龔 柯，孫廉平，張迎信，曹正男，趙振東，周 政，趙正洪，占小登

（1.中國水稻研究所，國家水稻改良中心，浙江省超級稻研究重點實驗室，浙江 富陽 311401；2.中國水稻研究所北方水稻研究中心，黑龍江 寶清 155600；3.湖南省水稻研究所，湖南 長沙 410125；4. 湖南雜交水稻研究中心，雜交水稻國家重點實驗室，湖南 長沙 410125）

培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)且兼具香味的水稻品種是近年來水稻育種者關(guān)注的主要目標。優(yōu)質(zhì)香稻品種玉針香是湖南省水稻研究所育成的常規(guī)中熟晚秈稻品種。因其特細長的米粒、晶瑩剔透的外觀、松軟有嚼勁的口感和特殊的自然清香味，該品種表現(xiàn)出極高的市場推廣價值和育種價值[1]，是多家種業(yè)和米業(yè)公司爭相推廣的高檔特優(yōu)級香米品種。近年來，該品種也陸續(xù)被多家育種單位作為優(yōu)質(zhì)育種研究的骨干親本廣泛配組利用。然而，對于玉針香的細長粒、優(yōu)質(zhì)、香味等特性的分子遺傳機制，尚鮮有報道。研究以日本晴、9311、華占、中恢9308 和中恢8015 作為對照品種，通過已發(fā)表的功能標記，對玉針香中8 個粒形基因GS3、GW5、GS6、GW6a、GL7/GW7、GLW7、GW8 和 GS9[2]以及稻米品質(zhì)關(guān)鍵基因Wx[3]、香味基因BADH2[4]進行了基因型檢測，以期明確優(yōu)質(zhì)香稻品種玉針香的遺傳背景，為水稻遺傳育種中分子標記輔助選擇和親本選配提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料日本晴、9311、中恢9308、中恢8015 和 華占這5 個水稻種質(zhì)均由中國水稻研究所超級稻育種課題組提供，玉針香原原種由湖南省水稻研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 粒形考察 6 個供試材料植株成熟后，收取主穗上的谷粒，經(jīng)37℃恒溫箱（XMTD-8222）烘干36 h 后觀察谷粒外形。每個材料隨機挑選10 粒成熟飽滿的籽粒，通過中晶ScanMaker i800 Plus 掃描儀（型號：MRS-9600TFU2L）考察粒長和粒寬（精度均為0.01 mm），計算稻谷的長寬比。每個材料選取1 000 粒飽滿的谷粒，使用百分之一精度的電子天平稱取重量，重復3 次，取平均值作為千粒重。

1.2.2 DNA 提取與PCR 反應(yīng) 幼苗期，采摘每份材料的鮮嫩葉片進行總DNA 提取，DNA 提取、PCR 擴增和檢測方法均參照孫廉平等[5]所述方法進行。該研究所用功能標記基因的引物序列如表 1 所示。其中，GS6-InDel、GW6a-InDel、GL7-InDel2、GLW7-InDel、GW5-InDel 和GW8-InDel 標記引物是張琳等[6]對包括來自水稻多樣性小組的257 份材料在內(nèi)的全球水稻品種進行了等位基因發(fā)掘時，以日本晴為對照，根據(jù)粒形基因GS6、GW6a、GL7、GLW7、GW5 和GW8的序列差異設(shè)計的檢測標記，分別對應(yīng)著GS6 的上游714～719 處發(fā)生的12 bp 插入、GW6a 的基因上游584～589 處發(fā)生的6 bp 缺失、GL7 的啟動子區(qū)發(fā)生的11 bp 缺失、GLW7 的啟動子區(qū)發(fā)生的6 bp 缺失、GW5 基因約5 kb 區(qū)域發(fā)生的1 212 bp 大片段缺失和GW8 啟動子區(qū)發(fā)生的10 bp 缺失；引物In0919（GS9）和Chr701（GW7）是張晨等[7]通過比較日本晴和9311 中GS9 基因3'UTR 區(qū)存在的22 bp 差異和GW7基因啟動子區(qū)存在的18 bp 差異分別開發(fā)的多態(tài)性較好的基因分型標記；引物SF28 是Fan 等[8]根據(jù)GS3第2 個外顯子上的一個C-A 突變導致GS3 翻譯提前終止的特異位點設(shè)計的檢測標記；利用上述功能標記分別對日本晴、9311、玉針香、華占、中恢8015 和中恢9308 中的粒形基因進行檢測。引物Wx-484/485 是Bligh 等[3]發(fā)現(xiàn)在Wx 核苷酸序列中存在一段（CT）n的微衛(wèi)星序列，并以此為基礎(chǔ)設(shè)計的一套可以鑒別直鏈淀粉含量的功能標記，可以對高直鏈淀粉含量和低直鏈淀粉含量品種進行基因型檢測。BADH2-E2 和BADH2-E7 這2 對功能標記是王軍等[9]根據(jù)香味等位基因BADH2 第2 個外顯子上的7 bp 缺失和第7 個外顯子上的8 bp 缺失分別設(shè)計的，前者通過擴增的片段長度是否為100 或107 bp 來鑒定是香型還是非香型材料，雙條帶為雜合；后者則通過擴增的片段長度是否為196 或204 bp 來鑒定是香型還是非香型，2 個標記中任意1 個或2 個均表現(xiàn)為缺失型的品種，都會表現(xiàn)為具有香味。

表 1 研究所用標記引物

2 結(jié)果與分析

2.1 粒形與稻米品質(zhì)考察

如圖1 所示，相對于其他5 個品種，玉針香粒形最為細長，其粒長為（11.79±0.01）mm，粒寬為（2.11±0.01）mm，長寬比高達5.50±0.03，千粒重為（26.47±0.09）g（表2），粒形外觀和千粒重均表現(xiàn)較優(yōu)，遠高于粳稻品種日本晴，相較于其他幾個秈稻品種，也呈現(xiàn)了明顯的細長粒優(yōu)勢。觀察6 個品種的精米（圖2）發(fā)現(xiàn)，玉針香的外觀表現(xiàn)和堊白分布均優(yōu)于其他5 個品種。

2.2 粒形基因的分子標記檢測

如圖3 所示，在調(diào)控粒長的GS3、GS6、GLW7、GL7/GW7 等4 個基因中，玉針香的檢測結(jié)果表現(xiàn)為GS6 插入型、GL7/GW7 插入型、GS3 缺失型和GLW7缺失型；而在調(diào)控粒寬的基因GW5、GW8、GW6a 和GS9 中，GW5 和GW8 在玉針香中均表現(xiàn)為插入型，GW6a 和GS9 則表現(xiàn)為缺失型。

表 2 供試水稻品種谷粒的長、寬及千粒重

圖 1 供試水稻品種谷粒外形的比較

圖 2 供試水稻品種精米外觀品質(zhì)表現(xiàn)

圖3 供試水稻品種粒形基因的檢測

2.3 米質(zhì)基因Wx 和香味基因BADH2 的分子標記檢測

如圖4 所示，玉針香中Wx 基因的基因型與其他5 個材料存在差異，表現(xiàn)為缺失型，即屬于低直鏈淀粉基因型；BADH2 基因型鑒定結(jié)果表明，玉針香在BADH2 的第2 個外顯子上并不存在該7 bp 的缺失，與日本晴等其他5 個品種一致，但BADH2-E7 標記中玉針香顯示為缺失型，證實了其香味特征主要是由第7 個外顯子上的8 bp 缺失引起的。

圖4 供試水稻品種米質(zhì)基因Wx 和香味基因BADH2 的檢測

2.4 玉針香中的基因分型

根據(jù)12 個功能標記的檢測結(jié)果，對日本晴、9311、玉針香、華占、中恢9308 和中恢8015 中粒形基因、直鏈淀粉含量基因Wx 以及香味基因BADH2進行了基因型分型和匯總，結(jié)果如表 3 所示，12 個標記中除了BADH2-E2 標記外，其余的11 個標記在6個品種中均存在多態(tài)性；其中，香味基因BADH2 的標記BADH2-E7 和稻米品質(zhì)基因Wx 標記485/486 的檢測結(jié)果中，除玉針香外，其余5 個材料的檢測結(jié)果一致，證實了玉針香低直鏈淀粉含量的優(yōu)異稻米品質(zhì)和獨特香味很可能受上述2 個基因的基因型調(diào)控；在粒長基因中，GS3、GL7/GW7、GLW7 和GS9 均表現(xiàn)為導致粒長的基因型，上述基因的優(yōu)勢粒長基因型對于玉針香的細長粒表型起了正向調(diào)控作用；粒寬基因GW5、GS6、GW6a、GW8 的檢測結(jié)果中，玉針香的檢測結(jié)果分別為插入型、插入型、缺失型、插入型，這些基因型也促使玉針香的細長粒表型形成。

表3 供試水稻品種的基因型及遺傳效應(yīng)

3 結(jié)論與討論

中國有著悠久的水稻種植歷史，水稻籽粒的外觀、香味和口感等會直接影響消費者的消費意愿。但傳統(tǒng)香稻大多為地方品種，株型普遍偏高，生育周期較長，產(chǎn)量普遍偏低，適宜種植區(qū)域有限，且抗病性和抗逆性較差，不適宜大面積種植和生產(chǎn)。玉針香在稻米品質(zhì)和粒形方面具有極大優(yōu)勢，但目前主要作為常規(guī)稻種植。研究以日本晴、9311、華占、中恢8015 和中恢9308 為對照，針對玉針香的細長粒型、優(yōu)質(zhì)品質(zhì)和獨特香味，通過12 個特異性功能基因標記對與粒形、稻米品質(zhì)和香味相關(guān)的10 個基因（GS3、GW5、GS6、GW6a、GL7/GW7、GLW7、GW8、GS9、Wx、BADH2）進行檢測，結(jié)果表明：玉針香的特細長粒形可能主要受GS3、GL7、GW7 影響，同時兼具多個粒形基因的正向調(diào)控共同促成，其中GLW7 和GW8 基因型還可以顯著改善稻米品質(zhì)[2]；其優(yōu)良稻米品質(zhì)可能是受GLW7、GW8 和Wx 基因型的共同作用所致；其獨特香味可能主要受BADH2 第7 個外顯子缺失的影響。對玉針香粒形、稻米品質(zhì)和獨特香味性狀進行基因型檢測既有助于了解其遺傳背景，為多個優(yōu)勢基因的聚合育種提供理論參考，也為采用分子標記輔助手段實現(xiàn)水稻粒形及優(yōu)質(zhì)品種的定向選育提供思路。

挖掘優(yōu)質(zhì)基因是實現(xiàn)水稻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)育種的有效途徑之一，目前關(guān)于水稻的粒形、稻米品質(zhì)和香味特征的遺傳機理在突變體等試驗材料中的研究很多，但是聚合多個優(yōu)勢基因同時育種卻鮮有成功先例。玉針香是一個具有細長粒形、優(yōu)良稻米品質(zhì)及獨特香味的優(yōu)質(zhì)水稻品種，在實際育種工作中可作為供體親本，通過上述特異性功能基因標記對水稻粒形、米質(zhì)和香味進行定向篩選，極具利用價值。當然，玉針香中可能還存在其他優(yōu)勢基因，這些基因的功能和表現(xiàn)亟待進一步發(fā)掘、研究和利用。