楊 旭，吳東舒，華昕彤，李 榮，呂 偉，姜 晨

(1.大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023； 2.大連富谷食品有限公司， 遼寧 大連 116400 )

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)屬硬骨魚綱、鲀形目、鲀科、東方鲀屬，生活在近海，為食肉性魚類，大多數(shù)都生活在太平洋北部的國家，如日本、朝鮮和中國等[1]，是河鲀中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的，可以進(jìn)行人工養(yǎng)殖的優(yōu)良品種之一[2-3]。在日、韓等國，河鲀消費(fèi)量巨大，尤其是紅鰭東方鲀的消費(fèi)量最大。但由于養(yǎng)殖水域中存在的大量細(xì)菌、病毒，紅鰭東方鲀養(yǎng)殖時(shí)常被病害困擾，弧菌病和寄生蟲病最為常見[4]。其中哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)是海洋微生物區(qū)系中的一員，同時(shí)也是海洋動(dòng)物的致病菌之一[5-6]。魚類在感染弧菌患病后，多數(shù)外在表現(xiàn)為體表潰爛，鱗片脫落，內(nèi)在表現(xiàn)為腸道、肝臟充血、出現(xiàn)血斑等現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)大規(guī)模死亡。王斌等[7]曾報(bào)道，大連地區(qū)紅鰭東方鲀皮膚潰爛病的病原菌為哈維氏弧菌；張超等[8]也有相同的發(fā)現(xiàn)。

哺乳動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)被病原菌侵犯時(shí)，會(huì)引發(fā)防御機(jī)制從而去除異物[9]。魚類免疫與哺乳動(dòng)物相同，分為特異性和非特異性免疫，但其非特異性免疫發(fā)揮主要作用。非特異性免疫對病原體的識別是通過模式識別受體(PRR)與病原相關(guān)分子模式(PAMP)的相互結(jié)合實(shí)現(xiàn)，這與哺乳動(dòng)物相似。但為適應(yīng)水生生活，魚類非特異性免疫對病原相關(guān)分子模式的識別范圍更廣，免疫應(yīng)答的啟動(dòng)條件更低[10]。非特異性免疫的效應(yīng)細(xì)胞主要是單核巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等，具有吞噬和殺傷功能，還可分泌多種免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，介導(dǎo)發(fā)生炎癥反應(yīng)。而在魚類先天性免疫系統(tǒng)中，白介素、干擾素、溶菌酶等免疫因子具有重要的功能[11-12]。白細(xì)胞介素(IL)是一個(gè)與魚類炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的功能性蛋白家族，目前已發(fā)現(xiàn)40多種[13]，其中主要分為白介素-1(IL-1)家族、白介素-2(IL-2)家族(YC家族)、趨化因子家族、白介素-10(IL-10)家族等。Peng等[14]對紅鰭東方鲀感染哈維氏弧菌后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀3個(gè)白介素基因IL-1b、IL-8和IL-10均呈差異表達(dá)，但并未進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，其序列特征也沒有分析。IL-1b是由IL-1衍生而來的細(xì)胞因子[15-16]，多數(shù)由巨噬細(xì)胞分泌[17]。IL-1b參與免疫應(yīng)答過程，能夠刺激和促進(jìn)一些免疫細(xì)胞如B細(xì)胞、T細(xì)胞的合成、分化，增強(qiáng)參與免疫反應(yīng)細(xì)胞的殺傷力，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[18-21]。IL-8是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生[22]。在免疫過程中，IL-8通過趨化免疫細(xì)胞來影響免疫細(xì)胞對抗原的識別[23]，而在抗炎過程中，IL-8則通過對中性粒細(xì)胞的趨化從而對病原起到殺傷作用[24-25]。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，主要由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生[26-28]。IL-10能夠調(diào)節(jié)固有免疫細(xì)胞的生長和分化[29]，并抑制T細(xì)胞的活化和功能，從而促使機(jī)體免疫應(yīng)答趨于平穩(wěn)[30]，起到對免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)控的作用。除此之外，IL-10還可以直接抑制黏附因子的表達(dá)[31-32]。

筆者對紅鰭東方鲀3個(gè)白介素IL-1b、IL-8和IL-10基因的序列特征進(jìn)行了分析，對其mRNA在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，并測定了哈維氏弧菌感染紅鰭東方鲀后3個(gè)基因在肝臟及脾臟的表達(dá)情況，為深入探究紅鰭東方鲀白介素基因的免疫作用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 紅鰭東方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因序列分析

自美國國立生物技術(shù)信息中心得到IL-1b、IL-8和IL-10基因序列的全長(NM_001280090.1、NM_001032587.1、XM_003973694.3)，通過簡單的模塊化結(jié)構(gòu)研究工具SMART和Clustal Omega進(jìn)行了多序列比對分析和保守結(jié)構(gòu)域、基序和信號肽的鑒定。

1.2 健康紅鰭東方鲀組織的采集

試驗(yàn)所用紅鰭東方鲀均采購于大連富谷食品有限公司，體長為(15.19±0.32) cm，平均體質(zhì)量為(190.34±2.13) g，試驗(yàn)前暫養(yǎng)7 d。以15尾紅鰭東方鲀?yōu)樵囼?yàn)對象，5尾為一組，設(shè)3個(gè)平行組，進(jìn)行組織采樣。采集6個(gè)組織，包括腦、鰓、心臟、肌肉、肝臟和脾臟，液氮冷凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 哈維氏弧菌感染試驗(yàn)

試驗(yàn)共選取60尾紅鰭東方鲀，設(shè)置3個(gè)平行組。參考前期試驗(yàn)結(jié)果[7]，經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)確定向試驗(yàn)組每尾紅鰭東方鲀注射密度1×107cfu/mL的哈維氏弧菌0.1 mL，分別在感染0、12、24、48 h時(shí)自3個(gè)平行組中各隨機(jī)挑選5尾魚，進(jìn)行紅鰭東方鲀肝臟和脾臟組織采樣，液氮冷凍后于冰箱-80 ℃保存，用于提取樣品總RNA。

1.4 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

取試驗(yàn)樣品20 mg使用TIANGEN動(dòng)物總RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA的提取，采用NanoDrop 2000c UV核酸定量儀進(jìn)行RNA濃度檢測。使用TIANGEN FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定

采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)IL-1b、IL-8和IL-10基因引物和內(nèi)參基因β-actin的引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測紅鰭東方鲀中IL-1b、IL-8和IL-10基因的表達(dá)情況。

混合樣品試劑，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(Applied Biosystems, USA)檢測，設(shè)置3次重復(fù)試驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)束后，對相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將所得結(jié)果用 2-ΔΔCt法計(jì)算分析比較，并進(jìn)行單因素方差分析，用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05表示差異顯著，分析各組織的相對表達(dá)水平。

表1 紅鰭東方鲀白介素基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析 的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 紅鰭東方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因序列分析、系統(tǒng)進(jìn)化和同源性分析

使用SMART軟件分析3個(gè)基因的保守結(jié)構(gòu)域(圖1a)，預(yù)測發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀IL-1b序列存在一個(gè)保守的功能域IL-1，IL-8基因包含一個(gè)SCY結(jié)構(gòu)域，IL-10序列存在信號肽和一個(gè)保守的功能域IL-10。在紅鰭東方鲀和其他魚類的序列比對中，發(fā)現(xiàn)IL-8基因具有特殊的結(jié)合位點(diǎn)(圖1b)，IL-10 mRNA 3′端存在特殊的TATTTATT片段。

2.2 紅鰭東方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因組織表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對紅鰭東方鲀健康組織中IL-1b、IL-8和IL-10基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。IL-1b、IL-8和IL-10基因在所有檢測組織中均有表達(dá)，IL-1b基因在脾臟中表達(dá)量最高，達(dá)到腦的41倍，另外，在肝臟和鰓中表達(dá)量也顯著高于腦組織，心臟和肌肉中表達(dá)量較低。IL-8基因在脾臟、肝臟中表達(dá)量顯著高于腦組織，達(dá)到腦的37倍和10倍。IL-10基因在脾臟中的表達(dá)水平最高，肝臟、肌肉中表達(dá)次之，而在鰓、心臟、腦中表達(dá)量較低(圖2)。

圖1 紅鰭東方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因序列分析Fig.1 Sequence analysis of IL-1b, IL-8 and IL-10 genes in tiger puffer T. rubripes a.紅鰭東方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因結(jié)構(gòu)域； b.不同物種IL-8基因氨基酸序列比對(紅框表示ELR基序). a.domain structures of IL-1b, IL-8 and IL-10 genes in tiger puffer T. rubripes; b.amino acid sequence alignment of IL-8 gene in different species (red frame shows the ELR motif).

圖2 紅鰭東方鲀健康組織樣品中IL-1b、IL-8和IL-10基因的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of IL-1b, IL-8 and IL-10 genes in tissues of healthy tiger puffer T. rubripes *表示與腦組織的表達(dá)量相比有顯著性差異. * indicates significant differences compared to brain tissue.

2.3 紅鰭東方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因在哈維氏弧菌感染后的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析哈維氏弧菌感染后紅鰭東方鲀肝臟和脾臟組織中的IL-1b、IL-8和IL-10基因表達(dá)情況(圖3～圖5)，結(jié)果表明，感染哈維氏弧菌后肝臟和脾臟中的IL-1b基因表達(dá)量均顯著升高，在染菌后12 h的表達(dá)量顯著高于0 h，肝臟組織在24、48 h表現(xiàn)出持續(xù)下降，48 h的表達(dá)量與0 h相比沒有顯著變化，而脾臟在24、48 h仍處于一個(gè)較高的表達(dá)量。感染哈維氏弧菌后肝臟和脾臟的IL-8基因表達(dá)量均顯著升高，在染菌后12 h的表達(dá)量顯著高于0 h，并于24 h之后表達(dá)下降但依舊有差異，在48 h的表達(dá)量與0 h相比無顯著變化。感染哈維氏弧菌后肝臟和脾臟中的IL-10基因表達(dá)量均顯著升高，肝臟中12 h表達(dá)量升高但無顯著差異，24 h顯著高于0 h的表達(dá)量，48 h開始下降但是仍差異顯著。脾臟中12 h表達(dá)量顯著高于0 h，于24 h有一定的下降，48 h表達(dá)量又顯著增加達(dá)到峰值。

圖3 紅鰭東方鲀脾臟和肝臟中IL-1b基因 在哈維氏弧菌感染后的時(shí)空表達(dá)Fig.3 Expression profiles of IL-1b gene in the spleen and liver of tiger puffer T. rubripes challenged with V. harveyi *表示與0 h相比有顯著性差異，下同. * indicates significant differences compared with the tiger puffer in the control group, et sequentia.

圖4 紅鰭東方鲀脾臟和肝臟中IL-8基因 在哈維氏弧菌感染后的時(shí)空表達(dá)Fig.4 Expression profiles of IL-8 gene in the spleen and liver of tiger puffer T. rubripes challenged with V. harveyi

圖5 紅鰭東方鲀脾臟和肝臟中IL-10基因 在哈維氏弧菌感染后的時(shí)空表達(dá)Fig.5 Expression profiles of IL-10 gene in the spleen and liver of tiger puffer T. rubripes challenged with V. harveyi

3 討 論

3.1 基因序列特征分析

通過基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，IL-1b的預(yù)測蛋白序列僅包含一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，稱為IL-1結(jié)構(gòu)域，在斑馬魚(Daniorerio)、羅非魚(Oreochromsmossambcus)、雙斑東方鲀(T.bimoculatus)中高度保守[33]。在哺乳動(dòng)物中，IL-1b轉(zhuǎn)化酶(ICE)通過切割I(lǐng)L-1b前體，進(jìn)而釋放具有活性的IL-1b蛋白[34]。同時(shí)已有研究表明，在硬骨魚中，IL-1b同樣需要切割，才會(huì)具有活性。但通過序列分析并未找到IL-1b轉(zhuǎn)化酶切割位點(diǎn)，切割機(jī)理尚不清楚[35-36]。

紅鰭東方鲀IL-8蛋白在34～94位氨基酸殘基間的趨化因子(CXC)結(jié)構(gòu)域里存在SCY保守區(qū)域。其多肽序列中存在4個(gè)保守的半胱氨酸，在每2個(gè)半胱氨酸之間存在著1個(gè)精氨酸，這與大多數(shù)魚CXC趨化結(jié)構(gòu)一致。此外，IL-8基因在哺乳動(dòng)物和鳥類等高等動(dòng)物中普遍存在受體結(jié)合位點(diǎn)Glu-leu-Arg(ELR)基序，有研究表明，ELR基序在哺乳動(dòng)物中具有誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的作用[37]。通過分析已知的魚類IL-8氨基酸序列可知(圖1b)，大頭鱈(G.macrocephaus)[38]和大西洋鱈[38]中的基序?yàn)镋LR，而褐牙鲆中為SLH[39]，黑線銀鮫中為SLQ[40]，虹鱒中為DLR[41]，七鰓鰻(Lampetrafluviatilis)中為GGR[42]，在已發(fā)表其他魚類中還含有9種相類似的基序：AER、LLR、SLR、DPR、EQH、AMH、EMH、ELH和QLS[43]，紅鰭東方鲀中IL-8基因中的基序是EQH。研究表明，盡管目前僅有鱈魚科魚類發(fā)現(xiàn)ELR基序，其他包含類似基序的魚類即使缺乏ELR基序也能吸引中性粒細(xì)胞[44-45]，但是趨化能力明顯弱于ELR基序[46]。

紅鰭東方鲀的IL-10預(yù)測蛋白中含有IL-10功能域和一個(gè)疏水前導(dǎo)序列。此外，在紅鰭東方鲀IL-10 mRNA的3′UTR中(772 bp到779 bp)，存在一個(gè)不穩(wěn)定基序TATTTATT，該基序被認(rèn)為是降解因子的最佳結(jié)合位點(diǎn)[27]。

3.2 紅鰭東方鲀各組織IL-1b、IL-8和IL-10基因表達(dá)情況

3.3 哈維氏弧菌感染后紅鰭東方鲀組織中IL-1b、IL-8和IL-10基因表達(dá)的變化

為進(jìn)一步研究3個(gè)基因在哈維氏弧菌感染后的表達(dá)模式，筆者通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對其48 h內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行了分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，感染初期紅鰭東方鲀的肝臟中，IL-1b基因在刺激后的12 h出現(xiàn)明顯上調(diào)并達(dá)到峰值，隨后逐漸下降；脾臟中也是在初期快速表達(dá)，48 h仍處于一個(gè)較高的表達(dá)量。IL-1b可作用于肝細(xì)胞使其攝取氨基酸能力變強(qiáng)，進(jìn)而合成和分泌大量急性期蛋白，所以IL-1b基因在短時(shí)間內(nèi)大量生成。同樣的現(xiàn)象在其他魚類也有發(fā)現(xiàn)，如在虹鱒[54]中，IL-1b基因在脂多糖刺激4 h后在頭腎白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中大量表達(dá)。小斑點(diǎn)貓鯊(Scyliorhinuscanicula)在注射脂多糖后，肝臟和精巢中IL-1b基因表達(dá)量在5 h明顯增加[55]。虹鱒和小斑點(diǎn)貓鯊IL-1b基因皆是在刺激后短時(shí)間內(nèi)，表達(dá)量顯著增加，可見IL-1b基因在受到刺激時(shí)迅速反應(yīng)且高表達(dá)。其次，IL-8基因在肝臟和脾臟都是在12 h達(dá)到最大表達(dá)量，在24 h仍處于一個(gè)高表達(dá)的狀態(tài)。該表達(dá)模式與Sun等[56]的結(jié)果相符，半滑舌鰨在鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)的感染下，IL-8基因增長顯著并于12 h達(dá)到最大值。IL-8是一種多功能的細(xì)胞因子，對中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞具有趨化作用，可以促進(jìn)炎性反應(yīng)進(jìn)展調(diào)節(jié)宿主免疫，因此當(dāng)宿主被侵染時(shí)會(huì)在肝臟和脾臟中快速且大量分泌。相比于IL-1b和IL-8基因短時(shí)間內(nèi)的大量表達(dá)，IL-10基因呈現(xiàn)出一種不同的表達(dá)模式。紅鰭東方鲀IL-10基因在感染初期并無顯著應(yīng)答，肝臟中表達(dá)量較低，于24 h被激活顯著增長達(dá)到峰值；在脾臟中12 h先出現(xiàn)顯著上調(diào)，在24 h下降后于48 h再次上調(diào)達(dá)到最高表達(dá)量(9.2倍)。這種延遲表達(dá)模式在草魚(Ctenopharyngodonidella)中也有體現(xiàn)[57]，草魚IL-10基因在TGF-β1誘導(dǎo)后于72 h才開始顯著上調(diào)。這也印證了IL-10基因的免疫抑制作用，IL-10基因通過抑制一氧化氮的產(chǎn)生而干擾IFN-r對巨噬細(xì)胞的活化。Zhang等[58]對小鼠的脾臟進(jìn)行ADSC輸液研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，IL-10基因的表達(dá)可抑制促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1b和TNF-α的表達(dá)。本試驗(yàn)IL-1b和IL-10基因的表達(dá)模式與小鼠脾臟的表達(dá)模式相符，在哈維氏弧菌感染早期紅鰭東方鲀IL-1b基因快速升高，隨著12 h后IL-10基因的顯著上調(diào)IL-1b基因的表達(dá)逐漸降低，說明紅鰭東方鲀IL-10基因可能也會(huì)通過降低IL-1b等炎癥細(xì)胞因子水平從而達(dá)到抑制炎癥作用，該機(jī)制是一種重要的機(jī)體避免炎癥反應(yīng)過度的自我保護(hù)。

4 結(jié) 論

紅鰭東方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因序列全長分別為771、822、844 bp，在進(jìn)化關(guān)系上與雙斑東方鲀親緣關(guān)系最近，在紅鰭東方鲀的組織中普遍表達(dá)，而且在免疫相關(guān)組織中表達(dá)顯著。感染哈維氏弧菌后，脾臟和肝臟組織中IL-1b、IL-8和IL-10基因的表達(dá)均發(fā)生顯著變化，表明其在免疫過程中起調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步探究紅鰭東方鲀白介素基因的免疫功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。