲和寄主植物間的化學通訊出發(fā)，利用寄主植物和非寄主植物揮發(fā)物研制引誘劑或驅避劑調控昆蟲的嗅覺行為，配置非寄主植物也是控制害蟲的一種途徑，成為森林保護領域研究的熱點和重點[9-13]。近年來，已有研究者探討了光肩星天牛對寄主植物揮發(fā)物的觸角電位(EAG)及行為反應，發(fā)現光肩星天牛感蟲樹種會釋放較多的酯和萜類物質，而抗蟲樹種則釋放較多的醇和醛類物質，S-α-蒎烯、S-β-蒎烯、乙酸己酯、R-α-蒎烯、水芹烯、莰烯等對光肩星天牛有明顯的引誘作用，而羅勒烯、月桂烯、(E)-1-戊烯-3-醇、反-2-己烯醇、trans-香葉基丙酮等對光肩星天牛具有驅避作用[6,14-19]。而有關糖槭揮發(fā)物影響光肩星天牛寄主選擇方面的研究未見報道。利用觸角電生理及嗅覺行為測定是目前常用且比較成熟的確定植物揮發(fā)物對植食性昆蟲寄主選擇影響的有效途徑[20-23]。為此，本研究利用頂空吸附法通過氣相色譜質譜聯用儀(GC-MS)、觸角電位(EAG)及嗅覺行為測定技術，分析鑒定糖槭揮發(fā)物組分，解析糖槭揮發(fā)物對光肩星天牛入侵糖槭過程中產生的觸角電生理及趨性行為影響作用，為光肩星天牛監(jiān)測預警及通過引誘劑干擾等防控技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物和昆蟲

試驗所用光肩星天牛雌、雄成蟲和糖槭樣樹均采自哈爾濱市南崗區(qū)中山路行道綠化帶，該綠化帶主要栽植有10～20年生糖槭，樹高6～10 m，胸徑9～25 cm，研究期間光肩星天牛危害嚴重。將采集的每頭光肩星天牛單獨置于養(yǎng)蟲瓶中饑餓24 h，待用。

1.1.2 植物揮發(fā)物及其配制

糖槭揮發(fā)物組分根據研究中GC-MS實驗分析結果，選取購自阿拉丁公司生產的且含量排在前12的揮發(fā)物[23]，分別為乙酸己酯(純度≥99.5%)、己二酸二異丁酯(純度>99%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(純度99%)、棕櫚酸甲酯(純度99%)、乙酸葉醇酯(純度98%)、丙酸葉醇酯(純度97%)、十四酸(純度≥99.5%)、月桂酸(純度98%)、羅勒烯(純度>99.5%)、角鯊烯(純度≥99.5%)、順-3-己烯醇(純度98%)、2-己基-1-葵醇(純度98%)。根據寄主植物揮發(fā)物含量及同類實驗，將各種標準品溶于液態(tài)石蠟中，將每個標樣初步配制成濃度為2 mol/ L 的溶液，待用。

1.2 試驗測定方法

1.2.1 糖槭揮發(fā)物的采集及分析鑒定

在哈爾濱市中山路行道綠化帶，選擇健康的糖槭進行采樣，采用頂空吸附法將收集有糖槭揮發(fā)物的蘇瑪罐連接到7100 A預濃縮儀上(美國ENTECH公司)，濃縮后的樣品采用氣相色譜/質譜聯用法分析 (gas chromatography/mass spectrum, GC/MS)[24-25]。其色譜柱為DB-5MS，30 m×0.25 mm ×0.25 μm。GC工作條件：升溫程序為40 ℃恒溫3 min，然后以10 ℃/min的速度升溫到250 ℃，最后在250 ℃恒溫5 min，溶劑延遲2 min。MS工作條件：離子源溫度230 ℃，電離方式為E1源，離子能70 eV，質譜掃描范圍為45～450 (m/z)。3次重復，1個空白對照，比對分析離子譜圖獲得揮發(fā)物組分。

1.2.2 EAG測定

參照范麗清等[17]和寧眺等[26]的方法略調整：以液態(tài)石蠟作為空白對照，各揮發(fā)物以液態(tài)石蠟為溶劑分別配制成濃度為2.000 0、0.400 0、0.040 0、0.004 0和0.000 4 mol/L，測試劑量為20 μL。將光肩星天牛成蟲的雌、雄觸角從基部剪下，并將觸角末端的第1節(jié)切除，然后將觸角兩端分別與參考電極和記錄電極上的導電針相連，調整氣味管與觸角間的距離。取 20 μL 待測試樣品溶液滴在濾紙條(1.5 cm × 0.8 cm) 上，立即用鑷子將濾紙條塞進干凈的巴斯德管頂部，然后將樣品管的末端連接到氣體刺激裝置，設定刺激氣流流速為400 mL/min，持續(xù)氣流流速為100 mL/min。待基線平穩(wěn)后給予刺激。每個樣品刺激時間為0.5 s，刺激間隔20 s。每個測試標樣至少重復5 次，記錄EAG反應值。

1.2.3 嗅覺行為反應的生物測定

采用“Y”型嗅覺儀測定光肩星天牛對糖槭揮發(fā)物主要成分的嗅覺行為[6,14,27-28]。各揮發(fā)物以液態(tài)石蠟為溶劑分別配制成濃度為2.000 0、0.400 0、0.040 0、0.004 0和0.000 4 mol/L，選取健康完好且活力較強的光肩星天牛成蟲進行嗅覺行為測定，每次取 1 頭進行行為選擇測定，觀察 3 min，對進入引誘臂和對照臂10 cm 以上且停留超過20 s 的分別記為光肩星天牛對氣味源具有正趨向性和負趨向性，否則記為無反應。同一揮發(fā)物同一濃度對光肩星天牛嗅覺行為影響的測定，記為1組，每測完1組后，清洗干凈并烘干，同時將引誘臂和對照臂互換，以消除實驗環(huán)境對光肩星天牛嗅覺行為產生的影響，每種揮發(fā)物每個濃度測定10頭天牛，重復5次。

引誘率和驅避率計算：引誘率=引誘臂內的總蟲數/測試的總蟲數 ×100%，驅避率=對照臂內的總蟲數/測試的總蟲數 ×100%。

1.3 數據處理

試驗所得數據采用SPSS 19. 0進行分析，利用單因素方差Duncan多重比較法分別分析雌、雄光肩星天牛成蟲對同種揮發(fā)物不同濃度EAG反應的差異顯著性、同一揮發(fā)物不同濃度及同一濃度下不同揮發(fā)物引誘率的差異顯著性，利用獨立樣本t檢驗分析同種揮發(fā)物在同一濃度下雌、雄光肩星天牛成蟲EAG反應的差異顯著性；用卡方檢驗分析同種揮發(fā)物在同一濃度分別對雌、雄光肩星天成蟲嗅覺行為影響的差異顯著性[29-31]。

2 結果與分析

2.1 糖槭揮發(fā)物的分析與鑒定

通過GC-MS對糖槭枝葉揮發(fā)物的分析和鑒定，共鑒定出7類34種揮發(fā)性化合物(表1)。

表1 糖槭揮發(fā)物組分

經鑒定，酯類17種、烷烴類5種、醇類4種、酸類4種、烯類2種、醛類1種、酮類1種。其中，酯類占61.67%，烯類占12.99%，酸類占5.58%，醇類占5.02%，烷烴類占1.54%，酮類占0.65%，醛類占0.60%，乙酸葉醇酯占比最高，為33.06%。

2.2 光肩星天牛對糖槭12種揮發(fā)物的EAG反應

經測定，光肩星天牛雌、雄成蟲對糖槭的12種5個濃度揮發(fā)物的EAG反應，不僅在不同揮發(fā)物間存在差異，在同種揮發(fā)物不同濃度間也存在差異，見表2。

表2 光肩星天牛雌、雄成蟲對12種糖槭揮發(fā)物的EAG反應及t檢驗

與對照相比較，同種揮發(fā)物不同濃度條件下，光肩星天牛雌成蟲對5個濃度的乙酸己酯、乙酸葉醇酯、丙酸葉醇酯和順-3-己烯醇，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的鄰苯二甲酸二異丁酯和月桂酸，0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的己二酸二異丁酯、棕櫚酸甲酯、2-己基-1-癸醇和羅勒烯，0.400 0和2.000 0 mol/L的十四酸和角鯊烯EAG反應差異顯著(P<0.05，df=29，12種揮發(fā)物對應12個F值依次分別為9 046.72、4 058.39、2 321.24、1 695.25、3 3218.99、1 1981.50、5 068.37、4 461.78、1 0481.90、1 731.38、15 148.18和2 943.85)；雄成蟲對5個濃度的乙酸己酯、乙酸葉醇酯和順-3-己烯醇，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸甲酯、丙酸葉醇酯和角鯊烯，0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的十四酸、月桂酸、羅勒烯和2-己基-1-癸醇，0.400 0和2.000 0 mol/L己二酸二異丁酯EAG反應差異顯著(P<0.05，df=29，12種揮發(fā)物對應12個F值依次分別為：6 749.35、142.80、1 433.28、5 388.02、11 673.01、5 647.97、624.10、491.76、6 537.75、1 317.82、19 466.74和790.99)。雌、雄成蟲對同種揮發(fā)物EAG反應相比較，在相同濃度下，雌成蟲對乙酸己酯、己二酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、乙酸葉醇酯、丙酸葉醇酯、月桂酸和順-3-己烯醇EAG反應均高于雄蟲，且EAG反應與揮發(fā)物濃度呈正相關關系，隨揮發(fā)物濃度的增加，EAG反應愈加明顯；雄成蟲對0.000 4和0.004 0 mol/L的羅勒烯和角鯊烯、0.004 0和0.400 0 mol/L的2-己基-1-癸醇、0.000 4、0.004 0和0.040 0 mol/L的十四酸、0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的棕櫚酸甲酯和0.400 0和2.000 0 mol/L的角鯊烯EAG反應均高于雌蟲，雌、雄成蟲對0.040 0 mol/L和 0.000 4 mol/L的角鯊烯EAG反應值相同，而各揮發(fā)物其余濃度處理的EAG反應均為雄蟲低于雌蟲。

獨立樣本t檢驗發(fā)現，同種揮發(fā)物同一濃度條件下，雌、雄光肩星天牛成蟲EAG反應存在一定的差異(df=8，每種揮發(fā)物5個濃度，12種揮發(fā)物對應60個F值，依次分別為：0.118、0.889、0.057、0.508、1.237、0.257、0.020、2.667、0.227、0.011、2.541、1.419，5.434、0.962、0.411、0.382、0.940、2.909、0.132、0.012、0.008、1.753、0.014、0.158，0.084、0.200、2.400、0.573、7.656、0.400、0.566、0.691、0.159、5.158、0.086、1.455，1.070、4.872、0.364、0.008、0.620、0.311、2.163、0.000、1.185、0.242、0.597、5.333，0.118、1.258、0.117、6.400、1.525、0.311、1.151、2.939、1.455、0.042、7.100、7.692)，雌、雄成蟲對0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸己酯、乙酸葉醇酯和順-3-己烯醇，0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的己二酸二異丁酯、丙酸葉醇酯、月桂酸和2-己基-1-癸醇，0.400 0和2.000 0 mol/L的棕櫚酸甲酯和羅勒烯，0.004 0和2.000 0 mol/L的角鯊烯、0.004 0和0.400 0 mol/L的十四酸、2.000 0 mol/L的鄰苯二甲酸二異丁酯EAG反應差異極顯著(P<0.01)，對0.000 4和0.004 0 mol/L的己二酸二異丁酯、0.000 4 mol/L的乙酸己酯和順-3-己烯醇、0.004 0 mol/L的棕櫚酸甲酯和丙酸葉醇酯、0.040 0和0.400 0 mol/L的鄰苯二甲酸二異丁酯、0.040 0 mol/L和2.000 0 mol/L的十四酸、0.0400 0 mol/L的羅勒烯、0.400 0 mol/L的角鯊烯EAG反應差異顯著(P<0.05)，對0.000 4和0.004 0 mol/L的鄰苯二甲酸二異丁酯、月桂酸、羅勒烯和2-己基-1-癸醇、0.000 4 mol/L和0.040 0 mol/L的棕櫚酸甲酯和角鯊烯、0.000 4 mol/L的乙酸葉醇酯、丙酸葉醇酯和十四酸EAG反應差異不顯著(P>0.05)。

2.3 光肩星天牛對12種槭樹揮發(fā)物的嗅覺行為反應

經測定，光肩星天牛雌、雄成蟲對12種5個濃度糖槭揮發(fā)物的嗅覺行為反應，不僅在同一濃度不同揮發(fā)物間存在一定的差異，而且在同種揮發(fā)物不同濃度間也存在著一定的差異(表3)。

表3 光肩星天牛雌、雄成蟲對12種糖槭揮發(fā)物的嗅覺行為反應

表3(續(xù))

從表3可以看出，就光肩星天牛雌成蟲而言，具有引誘作用的揮發(fā)物7種，具有驅避作用的揮發(fā)物2種，無引誘或驅避作用的揮發(fā)物3種。卡方檢驗(df=4)結果表明，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸葉醇酯和丙酸葉醇酯、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸己酯和順-3-己烯醇、0.400 0和2.000 0 mol/L的己二酸二異丁酯和2-己基-1-葵醇、2.000 0 mol/L的月桂酸均具有較強的引誘作用，引誘率與驅避率相比較差異極顯著(P<0.01)；0.000 4 mol/L的乙酸葉醇酯和丙酸葉醇酯具有一定的引誘作用，引誘率與驅避率相比較差異顯著(P<0.05)；0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的羅勒烯和0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的角鯊烯具有較強的驅避作用，驅避率與引誘率相比較差異極顯著(P<0.01)。具有引誘或驅避作用的同一揮發(fā)物，引誘或驅避作用呈現出隨濃度的增加而增強的現象，具有引誘或驅避作用的同一濃度不同揮發(fā)物也存在一定的差異。

從表3還可以看出，在實驗選取的5個濃度測定范圍內，對光肩星天牛雄蟲具有引誘作用的揮發(fā)物有5種，具有驅避作用的揮發(fā)物有2種，無引誘或無驅避作用的揮發(fā)物有5種。卡方檢驗(df=4)結果表明，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸葉醇酯和丙酸葉醇酯、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸己酯和順-3-己烯醇、、0.400 0和2.000 0 mol/L的2-己基-1-癸醇，均具有較強的引誘作用，引誘率與驅避率相比，差異極顯著(P<0.01)。0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的羅勒烯和0.400 0和2.000 0 mol/L的角鯊烯具有較強的驅避作用，驅避率與引誘率相比較差異極顯著(P<0.01)；0.004 0 mol/L的羅勒烯具有一定的驅避作用，驅避率與引誘率相比較差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

植物揮發(fā)物通常為分子質量為100～200 u的有機化合物，包括烴類、烯類、酯類、醇類、有機酸類、酮類及芳香類化合物等物質，它們按一定的比例形成混合物對植食性昆蟲產生嗅覺刺激，在植食性昆蟲寄主選擇過程中扮演者重要的角色[32-35]。本研究對糖槭揮發(fā)物分析鑒定結果表明，糖槭揮發(fā)物的主要成分與復葉槭、五角槭、華北五角槭及挪威槭揮發(fā)物主要成分具有明顯的差異，復葉槭的主要成分為酯類、醛類、烷烴類和烯類，其中酯類占79.26%、醛類占9.47%、烷烴類占7.41%、烯類占3.2%；五角槭的主要為酯類和醛類，其中酯類占72.1%、醛類占10.15%、醇類占8.45%、烯類占6.55%、烷烴類占2.02%；華北五角槭的主要為酯類、烯類和醇類，其中酯類占62.08%、烯類占12.49%、醛類占11.72%、醇類占11.82%、烷烴類占1.05%；而挪威槭的主要為酯類、醛類和醇類，其中酯類占57.87%、醇類占21.68%、醛類占14.07%、酮類占3.7%、烯類占2.33%。醛類的含量越低，對光肩星天牛的引誘效果更好，醛類含量從小到大的樹種順序為：糖槭<復葉槭<五角楓<華北五角楓<挪威槭[6,14,19]。同時也發(fā)現，這些揮發(fā)物成分及其含量的差異是5種槭樹感蟲及其差異的原因[17]。

觸角是昆蟲的主要嗅覺器官，分布有不同類型的感器，不同類型的感器具有不同的功能，以幫助昆蟲適地適時的完成特定的生物學行為，如棲息地的選擇、寄主識別與定位、求偶、產卵等[36-37]。本研究結果顯示，光肩星天牛雌、雄成蟲對同一揮發(fā)物的EAG和嗅覺行為反應趨勢基本上是一致的，在實驗所設定的濃度范圍內，隨濃度的增加EAG和嗅覺行為反應也更加明顯；但同濃度下雌、雄成蟲間存在一定的差異，這種差異可能跟光肩星天牛雌、雄成蟲觸角上的感器數量及功能類別有關[17,38]。己二酸二異丁酯和月桂酸對光肩星天牛雌成蟲具有引誘作用，對雄成蟲無明顯的趨性作用。在自然界，植物釋放的信息化學物質是多種微濃度的氣味物質的混合物，植物揮發(fā)物對植食性昆蟲的引誘、驅避是多種氣味物質協同作用的結果[17]。這兩種揮發(fā)物是否與環(huán)境中復雜的氣味源一起對雌性光肩星天牛成蟲(有別于雄性光肩星天牛)在寄主植物上的生理功能(如產卵行為等)產生一定的調控作用，還需進一步研究。