于浩然黃玉宇陳君敏張帆孫夏雨 賈歡楊軍,5*

1上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（上海 200092）

2上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（上海 200011）

3復旦大學附屬眼耳鼻喉醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（上海 200031）

4上海市耳鼻疾病轉化醫(yī)學重點實驗室（No.14DZ2260300）（上海 200125）

5上海交通大學醫(yī)學院耳科學研究所（上海 200125）

世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計表明，全球約4.66億人患有殘疾程度的聽力損失（聽力較好耳的聽力損失：成人＞40dB/兒童＞30dB）[1]，其中3400萬是兒童。對于重度、極重度耳聾的患者，人工耳蝸已經成為常規(guī)的治療手段。隨著手術方法和科技進步，人工耳蝸植入手術適應癥也在擴大，如術前高頻聽力重度下降但有低頻殘余聽力者也可行耳蝸植入[2]。但由于植入時對內耳造成機械損傷，同時術后炎癥反應、纖維組織增生等因素，既容易造成術后殘余聽力的損失，又影響人工耳蝸植入效果[3]。

糖皮質激素類藥物可以有效抑制炎癥反應和纖維組織形成，但全身應用該類藥物存在明顯副作用和特殊人群禁忌[4]。乙交酯丙交酯共聚物（Poly Lactic-co-Glycolic Acid,PLGA）具有可降解、生物相容性好和安全度高等特點，因此一直被廣泛用作藥物輔料。本研究報道了一種在人工耳蝸植入電極表面以PLGA為載體，利用浸涂法制備高分子載藥涂層的方法，實現(xiàn)局部、定向、持久給藥，并對其材料特性進行描述的同時以豚鼠構建動物模型，探討該載藥電極對殘余聽力的保護作用。

1 研究材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

PLGA（深圳博立生物材料,50:50,Mw=1-3萬）；三氯甲烷（分析純，上海申博化工）；地塞米松磷酸鈉（99%,Sigma,USA）；氯化鈉（分析純，國藥集團）、氯化鎂（分析純，國藥集團）、氯化鉀（分析純，國藥集團）、氯化鈣（分析純，國藥集團）、葡萄糖（分析純，國藥集團）；HEPEs（99%,Amresco,USA）；恒溫干燥箱（上海力辰科技,DZF-6020A）；人工耳蝸植入電極（HiRes 90K 1J,Advanced Bionics）；人工耳蝸調機軟件（Soundwave 3.1,Advanced Bionics）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-4800,HITACHI）；高效液相色譜儀（LC-10ATVP,日本島津）；色譜柱（Hypersil,ODS2,C18,5μm,4.6×200mm）；視頻接觸角測量儀（JY-82B,鼎盛）；戊巴比妥鈉（99%，上海隆盛化工）；碳纖維模擬電極（SDF碳素,東陽上島）；ABR測試儀（RZ6,Tucker-Davis Technologies）；SPSS軟件（Version 18.0）。

1.2 載藥電極的制備

在室溫下，用玻璃皮氏培養(yǎng)皿制備質量分數(shù)為5%的PLGA三氯甲烷溶液。稱取所用載體PLGA總質量10%（可根據(jù)實際所需調整）的地塞米松磷酸鈉（Dexamethasone Sodium Phosphate,DSP）并添加到溶液體系中混勻后即為涂料。手持人工耳蝸植入體將電極浸沒于涂料中1-2秒后緩緩提出。待涂料流平及三氯甲烷揮發(fā)后，形成電極表面完整載藥薄膜。最后再用硅膠刷蘸取少許三氯甲烷、輕輕擦去電極金屬接觸點表面覆蓋的薄膜。

1.3 場發(fā)射掃描電鏡分析

取新電極和載藥電極，分別截取耳蝸內植入段。將截取好的樣本使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Environmental Scanning Electron microscopy,ESEM）分析并拍攝實時圖像。

1.4 電極涂層前后阻抗測量

待測電極浸入人工外淋巴液（每100ml中含NaCl 0.8 g,KCl 0.04 g,CaCl20.02 g，MgCl20.017 g,Glu 0.1 g,HEPES 0.12 g）中形成檢測回路，在相同條件下使用人工耳蝸調機軟件分別測量新電極以及載藥電極的阻抗值。

1.5 電極涂層前后表面水接觸角測量

采用視頻接觸角測量儀測量新電極及載藥電極表面靜態(tài)水接觸角。

1.6 體外釋藥試驗

取5根電極為一組，置于600μl人工外淋巴液中（37℃，搖床），每24小時取樣并換液。采用HPLC法（流動相：三乙胺溶液-甲醇-乙腈55:40:5；波長：242 nm；流速：1 ml/min）測定每個樣品中DSP濃度，繪制載藥電極體外釋藥曲線。

1.7 豚鼠耳蝸模擬電極植入及ABR檢測

取20只豚鼠，隨機分成實驗和對照組各10只。采用耳后切口，暴露聽泡。進入鼓室后在顯微鏡下于耳蝸底回側壁磨開一骨窗。將提前準備好的經低溫等離子消毒的碳纖維模擬電極緩緩插入。實驗組電極表面覆蓋DSP載藥涂層，對照組無涂層。相同方法暴露對側耳蝸，用鉤針將其挑碎破壞。術后分別于1小時，1周，2周，4周，3個月，使用ABR測試儀測試兩組豚鼠ABR閾值。ABR檢測刺激聲采用短純音，頻率為 16kHz、24kHz和32 kHz，每一頻率的刺激聲強從90 dB SPL每隔5 dB SPL下降到20 dB SPL，疊加250次，在大概確定ABR波形消失的范圍后，在該聲強附近重復檢測，疊加1000次以進一步驗證結果，并記錄ABR的閾值。手術和檢測時，豚鼠均在戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)。

1.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件分析體外釋藥數(shù)據(jù)，并對其進行數(shù)學擬合建模。使用t檢驗分析電極涂層前后材料特性參數(shù)。動物實驗中組間ABR閾值差異使用Mann Whitney U test進行檢驗。

2 結果

2.1 載藥薄膜包被前后電極表面形貌

質量分數(shù)為5%的PLGA三氯甲烷溶液表現(xiàn)出理想的成膜粘稠度，成膜后在光鏡和電鏡下均呈現(xiàn)光滑、均一、菲薄的特點（圖1）。電極金屬觸點表面薄膜擦去后有利于維持電極良好的導電性。由ESEM照片可見，載藥薄膜局部放大至1萬倍呈現(xiàn)氣孔結構，考慮由三氯甲烷溶劑揮發(fā)導致，極大增加了釋藥面積和薄膜本身的降解速率。同時，利用高能電子束轟擊載藥涂層局部可形成斷層（圖2），熱效應可能會造成輕微形變，故粗略估計涂層厚度約為1.02±0.05μm，相較于目前常見的300-500μm直徑的植入電極而言幾乎可以忽略。

圖1 光鏡和ESEM下顯微照片。(a-1)光鏡下電極原貌；(b-1)光鏡下電極表面包被DSP-PLGA涂層，其中金屬觸點表面涂層已擦除；(a-2)ESEM下電極原貌；(b-2)ESEM下電極表面包被DSP-PLGA涂層；(a-3)電極原貌在ESEM下經10,000倍放大后；(b-3)DSP-PLGA涂層在ESEM下經10,000倍放大后；(※)電極表面局部涂層被擦除，可見一條自上而下的分界線；Fig.1 Micrographs under light microscope and ESEM:(a-1)Original morphology of electrode array under light microscope;(b-1)Electrode array coated with DSP-PLGA and the coating on metal contacts was wiped off;(a-2)Original morphology of electrode array under ESEM;(b-2)Electrode array coated with DSP-PLGA under ESEM;(a-3)Original morphology of electrode array under ESEM enlarged by 10,000x;(b-3)Electrode array coated with DSP-PLGA under ESEM enlarged by 10,000x;(※)Partial coating on the electrode array was wipped off and a top-down dividing line is visible；

圖2 載藥涂層厚度估算Fig.2 Estimation of Thickness of Drug-loaded Coating:Continuous bombardment with electrons can break the coating and estimate its thickness.

2.2 電極涂層前后阻抗與水接觸角

載藥涂層前后對電極金屬觸點的保護良好，電極16對通道平均阻抗涂層前0.9±0.22 kΩ，涂層后1.0±0.18 kΩ，無統(tǒng)計學差異。植入電極的原有表面靜態(tài)水接觸角由硅膠材質本身決定為102±0.6°，涂層后為77±1.6°。涂層后電極表面靜態(tài)水接觸角明顯減小，提示電極表面親水性提高（圖3）。

圖3 電極涂層前后水接觸角變化a涂層前約102°；b涂層后約77°Fig.3 Change of water contact angle before and after coating:approx.a 102°before coating;b approx.77°after coating

圖4 載藥涂層電極釋藥曲線Fig.4 Drug release profile of drug-loaded coating

2.3 體外釋藥的描述及擬合分析

載藥涂層藥物的累計釋放量（%）與釋藥時間之間的關系，經SPSS軟件擬合函數(shù)為f(t)，相關系數(shù)R2約0.93（圖4），呈現(xiàn)明顯的對數(shù)函數(shù)關系。在第1個24小時涂層釋放藥物量最多，存在突釋現(xiàn)象。當t≥15時，函數(shù)增速放緩趨向穩(wěn)定。即載藥電極藥物完全釋放需要約2周。

2.4 豚鼠耳蝸模擬電極植入后聽力水平變化

實驗組與對照組豚鼠耳蝸模擬電極植入后各個時間點ABR測試結果（16、24、32kHz，均值±標準差）（表1，圖5）顯示，電極植入后1小時兩組豚鼠ABR閾值無明顯差別。從第1周開始實驗組豚鼠ABR閾值均明顯低于對照組，且較術后1小時聽力水平有所提高（P＜0.001），至術后3月，ABR閾值較術后1小時減小了約10 dBnHL。而對照組豚鼠ABR閾值穩(wěn)定并伴有少許增大，術后3月時與術后1小時相比，ABR閾值增大了約5 dBnHL。

表1 豚鼠耳蝸植入模擬電極后ABR閾值（16kHz、24kHz,*P＜0.001）Table 1 ABR threshold of guinea pig implanted with analog electrode（16kHz、24kHz、32kHz,*P＜0.001）

圖5 豚鼠耳蝸植入模擬電極后ABR閾值（16kHz、24kHz、32kHz,*P＜0.001）Fig.5 ABR threshold of guinea pig implanted with analog electrode（16kHz、24kHz、32kHz,*P＜0.001）

3 討論

糖皮質激素是目前唯一被證實對突發(fā)性耳聾有治療作用的藥物[5,6]，故其對耳蝸植入后不良反應的防治研究最多見，但結果不一[7-10]。此外，由于中耳和內耳的特殊解剖結構，很多給藥方式如中耳腔注射、圓窗膜滲透、內耳注射等，均無法持續(xù)、穩(wěn)定地維持內耳藥物濃度。研究人員便著眼于電極本身的改造，以定制含藥硅膠、電極開槽填藥或表面理化處理為三大研究方向[11]，但往往技術難度大、轉化成本高。本研究首次采用浸涂法在電極表面制備載藥薄膜，技術簡單且經濟優(yōu)勢明顯。同時載藥種類、載藥量可以根據(jù)實際需要進行調整，易于實現(xiàn)無菌化操作，在手術過程中即可完成定制化精準醫(yī)療。

藥物載體的選擇上，透明質酸水凝膠研究較多[12,13]，但其成膜性、穩(wěn)定性不可靠。另一明星材料聚乳酸在冠脈支架涂層領域炙手可熱，但其降解時間過長、機械強度過高[14]，不適用于人工耳蝸電極。本研究采用的PLGA是經中美FDA雙認證的藥用輔料，其合成單體為乳酸和羥基乙酸，不同單體配比可以調控其降解速率[15]。而本研究所用PLGA（50:50,Mw=1-3萬），由專業(yè)高分子材料公司合成，設計降解周期為20-30天，覆蓋術后炎癥反應、水腫最活躍時期[16,17]。

在動物實驗中，電極植入段大部分位于耳蝸底回，術后豚鼠ABR閾值以高頻段影響為著。隨著時間推移，實驗組ABR閾值持續(xù)降低且顯著小于對照組。Farhadi等的研究表明，DSP能夠廣泛抑制電極植入后炎癥細胞的趨化，降低炎癥反應強度[18]。Douchement團隊在也發(fā)表了相似研究結果，證實DSP對術后聽力的改善作用[19]，且從長期效果來看，DSP濃度越高獲益越大。

本研究中為了避免PLGA的絕緣性對電極導電性能的影響，擦除了金屬觸點表面薄膜，但也犧牲了一部分的有效藥物載荷與面積。而Alshammary教授報道了一種導電高分子材料聚吡咯，可以在電刺激下調節(jié)細胞的粘附和遷移行為[20]。這尤其適用于人工耳蝸電極工作的微環(huán)境，但目前還沒有相關研究發(fā)表。另外，水接觸角是表征材料表面親水性能的重要參數(shù)。本研究中載藥電極表面水接觸角明顯減小，親水性能的提升有利于抵抗蛋白質的粘附[21]。且Hadler等還證實，高分子材料涂層本身也具有抑制表面纖維組織形成的特點[22]。

藥物緩控釋制劑的釋放曲線一般采用零級、一級或Higuchi方程進行擬合評價。其中，理想的控釋行為應當符合零級動力學方程。國內劉婭等[23]采用定制含藥硅膠和于坤宏等[21]采用化學藥物耦聯(lián)方法，基本實現(xiàn)了這一目標。但釋放速度緩慢且定制化、工藝難度高。在本研究基礎上，未來可以嘗試引入控釋劑如泊洛沙姆或者控釋涂層來優(yōu)化釋藥行為?？傊?，本研究描述了一種全新的浸涂法在人工耳蝸電極表面制備PLGA高分子載藥薄膜的可行性和應用價值，證實了載DSP電極對植入后聽力的保護作用。