李永平 葉新如 王 彬 陳敏氡 劉建汀 朱海生 溫慶放

(福建省蔬菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心/福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心,福建 福州 350013)

黃秋葵(HibiscusesculentusL.)屬于秋葵屬,其嫩果可食用,含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素及礦物鹽、多糖聚合體等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、保健功能的新型蔬菜[1-2],已成為許多國(guó)家運(yùn)動(dòng)員的首選蔬菜[3]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)能夠精確定量復(fù)雜混合物中特定核酸,是定量分析各種目的基因和基因表達(dá)量的重要技術(shù)手段[4]。影響RT-qPCR分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素包括RNA質(zhì)量、內(nèi)參基因及引物特異性等[5],其中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性對(duì)其結(jié)果影響最大。因此,有必要選擇表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因表達(dá)量進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[6]。然而,內(nèi)參基因在不同試驗(yàn)要求下表達(dá)可能出現(xiàn)差異[7-8],因此根據(jù)不同物種和不同試驗(yàn)要求篩選能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)蚨糠治鼍哂兄匾囊饬x。

肌動(dòng)蛋白基因(actin,ACT)、18S核糖體RNA基因(18S ribosomal RNA,18SrRNA)、真核生物延伸因子(elongation factor 1 alpha,EF-1α)、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、α-微管蛋白基因(α-tubulin,TUA)和β-微管蛋白基因(β-tubulin,TUB)等看家基因常被作為內(nèi)參基因[9-11]。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃秋葵內(nèi)參基因的篩選及表達(dá)分析鮮有報(bào)道,僅王旭等[12]發(fā)現(xiàn),研究黃秋葵查爾酮合成酶基因(chalcone synthase,AeCHS)表達(dá)時(shí)應(yīng)選用陸地棉β-actin(FJ560483.1)為內(nèi)參基因。因此,本研究根據(jù)黃秋葵RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù),篩選并驗(yàn)證獲得18SrRNA、ACT、EF-1α、TUA、TUB、GAPDH等基因開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)序列;以綠白1號(hào)的不同組織、不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)、葉片及不同脅迫條件下的葉片為材料,利用RT-qPCR測(cè)定基因表達(dá)量,結(jié)合GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件評(píng)價(jià)6個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性,旨在篩選適合的黃秋葵內(nèi)參基因,為黃秋葵相關(guān)基因表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 黃秋葵,為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育的綠白1號(hào),種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所蔬菜科研基地。待幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)移入培養(yǎng)箱進(jìn)行脅迫處理。

脅迫處理試驗(yàn)分為3組,分別為低溫(A組)、高溫(B組)和干旱處理組(C組);正常栽培條件下,分別采集盛果期不同組織(D組)、葉不同發(fā)育時(shí)期(E組)和果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期(F組)的樣品,分析脅迫處理組和正常栽培條件下黃秋葵18SrRNA、TUB、ACT、GAPDH、EF-1α和TUA基因的表達(dá)情況。采樣后液氮冷凍,-80℃保存。試驗(yàn)處理及樣品見(jiàn)表1。

表1 黃秋葵試驗(yàn)處理樣品Table1 Test sample and treatments of Hibiscus esculentus L.

1.1.2 主要試劑與數(shù)據(jù)分析來(lái)源 通用植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM 1st Strand cDNA)、Taq DNA Polymerase、dNTPs、pMD18-T simple,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自瑞士Omega公司;引物合成和測(cè)序由尚亞生物技術(shù)(福州)有限公司完成。

黃秋葵RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)由廣州基迪奧生物科技有限公司采用Illumina HiSeq TM 2500 PE125系統(tǒng)對(duì)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所黃秋葵種質(zhì)資源庫(kù)中的綠色黃秋葵資源(全株及嫩果均為綠色,果實(shí)六棱至八棱,以六棱為主)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 對(duì)黃秋葵RNA-seq所得數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、拼接和組裝,并在NCBI中進(jìn)行功能注釋(E值＜10-5)[13-14]。根據(jù)黃秋葵RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋,在NCBI上比對(duì)含有完整ORF,且與其他作物的同源性高,篩選得到18SrRNA、ACT、EF-1α、TUA、TUB和GAPDH基因全長(zhǎng)序列,應(yīng)用Primer Express 3.0軟件分別設(shè)計(jì)其基因ORF擴(kuò)增引物、熒光定量特異引物(表2)。

表2 6個(gè)內(nèi)參基因ORF擴(kuò)增及定量表達(dá)引物序列Table2 ORF amplification and quantitative expression primer sequence of six internal reference genes

1.2.2 黃秋葵基因的ORF擴(kuò)增 應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將黃秋葵各處理材料的總RNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈。PCR反應(yīng)體系(25μL):50 ng·μL-1cDNA 2μL、正反引物(10μmol·L-1)各1μL、10 mmol·L-1dNTP 0.5μL、5 U Taq酶0.3μL、1.5mmol·L-1MgCl2的10×PCR緩沖液2.5μL,超純水補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表3。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè),回收目的片段,轉(zhuǎn)化并測(cè)序。

1.2.3 常規(guī)PCR檢測(cè)定量引物 以反轉(zhuǎn)錄的黃秋葵cDNA為模板,用1.2.1中設(shè)計(jì)的熒光定量PCR引物進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系同1.2.2,PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表3第2個(gè)程序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)定量引物 定量檢測(cè)使用SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒(TakaRa公司,大連)。反應(yīng)體系(20μL):10μL Power SYBR?Green PCR Master Mix、2μL cDNA、正、反向引物各0.5μL(濃度為10μmol·L-1),用蒸餾水補(bǔ)足至20 μL。3個(gè)重復(fù),反應(yīng)程序見(jiàn)表3第3個(gè)程序。

1.2.5 基因表達(dá)穩(wěn)定性分析 利用熒光定量PCR分析基因表達(dá)穩(wěn)定性。以陸地棉β-actin(FJ560483.1)為內(nèi)參基因,將試驗(yàn)的29個(gè)黃秋葵樣品cDNA采用SYBR Green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,反應(yīng)體系同1.2.4,反應(yīng)程序見(jiàn)表3第4個(gè)程序。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù),采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析6個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性。GeNorm軟件中,內(nèi)參基因平均表達(dá)穩(wěn)定值(M)越小穩(wěn)定性越高;ⅤN/ⅤN+1值確定最適內(nèi)參基因數(shù)量,若ⅤN/ⅤN+1值＜0.15,則最適內(nèi)參基因的數(shù)量是N個(gè),當(dāng)ⅤN/ⅤN+1值＞0.15時(shí),最適內(nèi)參基因的數(shù)量為N+1個(gè)[15]。NormFinder軟件對(duì)基因穩(wěn)定性評(píng)定是根據(jù)基因表達(dá)穩(wěn)定值(S),S值越小基因穩(wěn)定性越好[16]。BestKeeper軟件中,標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation,SD)＞1時(shí),該內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定;SD＜1時(shí),變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)越小,內(nèi)參基因穩(wěn)定性越高[17]。

表3 PCR反應(yīng)程序Table3 PCR reaction procedure

2 結(jié)果與分析

2.1 黃秋葵內(nèi)參基因擴(kuò)增結(jié)果

從黃秋葵果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到ACT、TUB、18SrRNA、TUA、EF-1α、GAPDH基因全長(zhǎng)序列,設(shè)計(jì)各基因ORF引物進(jìn)行驗(yàn)證(圖1)。經(jīng)回收、連結(jié)、轉(zhuǎn)化、測(cè)序,結(jié)果表明,ACT、TUB、18SrRNA、TUA、EF-1α、GAPDH基因的ORF大小分別為1 134、1 338、1 464、1 353、1 407、1 455 bp。

2.2 基因引物設(shè)計(jì)及常規(guī)PCR檢測(cè)

依據(jù)ACT、TUB、18SrRNA、TUA、EF-1α和GAPDH基因ORF序列,各基因設(shè)計(jì)出一對(duì)熒光定量特異引物,用PCR檢測(cè)引物特異性,結(jié)果表明(圖2),6個(gè)內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)出大小與預(yù)期相符的單一條帶,表明所設(shè)計(jì)引物無(wú)二聚體、特異性強(qiáng),可用于RT-qPCR研究。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物

以黃秋葵嫩葉cDNA為模板,6對(duì)引物RT-qPCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,3次重復(fù)的RT-qPCR擴(kuò)增曲線(xiàn)較一致(圖3)。各基因的融解曲線(xiàn)(圖4)顯示3次重復(fù)的平均溶解溫度(melting temperature,Tm)基本一致,都只有一個(gè)特異峰,無(wú)引物二聚體,無(wú)非特異性擴(kuò)增,表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物特異性?xún)?yōu)、重復(fù)性好,可作為黃秋葵RT-qPCR的引物。

2.4 基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

由圖5可知,各處理組黃秋葵樣品中18SrRNA、ACT、EF-1α、TUA基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異,而在高溫處理下GAPDH基因的相對(duì)表達(dá)量有差異,在黃秋葵各組織、果莢發(fā)育不同時(shí)期、低溫處理、干旱處理下TUB基因的相對(duì)表達(dá)量均差異較大,表明18SrRNA、ACT、EF-1α、TUA基因在黃秋葵不同組織、果莢發(fā)育、葉發(fā)育,以及各種脅迫下均能較穩(wěn)定地表達(dá)。

2.5 內(nèi)參基因CT值分析

6個(gè)基因CT(cycle threshold)值在14.02～32.12之間,表達(dá)豐度分布范圍廣,其中18SrRNA的低于其他內(nèi)參基因CT值,且數(shù)值集中;EF-1α、ACT、GAPDH、TUA的CT值在16.20～23.83之間,表達(dá)豐度居中,除GAPDH外數(shù)值較集中;TUB的CT值最大且變化較大,表達(dá)量最低(圖6)。從各基因在不同處理下CT值分布來(lái)看,在黃秋葵不同組織中EF-1α、18SrRNA、ACT的CT值比較穩(wěn)定,TUA、GAPDH的CT值略有變化,TUB的CT值變化較大(圖7-A);果莢發(fā)育過(guò)程中除TUB的CT值有較大變化外,其他5個(gè)基因的CT值都相對(duì)穩(wěn)定(圖7-B);葉發(fā)育過(guò)程中,6個(gè)基因的CT值都相對(duì)穩(wěn)定(圖7-C);低溫處理和干旱處理時(shí)GAPDH、TUB的CT值變化較大(圖7-D、F);干旱處理時(shí)GAPDH的CT值變化較大(圖7-E)。由此可初步判斷,18SrRNA、EF-1α、ACT和TUA表達(dá)較為穩(wěn)定,GAPDH和TUB表達(dá)差異較大。

2.6 黃秋葵內(nèi)參基因的篩選

GeNorm軟件的配對(duì)差異值(ⅤN/ⅤN+1)用于確認(rèn)所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目,以降低單一內(nèi)參基因引起的偏差和波動(dòng)。由圖8可知,在盛果期不同組織、果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期、葉不同發(fā)育時(shí)期、低溫脅迫和高溫脅迫、干旱脅迫下,均有Ⅴ2/Ⅴ3值小于0.15,因此,各試驗(yàn)組的最適內(nèi)參基因數(shù)均為2個(gè)。

2.6.1 盛果期不同組織、果莢發(fā)育、葉發(fā)育時(shí)期黃秋葵內(nèi)參基因表達(dá)的篩選 由表4可知,經(jīng)GeNorm程序分析,在黃秋葵盛果期各組織中6個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值(M)排序?yàn)镋F-1α=18SrRNA＜TUA＜ACT＜GAPDH＜TUB;果莢不同發(fā)育時(shí)期M值排序?yàn)镋F-1α=ACT＜TUA＜GAPDH＜TUB;葉不同發(fā)育時(shí)期M值排序?yàn)?8SrRNA=ACT＜EF-1α＜GAPDH＜TUA＜TUB。經(jīng)NormFinder軟件分析,黃秋葵盛果期不同組織中6個(gè)內(nèi)參基因S值排序?yàn)?8SrRNA＜EF-1α＜ACT＜TUA＜GAPDH＜TUB;果莢不同發(fā)育時(shí)期6個(gè)內(nèi)參基因S值排序?yàn)镋F-1α＜ACT＜18SrRNA＜TUA＜GAPDH＜TUB;葉不同發(fā)育時(shí)期6個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定值(S)排序?yàn)镋F-1α＜18SrRNA=ACT＜GAPDH＜TUA＜TUB。經(jīng)BestKeeper軟件分析,黃秋葵盛果期不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性18SrRNA＞EF-1α＞ACT＞TUA＞GAPDH＞TUB,其中GAPDH和TUB穩(wěn)定性差,不可用;果莢不同發(fā)育時(shí)期EF-1α＞ACT＞18SrRNA＞TUA＞GAPDH＞TUB,其中TUB穩(wěn)定性差,不可用;葉不同發(fā)育時(shí)期18SrRNA＞ACT＞EF-1α＞GAPDH＞TUA＞TUB。

2.6.2 不同脅迫處理下黃秋葵內(nèi)參基因的篩選 由表5可知,經(jīng)GeNorm程序分析,黃秋葵低溫脅迫不同時(shí)段的M值排序?yàn)镋F-1α=18SrRNA＜ACT＜TUA＜GAPDH＜TUB;高溫脅迫不同時(shí)段M值排序?yàn)镋F-1α=TUA＜18SrRNA＜ACT＜TUB＜GAPDH;干旱脅迫不同時(shí)段M值排序?yàn)镋F-1α=18SrRNA＜TUA＜ACT＜GAPDH＜TUB。根據(jù)NormFinder軟件分析結(jié)果可知,在4℃低溫脅迫條件下6個(gè)內(nèi)參基因S值排序?yàn)锳CT＜18SrRNA＜EF-1α＜TUA＜GAPDH＜TUB;42℃高溫脅迫條件下6個(gè)內(nèi)參基因S值排序?yàn)镋F-1α＜TUA=18SrRNA＜ACT＜TUB＜GAPDH;干旱脅迫條件下6個(gè)內(nèi)參基因S值排序?yàn)?8SrRNA＜EF-1α＜TUA＜ACT＜GAPDH＜TUB。BestKeeper軟件直接利用CT值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果表明,在低溫脅迫條件下穩(wěn)定性ACT＞18SrRNA＞EF-1α＞TUA＞GAPDH＞TUB,TUB穩(wěn)定性差,不可用;高溫脅迫條件下穩(wěn)定性EF-1α＞TUA＞18SrRNA＞ACT＞TUB＞GAPDH,GAPDH穩(wěn)定性差;干旱脅迫條件下穩(wěn)定性18SrRNA＞EF-1α＞TUA＞ACT＞GAPDH＞TUB,TUB穩(wěn)定性較差。

采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析全部29個(gè)黃秋葵樣品,結(jié)果顯示,18SrRNA、EF-1α、ACT均排名前三,且數(shù)值較低,適合作為黃秋葵熒光定量分析的內(nèi)參基因;TUA居第四名,穩(wěn)定性尚好,亦可選用;GAPDH和TUB居末位,穩(wěn)定性較差,不宜選用。

3 討論

目前,RT-qPCR是基因表達(dá)分析主要工具,是明確植物基因功能和調(diào)控機(jī)制的重要途徑。然而,樣品自身差異、RNA質(zhì)量等會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果出現(xiàn)誤差。為提高結(jié)果可靠性,引入內(nèi)參基因校正表達(dá)數(shù)據(jù)。內(nèi)參基因穩(wěn)定性直接嚴(yán)重影響RT-qPCR分析結(jié)果準(zhǔn)確度[18]。研究表明,內(nèi)參基因在不同脅迫和不同組織表達(dá)會(huì)出現(xiàn)變化[19-20]。因此,應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)要求選擇最適宜的內(nèi)參基因或組合。本研究利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析黃秋葵6個(gè)看家內(nèi)參基因在低溫、高溫、干旱脅迫處理不同時(shí)間和正常處理盛果期不同組織、果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期、葉不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)的穩(wěn)定性結(jié)果不同處理和發(fā)育時(shí)期表達(dá)最穩(wěn)定的基因不盡相同。

表4 不同軟件分析6個(gè)內(nèi)參基因在黃秋葵盛果期不同組織、果莢不同發(fā)育時(shí)期、葉不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)穩(wěn)定性Table4 Expression stability of the 6 reference genes under different different tissues during the fruit period,fruit developmen and leaf development conditions by software analysis

前人對(duì)非生物脅迫條件下植物中內(nèi)參基因已有研究報(bào)道。葉新如等[21]研究表明,冬瓜(Benincasa hispidaCogn.)高溫、干旱脅迫的內(nèi)參基因是TUA,而EF-1α適合于低溫脅迫;肖翠等[22]研究發(fā)現(xiàn)柑橘(CitrusL.)在干旱脅迫下GAPDH、18SrRNA表達(dá)最穩(wěn)定,而在低溫脅迫下ACT、18SrRNA表達(dá)穩(wěn)定;Lovdal等[23]研究表明,番茄(LycopersiconesculentumMill.)在低溫脅迫下EF-1α和RPLA表達(dá)穩(wěn)定,GAPDH穩(wěn)定性最差;龐強(qiáng)強(qiáng)等[24]發(fā)現(xiàn)茄子(SolanummelongenaL.)在高溫脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性最好的是SmEF1a;杜輝輝[25]發(fā)現(xiàn)Ha18SrRNA、HaTUA5及HaUBQ10是梭梭(Haloxylonammodendron)干旱脅迫下最適內(nèi)參基因;EF-1α是茅蒼術(shù)(RhizomaAreactylodisLanceae)在干旱脅迫下最佳內(nèi)參基因[26]。本研究結(jié)果表明,黃秋葵在高溫脅迫下EF-1α表達(dá)穩(wěn)定性最好,這與龐強(qiáng)強(qiáng)等[24]在茄子上的研究結(jié)果一致;干旱脅迫下黃秋葵18SrRNA表現(xiàn)最為穩(wěn)定,杜輝輝[25]在梭梭上也得到此結(jié)果;低溫脅迫下黃秋葵ACT表達(dá)穩(wěn)定與柑橘[22]、花椰菜(BrassicaoleraceaL.)[27]的研究結(jié)果一致。

表5 不同軟件分析不同脅迫條件下黃秋葵6個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table5 Expression stability of the 6 reference genes under different stress conditions by software analysis

本研究中,黃秋葵根、莖、葉等不同組織最適內(nèi)參基因?yàn)镋F-1α和18SrRNA,與鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)的相關(guān)研究一致[28],冬瓜不同組織中EF-1α表達(dá)穩(wěn)定性最好[21],核桃(Juglans regia)EF-1α和GAPDH在不同組織和發(fā)育時(shí)期中表達(dá)最穩(wěn)定[29];在印度南瓜不同組織中EF-1α表達(dá)穩(wěn)定[30]。EF-1α在黃秋葵果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)最穩(wěn)定,而獼猴桃果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期18SrRNA表達(dá)最穩(wěn)定[31],這可能與試驗(yàn)材料的物種、內(nèi)參基因篩選范圍不同有關(guān)。

內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析與篩選,是得到準(zhǔn)確基因表達(dá)分析結(jié)果的必要前提。基因穩(wěn)定性分析常用GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件。GeNorm原則是2個(gè)穩(wěn)定內(nèi)參基因的表達(dá)水平在試驗(yàn)樣品中一致,根據(jù)ⅤN/ⅤN+1值確定最適內(nèi)參基因個(gè)數(shù),并選出最優(yōu)組合,以校正系統(tǒng)偏差,從而獲得更可靠的表達(dá)分析結(jié)果,對(duì)于研究基因表達(dá)的細(xì)微變化具有極其重要的意義[32]。NormFinder可分析內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性,還能比較目標(biāo)基因的表達(dá)水平。本試驗(yàn)利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析黃秋葵6個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性及表達(dá)水平,分析結(jié)果略有不同,這種不一致性可能是由于計(jì)算機(jī)軟件的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法不同及試驗(yàn)數(shù)據(jù)的誤差引起的。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得黃秋葵18SrRNA、ACT、EF-1α、TUA、TUB、GAPDH基因全長(zhǎng)序列,分析了這6個(gè)基因在黃秋葵盛果期不同組織、果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期、葉不同發(fā)育時(shí)期,以及不同脅迫下的表達(dá)水平,結(jié)合GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件評(píng)價(jià)其表達(dá)穩(wěn)定性,結(jié)果表明,各處理中18SrRNA、EF-1α、ACT表達(dá)均較為穩(wěn)定,GAPDH表達(dá)穩(wěn)定性較差,TUB的表達(dá)穩(wěn)定性最低。本研究結(jié)果對(duì)于黃秋葵的基因表達(dá)等相關(guān)分子生物學(xué)研究具有借鑒意義。