王昌祿，劉 彤，李王強，楊明冠，3，路來風，李貞景，郭慶彬

(1.天津科技大學 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.天津科技大學 食品科學與工程學院，天津 300457；3.齊魯工業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 濟南 250353)

黃曲霉(Aspergillusflavus)是農(nóng)作物及其產(chǎn)品的主要污染微生物之一，廣泛存在于花生、玉米、馬鈴薯、棉花中。黃曲霉毒素(aflatoxins，AFT)是黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和真菌毒素，其種類有黃曲霉毒素B1、B2、B2a、M1、M2、寄生曲霉醇B3、BM1、GM1、GM2、P1、Q1等[1]。在相對濕度和溫度較高的熱帶和亞熱帶國家和地區(qū)，黃曲霉及毒素極易對食品和動物飼料造成污染[2]。在田間、儲藏期或運輸過程中黃曲霉毒素污染均可能發(fā)生，一旦農(nóng)產(chǎn)品和飼料受到污染，人類和動物的健康將受到重大威脅，農(nóng)作物將遭受嚴重損失。因此，預防黃曲霉毒素的產(chǎn)生和真菌感染是解決食品安全問題的有效策略。同時，人類還應提高食品安全意識，避免食用受到黃曲霉及毒素污染的食品，企業(yè)也應嚴格按照我國頒布的相關法律、法規(guī)來生產(chǎn)、銷售相關產(chǎn)品。

黃曲霉毒素的產(chǎn)生受相關基因的影響，防止黃曲霉毒素的合成就要抑制黃曲霉毒素基因簇中相關基因的轉錄。常見的黃曲霉毒素產(chǎn)生相關基因有aflR、aflS、flbA、hexB、dmtA和pks，其中，aflR基因可編碼一個轉錄因子，該轉錄因子正向調控結構基因的表達[3-4]。FlbA是控制fadA介導的信號轉導基因，fadA編碼一個heterotrimeric G蛋白的α亞基，可以傳遞促進生長、抑制分生孢子和合成黃曲霉素的信號[5]。另外，黃曲霉毒素生物合成途徑中起重要作用的基因還有estA、norB、ordB、accC、norM[6]。在研究中，為了更好地了解不同物質對黃曲霉毒素產(chǎn)生的影響，可利用qRT-PCR對黃曲霉毒素相關基因表達進行分析，還可以改變?nèi)旧|修飾基因MYST1、MYST2、MYST3、gcn5、hdaA和rpdA的表達模式，從而影響黃曲霉毒素生物合成基因的表達[7]。

在大多數(shù)情況下，采用物理和化學方法防治黃曲霉及毒素污染不僅效率低，還會使加工的食品營養(yǎng)受到損失，有毒化合物的殘留物清除困難，或者產(chǎn)生抗藥性的病原微生物，此外，過量使用化學制劑還會給生態(tài)系統(tǒng)帶來危害。相比較而言，生物手段具有效率高、覆蓋范圍廣、可保證食品安全、維護生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點。因此，利用生物手段防治真菌污染是一種新興的、可持續(xù)的策略。除利用植物源活性物質來減少農(nóng)作物真菌污染外，還可以通過拮抗菌株或其次級代謝產(chǎn)物對病原菌進行生物防治[8]。在分子水平，可利用抗性相關基因標記輔助育種和基因工程技術開發(fā)拮抗黃曲霉菌新品種[9]。另外，利用代謝轉化或吸附劑對黃曲霉毒素進行脫毒也是一種防治方法，還可以利用微生物中的有效成分將黃曲霉毒素降解為毒性較低的物質，使農(nóng)產(chǎn)品的污染降低到最低限度。

目前，在抑制黃曲霉生長及降解黃曲霉毒素領域中，研究熱點多集中在利用生物防治來實現(xiàn)，包括采用植物精油和拮抗微生物，此外，黃曲霉毒素的生物降解亦是目前的研究熱點。

本文對產(chǎn)毒黃曲霉防治及對黃曲霉毒素具有降解作用的微生物種類、拮抗微生物代謝產(chǎn)生的有效成分、對黃曲霉的抑制機制和對黃曲霉毒素的降解情況進行了總結闡述，希望為生物防治黃曲霉及黃曲霉毒素污染提供參考。

1 黃曲霉及黃曲霉毒素的拮抗微生物

微生物是天然產(chǎn)物的重要來源之一，被廣泛用于控制黃曲霉及黃曲霉毒素污染。研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有拮抗黃曲霉及毒素活性，因此，微生物代謝產(chǎn)生的有效成分在生物防治黃曲霉及黃曲霉毒素污染上具有廣闊的應用前景。據(jù)報道，不同微生物及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物已被作為潛在的抑制黃曲霉的活性物質進行研究，包括芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、鏈霉菌、木霉、假單胞菌和一些海洋微生物、非產(chǎn)毒曲霉及其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

1.1 芽孢桿菌

芽孢桿菌對黃曲霉及黃曲霉毒素具有顯著的抑制作用，從土壤中分離出的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對黃曲霉生長有較強的抑制作用，抑制率均在90%以上[10]。萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)發(fā)酵液的上清液中含有一種或幾種次級代謝產(chǎn)物，具有拮抗黃曲霉的作用[11-12]。此外，巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和蕈狀芽孢桿菌(Bacillusmycoides)也具有一定的抗黃曲霉活性[5,13]。

1.2 乳酸菌

乳酸菌作為一種益生菌，常被用來控制真菌毒素的產(chǎn)生，其中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)被廣泛用于控制黃曲霉的生長，有研究表明：從泰國發(fā)酵米粉中分離出的植物乳桿菌K35(LactobacillusplantarumK35)幾乎可以完全抑制黃曲霉的生長[14]。

1.3 酵母菌

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的應用較為廣泛，可分泌酶類等物質對黃曲霉的菌絲生長及黃曲霉毒素的合成產(chǎn)生顯著影響，類似的還有異型畢赤酵母(Pichiaanomala)[7,15-16]。

1.4 鏈霉菌

筆者研究團隊從土壤中分離出的白黃鏈霉菌TD-1(StreptomycesalboflavusTD-1)通過產(chǎn)生揮發(fā)性物質來抑制黃曲霉分生孢子的形成，下調黃曲霉毒素生物合成基因的表達水平，從而直接減少黃曲霉毒素的產(chǎn)生[17-18]。從水稻葉片分離出的陽陵鏈霉菌(Streptomycesyanglinensis)通過影響黃曲霉毒素的合成來達到幾乎完全抑制黃曲霉菌絲生長的目的，具有有效的抗真菌活性[4,19]。

1.5 海洋微生物

海洋微生物也是抗真菌毒素研究領域的關注點之一，存在于海藻中的埃希氏菌(Enterobacterasburiae)、吡咯伯克霍爾德菌(Burkholderiapyrrocinia)和希瓦氏菌(Shewanellasp.)等微生物能對黃曲霉達到完全抑制的效果，研究發(fā)現(xiàn)，其是通過分泌揮發(fā)性物質來發(fā)揮作用[6，20-21]。

1.6 非產(chǎn)毒曲霉

一些非產(chǎn)毒曲霉對黃曲霉生長和黃曲霉毒素積累也有較高的生防效果，如：非產(chǎn)毒黃曲霉(Aspergillusflavus)[22]、非產(chǎn)毒黑曲霉(Aspergillusniger)[23]、非產(chǎn)毒寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)[24]、米曲霉(Aspergillusoryzae)[25]等。另外，已有研究發(fā)現(xiàn)，木霉(Trichodermasp.)、假單胞菌(Pseudomonassp.)等微生物及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也能夠明顯抑制黃曲霉的孢子萌發(fā)和生長[26-27]。

許多微生物對黃曲霉的生長和黃曲霉毒素的合成產(chǎn)生一定影響。芽孢桿菌、乳酸菌、鏈霉菌、酵母菌、非產(chǎn)毒曲霉和一些海洋微生物都能顯著的抑制黃曲霉生長。可以看出，細菌在拮抗黃曲霉方面占有一定優(yōu)勢，但鏈霉菌和海洋微生物對黃曲霉的抑制作用更強，但具體的應用效果還需進行評估。

2 微生物抑制黃曲霉及毒素污染的有效成分

微生物通過產(chǎn)生活性物質來對黃曲霉的生長和黃曲霉毒素的產(chǎn)生發(fā)揮抑制作用，其發(fā)酵液中的活性物質和產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物是一類具有利用價值的天然產(chǎn)物。表1列出了各種微生物產(chǎn)生的活性物質及其對黃曲霉的抑制效果，這些活性物質主要包括多肽、細菌素、小分子有機物、有機酸、抗生素和酶。

表1 微生物代謝產(chǎn)物對黃曲霉及毒素有抑制作用的有效成分

2.1 芽孢桿菌產(chǎn)生的抗生素和蛋白酶

芽孢桿菌被廣泛用于防治黃曲霉及黃曲霉毒素污染，可通過產(chǎn)生抑菌物質來發(fā)揮作用。芽孢桿菌霉素D是芽孢桿菌分泌的常見細菌素，賦予菌株較強的抗黃曲霉能力[11,28]。另外，解淀粉芽孢桿菌UTB2(BacillusamyloliquefaciensUTB2)和枯草芽孢桿菌UTB3(BacillussubtilisUTB3)產(chǎn)生的蛋白酶均對黃曲霉生長有很強的抑制作用，抑制率達90%以上[10]。近年來，在對巨大芽孢桿菌CGMCC7086(BacillusmegateriumCGMCC7086)研究中，新發(fā)現(xiàn)了3種多肽具有抗真菌活性[5]。此外，拮抗蛋白和抗生素也是芽孢桿菌中重要的抗真菌物質[5,12,29]。

2.2 乳酸菌產(chǎn)生的有機酸和多肽

乳酸菌代謝產(chǎn)物中含有一些具有抑菌活性的有機酸，其中乳酸的產(chǎn)量最高，可以完全抑制黃曲霉的生長[14]。其次，苯乳酸、羥基苯乳酸和吲哚乳酸也具有一定的抗真菌活性[30-31]。除有機酸外，植物乳桿菌IS10(LactobacillusplantarumIS10)產(chǎn)生的多肽也是一種對黃曲霉具有較強抑制作用的天然產(chǎn)物[32]。另外，還有從植物乳桿菌AF1(LactobacillusplantarumAF1)中分離出一種分子式為C12H22N2O2的酮類抗真菌化合物[33]。

2.3 酵母菌產(chǎn)生的幾丁質酶

酵母菌常常被用來作為防治黃曲霉及黃曲霉毒素污染的微生物，其中釀酒酵母117(Saccharomycescerevisiae117)應用最為廣泛，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質對黃曲霉有明顯抑制作用[15]。此外，異型畢赤酵母ATCC 34080(PichiaanomalaATCC 34080)產(chǎn)生的幾丁質酶也能夠影響黃曲霉的生長、黃曲霉毒素的產(chǎn)生及其基因表達[16]。

2.4 鏈霉菌產(chǎn)生的小分子有機物

鏈霉菌之所以成為重要的微生物資源，是因為其能產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，如阿伐他汀A[34]和二辛糖苷A[35]等。最近研究發(fā)現(xiàn)，白黃鏈霉菌TD-1(StreptomycesalboflavusTD-1)產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物——二甲基三硫醚和苯胺，能夠完全抑制黃曲霉菌絲生長和孢子萌發(fā)以及黃曲霉毒素的產(chǎn)生[17-18]。從陽陵鏈霉菌3-10(Streptomycesyansingensis3-10)粗提物中分離純化出的反轉霉素A和B在生物防治黃曲霉及其毒素污染方面也發(fā)揮了重要作用[4，36]。此外，2-甲基異莰醇、2-甲基丁酸甲基酯和苯乙醇也幾乎能夠完全抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生[19]。

2.5 其他微生物產(chǎn)生的抑菌活性成分

研究發(fā)現(xiàn)，一些海洋微生物也可以通過分泌揮發(fā)性有機物來完全抑制黃曲霉生長，如：阿氏腸埃希氏菌VT-7(EnterobacterasburiaeVT-7)[6]、吡咯伯克霍爾德菌WY6-5(BurkholderiapyrrociniaWY6-5)[21]和海藻希瓦氏菌.YM8(Shewanellasp.YM8)[20]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉GIM 3.442(TrichodermaharzianumGIM 3.442)具有抑制黃曲霉生長的能力，從中分離的活性物質為重組天冬氨酸蛋白酶[26]。

大多數(shù)拮抗黃曲霉的微生物是通過產(chǎn)生活性物質來發(fā)揮作用，活性物質主要有多肽、細菌素、小分子有機物、有機酸、抗生素和酶等。其中，揮發(fā)性化合物的發(fā)現(xiàn)使防治黃曲霉污染工作的進行更加高效。但活性物質的種類仍有限，其產(chǎn)量也較低，這使得微生物抗真菌活性的應用難以快速發(fā)展。

3 微生物代謝產(chǎn)物對黃曲霉及毒素的抑制機制

微生物具有比表面積小、結構簡單、繁殖速度快、代謝迅速等特點，因此，多種微生物及其代謝產(chǎn)物已被廣泛用于黃曲霉及毒素的防控工作中，主要作用方式如下。

3.1 競爭抑制作用

產(chǎn)毒菌株在感染過程中被非產(chǎn)毒菌株置換而被物理排除，或者非產(chǎn)毒菌株競爭黃曲霉毒素生物合成所需的營養(yǎng)物質[8]。然而，使用非產(chǎn)毒曲霉菌種也有一些風險。由于曲霉菌的遺傳多樣性和遺傳復雜性，非產(chǎn)毒曲霉菌可能會發(fā)生遺傳突變，因此，從長期安全的角度出發(fā)，建議謹慎使用非產(chǎn)毒曲霉菌株[37]。

3.2 拮抗作用

解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶可通過改變黃曲霉細胞的通透性、滲入細胞質、破壞細胞器來影響真菌生長和黃曲霉毒素的產(chǎn)生[10]。類似地，在植物乳桿菌代謝產(chǎn)物中，含量最高的乳酸通過多個靶點對黃曲霉細胞壁和細胞膜造成破壞，從而發(fā)揮對黃曲霉的抑制作用[14]。解淀粉芽孢桿菌B10-6-1(BacillusamyloliquefaciensB10-6-1)產(chǎn)生的脂肽類抗生素以及空氣芽孢桿菌Y-17-3(BacillusaeriusY-17-3)中的拮抗蛋白通過抑制黃曲霉菌孢子萌發(fā)和菌絲生長起到抑菌作用[29,38]。研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉GIM 3.442(TrichodermaharzianumGIM 3.442)和熒光假單胞菌PB27(PseudomonasfluorescensPB27)中的活性物質對黃曲霉的作用機制均為抑制真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)[26-27]。同樣，由萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)分泌的拮抗蛋白也可以通過此方式發(fā)揮抑菌作用，可誘使黃曲霉菌絲發(fā)生變異[12]。一定條件下，還可以通過誘導花生分泌SOD酶、PAL酶、POD酶、PPO酶來抑制CAT酶的分泌，從而增強花生抗逆性[12]。某些微生物代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物具有覆蓋廣、見效快等特點，近年來也常被用來控制真菌病原體。一些鏈霉菌和海洋微生物可產(chǎn)生揮發(fā)性物質，來降低黃曲霉毒素生物合成基因表達，抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，抑菌效果顯著[6，19-21]。異型畢赤酵母ATCC 34080(PichiaanomalaATCC 34080)產(chǎn)生的酶類可以通過寄生和裂解作用使黃曲霉的菌絲受到破壞，另外，酵母菌也可以產(chǎn)生揮發(fā)性物質來抑制真菌產(chǎn)孢，對黃曲霉毒素抑制效果顯著[7, 15-16]。從白黃鏈霉菌TD-1(StreptomycesalboflavusTD-1)中分離出的揮發(fā)性有機物能完全抑制黃曲霉的生長，研究發(fā)現(xiàn)，抑制機制為抑制黃曲霉分生孢子的形成，下調黃曲霉毒素生物合成基因的表達水平，破壞黃曲霉的細胞壁和細胞器[17-18,39-40]。

3.3 吸附和脫毒酶降解作用

大多數(shù)乳酸菌被用作益生菌，通常將其作為去除黃曲霉毒素的理想微生物，其中，已對鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG)的物理吸附作用進行了研究[41]。除物理吸附外，還可以利用微生物中的一些蛋白質或酶將黃曲霉毒素降解成毒性較低的物質。表2列出了各種微生物及其代謝產(chǎn)物對黃曲霉毒素的降解條件、降解產(chǎn)物及降解效果。研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌BL010(BacilluslicheniformisBL010)培養(yǎng)物上清液中的兩種降解酶能有效降解黃曲霉毒素B1，對轉化產(chǎn)物進行了檢測和鑒定，確定其分子式為C12H14O4[42]。類似地，蔬菜芽胞桿菌GX01(BacillusoleroniusGX01)和絨毛芽孢桿菌DY3108(BacillusvelezensisDY3108)對黃曲霉毒素B1的降解能力均與培養(yǎng)物上清液中的胞外蛋白或胞外蛋白酶有關[43-44]。另外，沙氏芽孢桿菌L7(BacillusshackletoniiL7)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、巨大芽孢桿菌(Bacillus.megaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillus.subtilis)均對黃曲霉毒素B1具有較強的降解作用[45-46]。酵母菌在食品中的應用已有多年的歷史，據(jù)報道，假絲酵母CGMCC3790(CandidaversatilisCGMCC3790)降解黃曲霉毒素B1的能力顯著，并且4種降解產(chǎn)物均無毒性，其降解物質可能為胞內(nèi)組分[47]。假單孢菌中的胞內(nèi)酶或胞外酶均能使菌株產(chǎn)生降解黃曲霉毒素B1的能力[48-49]。還有一些大腸桿菌CG1061(EscherichiacoliCG1061)、鐮刀菌WCQ3361(Fusariumsp.WCQ3361)、尿毒桿菌CCTCC M 2015181(CladosporiumuredinicolaCCTCC M 2015181)均能有效地消除黃曲霉毒素B1[50-52]。釀酒酵母RC016(SaccharomycescerevisiaeRC016)，布拉酵母RC009(SaccharomycesboulardiiRC009)和馬氏克魯維菌VM003(KluveromycesmarxianusVM003)除具有降解黃曲霉毒素B1能力外，也對黃曲霉毒素 M1具有降解作用，降解率均在80%以上[53]。

表2 微生物代謝產(chǎn)物對黃曲霉毒素的降解情況

在實際應用中，若培養(yǎng)體系中營養(yǎng)豐富，菌株的降解效果會更好。嗜鹽擬青霉CGMCC 3792(TetragenococcushalophilusCGMCC 3792)中的胞內(nèi)酶通過先吸附后生物降解來消除黃曲霉毒素B1，對醬油渣中黃曲霉毒素B1的降解率達91.99%以上[54]?？莶菅挎邨U菌UTBSP1(BacillussubtilisUTBSP1)產(chǎn)生的胞外酶對開心果中黃曲霉毒素B1的去除率高達95%[55]。

4 結論與展望

食品和糧食中的黃曲霉毒素污染對經(jīng)濟發(fā)展和公共衛(wèi)生安全都造成了嚴重的威脅，因此，需要尋找有效的控制方法。目前，化學防治黃曲霉及其毒素污染仍是主要方法，但真菌的抗藥性、化學藥品殘留和環(huán)境污染等問題嚴重限制了化學防治方法的應用。隨著現(xiàn)代生物技術的迅速發(fā)展，人們逐漸采用更安全、高效、環(huán)保的生物防治方法對霉菌污染進行防控。利用微生物對黃曲霉及毒素污染進行防治是最具有潛力的方法。在現(xiàn)有研究中，分離到對黃曲霉有抑制作用的微生物主要有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、鏈霉菌、木霉、假單胞菌和一些海洋微生物，它們可通過產(chǎn)生活性物質來抑制黃曲霉的生長，活性物質主要包括多肽、細菌素、揮發(fā)性有機物、有機酸、抗生素和酶。抑菌機制主要為非產(chǎn)毒黃曲霉菌對產(chǎn)毒黃曲霉菌的競爭抑制作用、微生物通過產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物來抑制黃曲霉的生長、微生物對黃曲霉毒素的物理吸附和脫毒酶降解。其中，利用微生物產(chǎn)生的蛋白質或酶類物質將黃曲霉毒素降解為毒性較低的物質，成為防治黃曲霉毒素污染的一個重要方法。

篩選對黃曲霉及毒素具有拮抗作用的菌株是防治黃曲霉污染領域中的研究熱點之一。在各種微生物中，鏈霉菌作為一種普遍存在于土壤、植物、空氣中的微生物資源，具有復雜的次級代謝途徑，所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物已廣泛用于基礎醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、生物、化學等領域，其抑菌活性顯著，對黃曲霉及黃曲霉毒素具有顯著的抑制效果，在控制黃曲霉及毒素的研究和應用中具有廣闊的發(fā)展前景，因此，應加強鏈霉菌代謝途徑及其產(chǎn)生的可抑制或降解對黃曲霉及毒素代謝產(chǎn)物的研究，有利于真菌毒素的防控工作。經(jīng)過多年的研究，本團隊從自然界分離的具有自主知識產(chǎn)權的白黃鏈霉菌TD-1及其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對多種絲狀真菌有明顯的抑制作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)，該微生物可產(chǎn)生帕馬霉素，對產(chǎn)毒黃曲霉的抑制活性比較明顯，另外，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質幾乎可以完全抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生。在國家自然科學基金的資助下，目前正積極開展鏈霉菌TD-1拮抗產(chǎn)毒黃曲霉及毒素機制的研究。大量分離微生物中的抗真菌活性物質，深入研究其對黃曲霉及毒素的抑制機制是今后防治真菌毒素污染的重要基礎研究工作。利用生物防治法解決農(nóng)作物和農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉及毒素污染問題，對提高食品安全性具有重要意義。