陳文強，汪小福，陳笑蕓，彭 城，徐俊鋒，蔡 健，*

(1.阜陽師范大學 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室(籌)，浙江 杭州 310021)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是蘭科樹蘭族石斛屬多年生草本植物[1]，據(jù)最新版《中國藥典》的記錄[2]，其具有滋陰清熱、生津養(yǎng)胃之功效。鐵皮石斛中含有多種活性物質(zhì)如多糖、生物堿、蛋白質(zhì)[3]，以及人體所需的微量元素等，是較為珍稀的藥用植物。鐵皮石斛主要分布在我國南方地區(qū)，如浙江、云南、廣西和安徽等地[4]。浙江由于獨特的地理和氣候環(huán)境，造就了鐵皮石斛高品質(zhì)的特性。如馬旖旎[5]對不同區(qū)域的鐵皮石斛成分進行分析發(fā)現(xiàn)，浙江產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛多糖和黃酮含量較為豐富。浙江鐵皮石斛產(chǎn)地分布廣闊[6]，不同地區(qū)鐵皮石斛質(zhì)量也參差不齊；另外，鐵皮石斛市場上也存在“以假亂真”“以次充好”等混亂現(xiàn)象，嚴重損害了消費者的正當權益，制約了鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)性的發(fā)展，迫切需要建立快速精準的鑒別方法，以滿足市場監(jiān)管和質(zhì)量控制的需要。

傳統(tǒng)的鐵皮石斛鑒別方法主要依據(jù)不同石斛的特征形狀或性狀對石斛的質(zhì)量或真?zhèn)芜M行評價與鑒別[7-8]。然而石斛的外觀極其相似，特別是相關近緣種很難鑒別；如果是加工品如鐵皮楓斗，就更加難以區(qū)分。近些年來，DNA條形碼被廣泛應用到中藥材鑒定中。如方強強等[9]利用ITS2片段對巖陀屬進行PCR擴增和物種鑒定研究。石達理等[10]則通過DNA條形碼對多種龍膽屬植物和藥材進行鑒定。葉子等[11]利用ITS序列對石斛類藥材開展了鑒別研究。而基于DNA條形碼的鑒別方法存在以下缺陷：首先，DNA條形碼技術的種間分辨尚可，但存在種內(nèi)分辨率低的問題，即可以區(qū)分鐵皮石斛與其他石斛，但對于同是鐵皮石斛的不同品系的鑒別存在不足[12-13]；其次，基于DNA條形碼的鑒別方法，需要測序分析，檢測過程繁雜，不利于快速檢測方法的建立。

本研究擬分析鐵皮石斛與其他石斛中ITS2的序列信息，評價ITS2的區(qū)分能力，并尋找鐵皮石斛ITS2中特異的SNP位點，基于SNP位點建立鐵皮石斛的快速鑒別方法，探索鐵皮石斛鑒別方法的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

采集浙江不同地區(qū)具有代表性的鐵皮石斛12種，以及來自廣西和云南的其他石斛10種，所有樣品均來自當?shù)厣a(chǎn)基地，樣品具體信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA 提取

用75%乙醇擦拭所得石斛莖和嫩葉表面，稱取100 mg石斛樣品經(jīng)液氮研磨，采用杭州新景生物公司植物總DNA提取試劑盒提取總DNA，用TE溶解DNA，使用Nanodrop核酸蛋白分析儀測定所提DNA濃度與D260/D280，并通過凝膠電泳判斷DNA的質(zhì)量和完整性，保存于-20 ℃待用。

1.2.2 PCR擴增及產(chǎn)物測序

查閱文獻并結合前期實驗選取DNA條形碼ITS2引物[14](表2)，對全部實驗材料進行PCR 擴增。采用25 μL PCR擴增體系，包括12.5 μL prime STAR@HS Premix(TaKaRa)、上下游引物各1 μL、2 μL DNA 模板、8.5 μL蒸餾水。反應程序為：98 ℃預變性1 min；98 ℃ 變性 10 s， 45 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，共 35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測后，經(jīng)膠回收送生工生物工程(上海)股份公司進行雙向測序。

1.2.3 生物信息學分析

對于測序成功獲得的序列，采用NCBI (National Center for Biotechnology Information)平臺的BLAST工具與數(shù)據(jù)庫進行比對。利用MEGA6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件進行序列比對，采用ClustalW算法，將測序兩端無用序列刪除。種內(nèi)遺傳距離的計算和系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹(Neighbor joining)的構建利用的是 K2P(Kimura 2-parameter)模型，Bootstrap 的次數(shù)設為 1 000次，并自動刪除小于50%的數(shù)值。

1.2.4 SNP位點特異性PCR驗證

根據(jù)序列比對得到的SNP位點，利用Primer5.0軟件設計位點特異性引物(表2)。對所設計的引物擴增條件優(yōu)化，采用溫度梯度的方式進行Tm值確定。選取特異性強、靈敏度高的引物組進行PCR驗證，擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳成像。

表1 材料信息

表2 引物信息

1.2.5 HRM分析

基于ITS2序列分析與PCR驗證結果，分別設計大小為180 bp和53 bp各2對鐵皮石斛HRM引物。首先進行PCR擴增，實驗所配制的反應體系為Prime STAR?HS(Premix)(TaKaRa公司) 12.5 μL，上下游引物各1 μL(10 mmol·L-1)，DNA模板2 μL，ddH2O補足至25 μL。然后用 PCR 儀進行擴增，擴增程序為：98 ℃ 1 min；98 ℃ 15 s，退火15 s，72 ℃ 2 min，34 次循環(huán)；72 ℃ 2 min。HRM 程序溫度設為55～95 ℃，溫度增量為每2 s變化0.1 ℃。數(shù)據(jù)結果通過LightScanner96 軟件分析。

2 結果與分析

2.1 ITS2擴增與序列分析

所選ITS2引物在22個石斛材料中均能擴增，而且擴增條帶單一、明亮(圖1)。直接進行膠回收純化并測序，測序結果顯示，所有擴增產(chǎn)物的測序結果理想，未出現(xiàn)重疊峰、雜峰和無信號等現(xiàn)象，測序成功率為100%。測序所得不同石斛材料中的ITS2序列長度范圍為483～490 bp，經(jīng)MEGA6.0軟件對比后將低質(zhì)量區(qū)和引物部分刪除，保留472 bp的DNA序列作分析數(shù)據(jù)。利用NCBI-BLAST比較，石斛序列均與信息庫的序列同源。經(jīng)分析所測石斛屬ITS2序列堿基組成平均含量為A=21.9%，T=22.7%，G=29.7%，C=25.7%，全序列CG含量分布范圍在55.2%～57.9%。該序列中有保守位點342個，占72.4%；變異位點117個，占24.8%；簡約信息位點51個。從數(shù)量上分析，變異位點約占1/4，變異程度較高，同時該序列具有一定程度保守性?；贗TS2序列構建NJ樹(圖2)，01～12號鐵皮石斛聚為一支，其中鼓槌石斛與鐵皮石斛的親緣關系較近，大包鞘石斛、腫節(jié)石斛、喇叭唇石斛與鐵皮石斛的親緣關系較遠。金釵和重唇石斛聚為一個分支，銅皮、束花和兜唇石斛聚為一個分支，其余石斛各自形成獨立支系，無交叉聚類現(xiàn)象。從聚類結果來看，ITS2可以將鐵皮石斛和其他石斛加以聚類和區(qū)分，與先前的研究結果一致[14]，因此可以利用ITS2來區(qū)分鐵皮石斛與其他石斛。

M，1 000 bp Marker；1～12 ，鐵皮石斛；13，金釵石斛；14，重唇石斛；15，鉤狀石斛；16，銅皮石斛；17，大包鞘石斛；18，束花石斛；19，兜唇石斛；20，喇叭唇石斛；21，腫節(jié)石斛；22，鼓槌石斛。下同。M， 1 000 bp Marker; 1-12， D. officinale; 13， D. nobile; 14， D. hercoglossum; 15， D. aduncum; 16， D. moniliforme; 17， D. wardianum; 18， D. chrysanthum; 19， D. aphyllum; 20， D. lituiflorum; 21， D. pendulum; 22， D. chrysotoxum. The same as below.圖1 二十二種石斛ITS2序列電泳圖Fig.1 The electrophoresis diagram of 22 ITS2 sequences

位于進化樹分支上的數(shù)字表示該分支的支持率；若支持率>50，則說明該分支獨立為不同種。The number on the branch of the evolutionary tree indicated the support rate of the branch; if the support rate was more than 50， it indicated that the branch was independent of different species.圖2 基于ITS2序列構建的NJ樹Fig.2 NJ tree constructed based on ITS2 sequence

對所有序列進行比對發(fā)現(xiàn)，12種浙江鐵皮石斛472 bp的全長序列中，有6個鐵皮石斛樣品(2、3、5、6、9和10)在第317位堿基上有單堿基位點變異現(xiàn)象，由G突變?yōu)镃，另外6個鐵皮石斛和其余石斛在該位點上均為G，同時其他石斛材料在不同位點有不同的變異(圖3)，分析結果表明，ITS2序列存在種內(nèi)變異少、種間變異大的情況。ITS2在鐵皮石斛種內(nèi)高度保守性情況下少量位點的突變，為鐵皮石斛種內(nèi)區(qū)分提供了特異性SNP位點。

2.2 SNP位點PCR驗證

圖3 ITS2序列與及SNP位置Fig.3 ITS2 sequence and SNP position

進一步使用突變擴增體系(amplification refractory mutation system，ARMS)驗證序列比對獲得的SNP位點，將候補SNP位點設計在引物3′端，在距離3′端2個堿基位置設置突變位點C>A，使含變異位點C樣品特異性擴增。擴增結果如圖4所示，其中樣品2、3、5、6、9和10中擴增出條帶，擴增產(chǎn)物為128 bp，其余樣品未能有條帶擴增出，擴增結果與測序比對結果一致，進一步說明ITS2序列在此位置確實有G>C的突變。

2.3 基于HRM的SNP快速分型

ARMS方法雖然可以對突變位點進行檢測，但檢測結果需要電泳分析，過程繁雜，時間長，不利于大量樣品的檢測分析?；诖耍覀兘⒘薍RM對SNP的快速分型方法，HRM根據(jù)DNA序列的長度，GC含量和堿基互補性差異，應用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析，通過引物/模板雙鏈體的解鏈溫度(Tm)值差異和極高的溫度分辨率使分辨精度達到單個堿基差異的區(qū)分。在本研究中，由于12個鐵皮石斛的ITS2序列中只有一個SNP位點，因此我們擴增了2個不同長度區(qū)域(53和180 bp)，SNP位于它們中間，從普通PCR結果來看，在12個鐵皮石斛材料中2個片段都能擴增出來，然而長片段(180 bp)的HRM熔解曲線差異性不明顯，分辨率低；而短片段(53 bp)的HRM熔解曲線差異明顯，可很好地區(qū)分突變和未突變的樣品(圖5)。

M，1 000 bp Marker；1～12，浙江鐵皮石斛；NC，陰性對照。M， 1 000 bp Marker ; 1-12， D. officinale from Zhejiang; NC， Negative control.圖4 位點特異性PCR擴增電泳圖Fig.4 Electrophoresis map of site-specific PCR amplification

A，引物HRM180的電泳圖與高頻率熔解峰圖；B，引物HRM53的電泳圖與高頻率熔解峰圖；M，500 bp Marker；01～12，浙江鐵皮石斛。A， The upper part was the electrophoresis graph with the primer HRM180， and the lower part was the high-frequency melting peak graph; B， The upper part was the electrophoresis graph with the primer of HRM53， and the lower part was the high-frequency melting peak graph; M， 500 bp Marker; 01-12， D. officinale from Zhejiang.圖5 ITS位點G>C的熔解曲線與電泳圖Fig.5 Melting curve and electrophoresis diagram of ITS site G>C

3 討論

目前基于DNA分子的鐵皮石斛鑒定方法主要有DNA分子標記技術(RFLP、RAPD、SSR等)、DNA條形碼技術，以及重測序技術等[15]。這些方法都要求高質(zhì)量的DNA，而鐵皮石斛組織中含有大量多糖、多酚類等物質(zhì)，不易于DNA分離和提取，因此，本研究中的材料均為新鮮組織。有研究表明，3%的CTAB法可以提高DNA的提取質(zhì)量[16]，然而對于鐵皮石斛特別是其加工品的DNA的提取還需要進一步的研究。目前主要植物DNA條形碼有：葉綠體accD、rpoC1、rpoB、ycf5、rbcL、matK、psbA-trnH、psbK-psbI、atpF-atpH和核ITS、ITS2等序列，不同的DNA條形碼對不同材料的鑒別能力也不一樣，包括其擴增性和分類能力。國際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組推薦rbcl+matK組合作為陸生植物的DNA條形碼。中國植物條形碼研究團隊發(fā)現(xiàn)核糖體核DNA條形碼ITS與質(zhì)體DNA條形碼組合，可以顯著提高rbcl+matK組合的分辨率。本研究初步探索了ITS2條形碼對鐵皮石斛及其他石斛的鑒別能力，發(fā)現(xiàn)ITS2條形碼在鐵皮石斛種內(nèi)高度的保守性，同時含有少量的SNP位點，從而為鐵皮石斛的種內(nèi)鑒定提供了新的思路，ITS2序列片段位于核糖體DNA變異較大的基因轉錄間隔區(qū)，同時具有較高的拷貝數(shù)與較快的進化速率，適合作為DNA條形碼。本研究根據(jù)ITS2序列中的一個SNP位點，將12種浙江鐵皮石斛分為2類；若結合其他DNA條形碼的利用，鑒定更多DNA條形碼SNP，可以對不同的鐵皮石斛進行更精細的區(qū)分與鑒定。而基于SNP的鑒別，有利于后期快速鑒別方法的建立。如本研究建立的基于HRM對SNP的快速分型方法可以快速高通量的完成SNP的鑒別。在建立HRM方法過程中，我們發(fā)現(xiàn)針對SNP特別是單一SNP的分型，短片段熔解曲線的分辨率要優(yōu)于長片段，這可能由于如果擴增片段過長，單一SNP位點的差異，不足以引起整個長擴增序列Tm值的差異，而在短片段擴增區(qū)域中可以體現(xiàn)出Tm值的差異，從而更好地區(qū)分。因此，在建立基于HRM的SNP分型方法中，盡量選擇短片段區(qū)域擴增。本研究針對鐵皮石斛中ITS2條形碼及其SNP位點的分析，揭示了植物條形碼中蘊藏著少量特異性的SNP位點，結合SNP快速鑒別方法，有望為鐵皮石斛的快速精準鑒定提供新的思路和方法。