馬嘉欣, 連子如*, 何 橙, 王江濤, 于仁成

(1. 山東大學海洋學院, 山東 威海 264209; 2. 中國海洋大學化學化工學院, 山東 青島 266100;3. 中國科學院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室, 山東 青島 266071)

量子點(quantum dots, QDs)是一種新型半導體熒光納米材料,其結構決定了它具有優(yōu)異的光化學穩(wěn)定性、激發(fā)譜寬而發(fā)射譜窄以及較長的熒光壽命等特點[1]。目前研究較多的量子點主要包括鎘系量子點如CdSe、CdS、CdTe,銦系量子點如InGaAs、InP、InAs,硅量子點,碳量子點等,其中碳量子點(carbon dots, CDs)因具有高生物相容性和低細胞毒性而備受關注。量子點材料異于其他熒光材料的優(yōu)異光學特性使其極適合作為熒光探針用于傳感分析,量子點熒光傳感器靈敏度高、易于操作,近年來在環(huán)境監(jiān)測、細胞成像、疾病診斷和治療等領域發(fā)展迅速。然而其存在一個突出的缺陷,即實際樣品基質可能存在一些與目標待測物發(fā)光響應性質相似的物質,導致熒光傳感器的選擇能力降低[2]。為解決這一問題,研究人員將分子印跡技術(molecular imprinting technique, MIT)引入熒光傳感器。分子印跡技術是通過模擬天然分子識別現(xiàn)象,人工合成對模板分子能夠進行特異性和選擇吸附的高分子功能材料即分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)的一種新技術。在早期研究應用中,MIPs通常用于萃取/分離,檢測分析仍需聯(lián)用色譜/質譜等手段,無法實現(xiàn)現(xiàn)場的快速檢測[3]。分子印跡熒光傳感器以MIPs為識別元件、QDs為響應元件,結合了QDs和MIT的優(yōu)勢,具有高選擇性和高靈敏度,是一種易于操作的快速檢測新手段。本文就此介紹了目前基于量子點熒光材料的分子印跡傳感器的3種類型,并綜述了近5年來該檢測技術的最新研究應用結果。

1 量子點基分子印跡熒光傳感器的類型

分子印跡熒光傳感器用于分析檢測各種物質的過程大體為:當待測物質被分子印跡聚合物立體孔穴特異性吸附時,熒光材料會發(fā)生光誘導電子轉移(photoinduced electron transfer, PET)、熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)等物理化學變化,從而導致其熒光信號發(fā)生相應變化,利用熒光分光光度計檢測得到的熒光光譜圖中靶敏信號的發(fā)射峰會發(fā)生峰值的改變,通過制得標準曲線即可檢測待測物質。根據(jù)熒光光譜圖中發(fā)射峰個數(shù)的不同,分子印跡熒光傳感器大體可以分為3種:單發(fā)射分子印跡熒光傳感器、雙發(fā)射分子印跡熒光傳感器和三發(fā)射分子印跡熒光傳感器。

1.1 單發(fā)射分子印跡熒光傳感器

單發(fā)射分子印跡熒光傳感器指的是合成及檢測過程僅存在一種熒光物質,在特定激發(fā)波長下熒光光譜圖中僅有一個發(fā)射峰為靶敏信號,以其在吸附過程中的變化值作為衡量樣品中待測物質含量的標準。傳統(tǒng)意義上的單發(fā)射分子印跡熒光傳感器通常由一鍋法制備,印跡位點多包埋于內(nèi)部,結合模板分子速率慢且洗脫困難,近年來基于表面印跡的核-殼型MIPs傳感器發(fā)展迅速。Amjadi等[4]以硅基為載體,通過反相微乳液法嵌入CdTe QDs,合成了一種基于PET原理檢測氯霉素(chloramphenicol, CAP)的新型熒光納米傳感器。由于CAP的紫外-可見吸收帶接近CdTe QDs的帶隙,因此在識別過程中,QDs可作為電子供體將電子轉移到CAP分子的最低未占有分子軌道(lowest unoccupied molecular orbital, LUMO),導致CdTe QDs在550 nm處的熒光猝滅。

1.2 雙發(fā)射分子印跡熒光傳感器

雙發(fā)射分子印跡熒光傳感器指的是合成及檢測過程存在兩種熒光物質,在特定激發(fā)波長下熒光光譜圖中有兩個發(fā)射峰(一個為參比信號,一個為靶敏信號),在吸附過程中靶敏信號的峰值發(fā)生變化而參比信號的峰值保持不變或發(fā)生與前者相反的變化,以吸附過程中二者比值作為衡量樣品中待測物質含量的標準,因此較上述單發(fā)射傳感器而言,雙發(fā)射傳感器具有自我校正功能,可以減少或消除人為及機器帶來的誤差。雙發(fā)射分子印跡熒光傳感器目前主要包括兩類,一類是待測物本身帶有熒光,如Xu等[5]基于FRET識別原理構建了一種用于檢測阿霉素的分子印跡熒光傳感器。由于其發(fā)射光譜與阿霉素的吸收光譜重疊,當兩者在空間上距離<10 nm并接收一定波長的光照射后,CDs熒光供體與阿霉素受體之間發(fā)生熒光共振能量轉移,熒光供體的激發(fā)能轉移到熒光受體上繼而使其被激發(fā),導致CDs熒光逐漸猝滅而阿霉素熒光逐漸增強,實現(xiàn)了對阿霉素快速地選擇性分析。另一類是待測物不帶有熒光,如蘇立強團隊[6]以CDs和CdSe QDs組成的雙熒光體系結合分子印跡技術制備比率型傳感器,在吸附過程中參比CdSe QDs由于包埋在SiO2中熒光強度幾乎不變,外層CDs熒光強度隨著待測物濃度而變化。

1.3 三發(fā)射分子印跡熒光傳感器

三發(fā)射分子印跡熒光傳感器指的是合成及檢測過程存在3種熒光物質,在比率型熒光傳感器基礎上增加一個新的熒光信號,通過三元發(fā)射擴大可視化窗口、提高裸眼檢測精確度,目前有關研究相對較少。Yang等[7]分別制備以綠色和紅色量子點(g-QDs和r-QDs)為熒光材料、葉酸為模板分子的核-殼型分子印跡熒光傳感器,然后以適當?shù)谋壤旌系玫交赑ET的三重發(fā)射分子印跡熒光傳感器。在吸附過程中,葉酸的羥基和氨基與3-氨丙基三乙氧基硅烷的氨基之間形成氫鍵,葉酸具有接近g-QDs@MIPs和r-QDs@MIPs帶隙的紫外吸收峰,因此在QDs導帶處的激發(fā)電荷易轉移到葉酸的LUMO而無法回到QDs價帶,進而引起QDs的綠色熒光和紅色熒光逐漸猝滅而葉酸熒光增強。通過條件優(yōu)化,使g-QDs和r-QDs之間的猝滅速率差異被擴大,以獲得更寬范圍和豐富的熒光顏色演化,這種出色的可視化能力使得僅通過便攜式紫外燈裸眼準確讀出葉酸濃度成為可能。

2 量子點基分子印跡熒光傳感器在快速檢測中的應用

量子點基分子印跡熒光傳感器已經(jīng)被廣泛應用于環(huán)境、食品、生物等領域進行痕量物質甚至超痕量物質的檢測分析。根據(jù)被檢測物質性質,我們將從離子檢測、有機小分子檢測和生物大分子檢測3個方面來闡述其在多個領域的實際應用。

2.1 離子的分析檢測

離子印跡是印跡聚合物的一個重要分支,由于環(huán)境中殘留重金屬對于人類生命安全危害極大,因而目前對于離子印跡的研究多以鉛(Pb)、汞(Hg)、銅(Cu)等重金屬離子為模板,通過其特有的金屬配位作用制備得到具有特異性識別能力的離子印跡聚合物(ion imprinted polymers, IIPs),與靈敏熒光材料結合即可實現(xiàn)對目標離子的選擇性富集、快速痕量檢測。Patra等[8]構建了一種靈敏檢測Ag+的新型紙基離子印跡熒光傳感器,將熒光素染料用作制備CDs的前驅體,該傳感器具有低毒性、高穩(wěn)定性和良好的量子產(chǎn)率。該CDs@MIPs改性濾紙條已成功地用于活細胞成像和Ag+的細胞內(nèi)分析,響應時間<10 s。針對多種離子同時檢出問題,Xu課題組[9]首次提出了同時檢測兩種金屬離子的雙參比離子印跡熒光傳感器,以分別對Fe3+和Cu2+有響應的氨基修飾CDs和羧基修飾CdTe QDs為熒光團,通過一鍋法合成制備了介孔結構雙模板雙參比離子印跡熒光探針。當檢測Fe3+時,以CDs為參比,CdTe QDs猝滅;而當檢測Cu2+時,以CdTe QDs為參比,CDs猝滅。使用這種雙模板雙參比策略,可以在真實水樣中同時檢測Fe3+和Cu2+。在保持IIPs靈敏度和選擇性的同時,制備的雙參比熒光傳感器可以同時檢測兩種離子,大大提高了檢測效率,同時該工作創(chuàng)新了印跡傳感器領域的信號輸出模式,為高通量檢測帶來了技術進步。此外,同種離子具有不同價態(tài)且常同時存在,針對這一問題,Jinadasa等[10]成功研制了一種室溫熒光化學傳感器并應用于魚類樣品中無機砷(As3+和As6+)的選擇性檢測和定量分析。該方法操作簡單,僅需較短的分析時間,可獲得良好的靈敏度和精密度。

2.2 有機小分子的分析檢測

在食品殘留與環(huán)境污染問題中主要目標檢測物通常為有機小分子,因而目前分子印跡熒光傳感器研究較多的方面是針對有機小分子的痕量分析,但在傳感器制備技術上仍然存在一定問題,近年來研究人員也提出了一些新策略。當前,制備分子印跡熒光傳感器時主要還是采用包埋法將熒光材料裹于硅基中,該方法會大大降低熒光材料的熒光強度從而影響傳感器靈敏度。針對此問題,Yu等[11]以甲基丙烯酸2-氨基乙酯鹽酸鹽作為表面活性劑修飾羧基CdTe QDs,并以被修飾QDs為支撐和熒光信號源,通過自由基聚合一鍋法直接合成了超薄4-硝基苯酚印跡層;該方法避免了合成及使用基質材料包埋的過程,從而實現(xiàn)對于海水和湖水樣品中4-硝基苯酚的高檢測靈敏度。由于傳統(tǒng)硅基材料內(nèi)聚擴展阻力會影響吸附位點對于待測物的識別,Amjadi等[12]設計了一種雙發(fā)射介孔結構分子印跡熒光傳感器,用于殺菌劑烯唑醇的特異性識別和檢測。CdTe/CdS QDs被封裝在SiO2介孔中,識別過程中CdTe/CdS QDs的熒光被選擇性猝滅,介孔的存在降低了傳質阻力、提高了位點選擇性,對烯唑醇的識別特異性明顯優(yōu)于其類似物。由于實際應用時的需求,多種分析物的同時檢測引起了研究人員極大的興趣,Wei等[13]通過在兩種不同顏色的QDs表面分別以不同模板分子制備MIPs,而后將所得MIPs等比例混合,建立了一種同時檢測去甲腎上腺素和腎上腺素的方法,這項工作為QDs@MIPs實際應用中同時檢測不同分析物提供了新的思路。為了提高監(jiān)測設備的便攜性,Sari等[14]利用紙基納米復合體系制備了一種新型光傳感材料用于三丁基錫化合物的檢測。他們以硝酸纖維膜為支撐,采用微乳液聚合技術合成印跡納米顆粒,然后將石墨烯QDs耦合固定在納米粒子表面。結果表明,其對海水中的三丁基錫化合物具有良好的選擇性、高靈敏度和低檢出限。由于檢測基質通常為液體環(huán)境,發(fā)展親水性傳感器勢在必行。Xu等[15]在制備過程中引入了親水聚甘油單甲基丙烯酸酯刷,通過自由基聚合構建了“親水開啟型”比率傳感器,可直接用于未被稀釋的純羊奶和牛奶中除草劑2,4-二氯苯氧乙酸的快速分析測定。傳統(tǒng)使用的量子點如CdTe QDs等含有重金屬元素,對于環(huán)境并不友好,新型綠色CDs應運而生,如Liu等[16]以桂花葉為碳源,分別采用乙醇和聚乙烯亞胺溶液萃取制備了兩種不同發(fā)射峰的高熒光CDs,并分別作為參比和靶敏信號,構建了比率熒光傳感器用于四環(huán)素的高選擇性、高靈敏度檢測。此外,Zhang等[17]成功制備了基于量子點接枝有機框架的雙功能分子印跡光聚合物(molecularly imprinted optopolymer, MIOP),使得通過光傳感和固相萃取-高效液相色譜同時檢測酪胺成為可能。在優(yōu)化條件下,酪胺含量在35～35 000 μg/kg時,光傳感方法的相對熒光強度線性增加,檢出限為7.0 μg/kg;而對于固相萃取-高效液相色譜,線性范圍為20～2 000 μg/kg,檢出限為5.0 μg/kg。

2.3 生物大分子的分析檢測

生物大分子、細菌和病毒等由于自身尺寸大、易變性且純天然模板難獲取,一直以來都是分子印跡技術的難點,盡管困難重重,但是應用前景廣闊。新型印跡方法如表面印跡、金屬螯合印跡、抗原印跡等的提出使生物大分子的分析檢測得到了一定發(fā)展,這其中對于蛋白質的研究較多。陳令新課題組[18]構建了基于QDs的選擇性靈敏檢測藻藍蛋白的印跡熒光納米傳感器,他們將以巰基乙酸和谷胱甘肽共同作為穩(wěn)定劑修飾的QDs作為功能單體,通過多巴胺自聚合有效地簡化了印跡過程,同時識別位點更加容易接近,該納米傳感器在結合藻藍蛋白后16 s內(nèi)就顯示出明顯的熒光衰減,提供了一種通用的蛋白質印跡策略。該課題組[19]還制備了一種熱敏比率印跡熒光納米傳感器,表現(xiàn)出良好的溫度響應、高靈敏度和選擇性,實現(xiàn)了基于FRET的溫度調(diào)節(jié)傳感識別檢測藻藍蛋白。此外,為了擴大可視化窗口,使裸眼檢測蛋白成為可能,Yang等[20]通過印跡后混合適當比例的藍/綠/紅發(fā)射牛血紅蛋白(bovine hemoglobin, BHb)印跡材料,構建了一種新型的三重發(fā)射熒光傳感器,識別時伴隨著寬范圍熒光顏色演變,覆蓋了綠色-紅色-藍色窗口,實現(xiàn)了對BHb的多重可視化檢測。以上對蛋白質的檢測均在體外進行,Cecchini等[21]報道了一種新型體內(nèi)識別蛋白質的分子印跡熒光傳感器,以人血管內(nèi)皮生長因子的83～91位氨基酸為模板、CdTe QDs為熒光信號源構建印跡熒光納米傳感器,可在體內(nèi)腫瘤異種移植實驗中定位過度表達人類表皮生長因子的腫瘤塊,該研究為印跡熒光傳感器體內(nèi)靶定分泌因子提供了新思路。除蛋白質外,在DNA方面的印跡也取得了一定進展。Arslan等[22]報道了一種適用于dsDNA快速檢測的比率印跡熒光傳感器,分別以Mn-ZnS QDs和陽離子染料孔雀石綠為熒光信號源,識別dsDNA時孔雀石綠分子從QDs@MIPs表面逃逸并嵌入dsDNA、熒光增強,同時QDs@MIPs的實時熒光開啟,實現(xiàn)了dsDNA的快速選擇性檢測,檢出限為19.48 ng/mL。在細菌檢測方面,Zhao等[23]建立了一種基于分子印跡熒光傳感器對單增李斯特菌的有效識別方法。該傳感器以經(jīng)過修飾的殼聚糖(NAC@CdTe QDs)為功能單體,制備過程中通過Pickering乳液聚合與分子印跡技術相結合,制備的印跡熒光傳感器能夠通過三維孔穴選擇性捕獲目標細菌,并成功應用于牛奶和豬肉樣品中單增李斯特菌的分析。在病毒檢測方面,Luo等[24]報道了一種混合分子印跡熒光傳感器,用于同時檢測甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)。該傳感器采用印跡后混合策略,分別以紅色、綠色QDs為熒光材料,HAV、HBV為模板分子制備MIPs而后以適當比例混合。結果表明,對兩種病毒的檢測均達到了令人滿意的選擇性和靈敏度,HAV和HBV檢出限分別為3.4和5.3 pmol/L。

3 總結與展望

目前量子點基分子印跡熒光傳感器在環(huán)境監(jiān)測、食品安全和生物分析等領域展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢和廣闊的應用前景,但該傳感器在制備、應用等方面仍存在著一定的問題:印跡過程需要用到大量模板分子,有些化合物價格昂貴,還有些化合物如代謝產(chǎn)物、生物活性物質等不易得到,這大大限制了分子印跡熒光傳感器的制備和應用;如何實現(xiàn)對于生物大分子以及病毒、細菌的印跡仍是重大挑戰(zhàn);在實際應用檢測時,對于一個樣本需要同時檢測兩種或多種殘留物質的情況十分普遍,開發(fā)出能夠對樣本中多種目標物質同時檢測的復合型傳感器,是該技術有待深入研究的一個重要方向。總之,對于量子點基分子印跡熒光傳感器的相關研究開展時間并不長,這項技術還需要學者不斷地探索和完善,以期獲得更大的發(fā)展和應用。