童志超 徐艷群 李 棟 李 莉 羅自生

(1浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2浙江大學(xué)寧波研究院，浙江 寧波 315000；3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058；4浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058)

草莓蛇眼病由草莓球腔菌[Mycosphaerella fragariae(Tul.) Lindau](真菌半知菌亞門柱隔孢屬杜拉柱隔孢Ramularia tulasneiSacc.)侵染所致，主要危害葉片，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)，還可侵染葉柄、果柄、花萼、匍匐莖和果梗，且植株間傳播性強(qiáng)[1-3]。在草莓種植地區(qū)，草莓蛇眼病是一種常見(jiàn)病害，可對(duì)草莓生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。目前，草莓蛇眼病的防治方式主要以化學(xué)藥劑防治為主，生態(tài)防治以及生物防治較少[6]。但化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性，而且果蔬表面和環(huán)境中的農(nóng)藥殘留，易引發(fā)食品安全及環(huán)境污染等問(wèn)題[7-9]。因此，急需研制高效安全的生物農(nóng)藥防治植物病害。

植物自身可以產(chǎn)生多種天然揮發(fā)性物質(zhì)，在植株與環(huán)境、植株與病害以及植株與植株之間的互作中具有重要作用[10-12]。研究表明，病蟲(chóng)害的侵染[13]、高溫[14]、干旱[15]、高鹽[16]等多種生物脅迫或非生物脅迫，均會(huì)引起植物體內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)釋放量的增加，從而增強(qiáng)植株抗逆性，其中萜類和C6 醛類是揮發(fā)性物質(zhì)的主要組成部分。另有研究表明，植物的揮發(fā)性物質(zhì)具有高效的抑菌活性，在植物抗病性方面具有重要作用[17-19]。草莓揮發(fā)性物質(zhì)能夠在體外抑制灰霉病病原菌 (Botrytis cinerea)[20]和炭疽病病原菌(Colletotrichum acutatum)[21]的生長(zhǎng)，但關(guān)于草莓天然揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌抑制作用的報(bào)道尚鮮見(jiàn)。本研究測(cè)定了草莓葉片中的主要揮發(fā)性物質(zhì)成分，并研究了其對(duì)草莓球腔菌的抑菌作用，以期為應(yīng)用環(huán)境友好型天然揮發(fā)性物質(zhì)的新型高效抗菌劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病原菌:草莓球腔菌，分離自草莓葉片上自然生長(zhǎng)的蛇眼病，經(jīng)分離、純化、鑒定后保存?zhèn)溆?，試?yàn)所用孢子為草莓葉片培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)代數(shù)均在4 代以內(nèi)。供試草莓幼苗品種名為阿爾比(Fragaria ×ananassa，Albion)，來(lái)自商業(yè)苗圃(喬司農(nóng)場(chǎng)，杭州)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 用于提取分離揮發(fā)性物質(zhì)的草莓植株培養(yǎng) 采用常用植株培養(yǎng)基，盆栽于植物生長(zhǎng)箱培養(yǎng)(花盆直徑15 cm)，日光照連續(xù)14 h，培養(yǎng)溫度為25±2℃(白天)和15±2℃(晚上)，相對(duì)濕度為50%±5%，采用氮磷鉀(200 mg·L-1的氮，71 mg·L-1的鉀和200 mg·L-1的磷)營(yíng)養(yǎng)液給予草莓充足的營(yíng)養(yǎng)，每周澆營(yíng)養(yǎng)液3 次。每組9 株草莓植株，3 次重復(fù)，培養(yǎng)7 周后收集草莓葉片。

1.2.2 草莓葉片中主要揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定 采用頂空固相微萃取法富集-氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)檢測(cè)草莓葉片中主要的揮發(fā)性物質(zhì)及含量[22]。

取20 g 草莓嫩葉(剛完全展開(kāi))與飽和食鹽水按照1 g ∶2.5 mL 混合并勻漿。稱取3 g 勻漿樣品置于15 mL 頂空瓶中，加入1 μL 300 μL·L-12，6-二甲基-6-庚烯-2-醇作為內(nèi)標(biāo)；40℃攪拌平衡15 min 后，插入DVB/CAR/PDMS 50/30 μm 固相微萃取頭(美國(guó)Supelco)萃取30 min。萃取結(jié)束后，手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣口250℃解析3 min，采用6890 N 氣相系統(tǒng)(美國(guó)Agilent)串聯(lián)MS 檢測(cè)器(5975 B，美國(guó)Agilent)進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱參數(shù):DB-5MS 色譜柱(美國(guó)Agilent):30 m×0.25 mm，0.25 μm；柱溫程序:40℃保持3 min，以2℃·min-1升至64℃，然后以3℃·min-1升至145℃，再以15℃·min-1升至250℃(保留10 min)。各揮發(fā)性組分通過(guò)與質(zhì)譜庫(kù)(NIST05) 以及保留指數(shù)(kovats index，KI)進(jìn)行比對(duì)來(lái)鑒別，通過(guò)內(nèi)標(biāo)定量。

KI 值的測(cè)定:按照上述質(zhì)譜條件的對(duì)正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品C5～C20進(jìn)行GC-MS 分析，記錄各正構(gòu)烷烴保留時(shí)間，根據(jù)線性升溫公式計(jì)算各組分的KI 值[23]:

式中，tx表示被分析組分流出峰的保留時(shí)間，min；tn、tn＋1表示碳原子數(shù)為n 和n＋1 的正構(gòu)烷烴流出峰的保留時(shí)間，min。tn＜tx＜tn＋1。

1.2.3 草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌致病力的影響 取新鮮的剛完全展開(kāi)的草莓嫩葉于90 mm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿1 片葉子，5 個(gè)培養(yǎng)皿為一組，試驗(yàn)重復(fù)3 次。平鋪兩層濾紙于葉片之下，向?yàn)V紙滴加1 mL 水，以保持葉片的濕度和完好的生理狀態(tài)。將濃度為1×105個(gè)·mL-1的草莓球腔菌孢子懸液噴灑于葉片正面和反面進(jìn)行人工接種；接種完成后，在培養(yǎng)皿蓋子內(nèi)部放置一張直徑90 mm 的濾紙，然后分別將30 μL 的揮發(fā)性物質(zhì)滴加在濾紙上，迅速將蓋子蓋回培養(yǎng)皿，并用封口膜密閉封口。設(shè)置萜類[芳樟醇(美國(guó)Sigma，97%)、桃金娘烯醇(美國(guó)Sigma，95%)]的濃度分別為0(對(duì)照)、5、50、100、150 μL·L-1，C6 醛類[己醛(上海阿拉丁，97%)、反式-2-己烯醛(上海阿拉丁，98%)、順式-3-己烯醛(美國(guó)Bedoukian 研究公司，98%)的濃度為0(對(duì)照)、0.5、5、50、500 μL·L-1。將培養(yǎng)皿置于室溫2 h 后將培養(yǎng)皿打開(kāi)，將帶有揮發(fā)性物質(zhì)的濾紙移除，培養(yǎng)皿于無(wú)菌環(huán)境下敞口30 min(充分移除揮發(fā)性物質(zhì))后再封口。室溫下再培養(yǎng)8 d后觀察并記錄草莓葉片的病斑面積。

1.2.4 草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的影響 將100 μL 濃度為5×104個(gè)·mL-1的草莓球腔菌孢子懸液均勻涂布在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)上(每盤7 mL 培養(yǎng)基，約0.15 cm 厚，培養(yǎng)皿直徑為90 mm)，靜置10 min；在培養(yǎng)皿蓋子內(nèi)部放置一張直徑90 mm 的濾紙，然后分別將一定體積的揮發(fā)性物質(zhì)D-檸檬烯(美國(guó)Sigma，95%)、芳樟醇、桃金娘烯醇、己醛、反式-2-己烯醛、順式-3-己烯醛滴加在濾紙上，迅速將蓋子蓋回培養(yǎng)皿，并用封口膜密閉封口。揮發(fā)性物質(zhì)所滴加的體積按照培養(yǎng)皿內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)最終濃度為0、0.05、0.5、5、50、500 μL·L-1進(jìn)行處理。在滴加前用水按將揮發(fā)性物質(zhì)1 ∶10、1 ∶102、1 ∶103、1:104稀釋后，使得不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)滴加相同的體積，不同種類的揮發(fā)性物質(zhì)滴加體積控制在16～50 μL。

培養(yǎng)16 h 后在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取9 個(gè)視野進(jìn)行拍照(放大倍數(shù)為125)，然后利用顯微鏡capture軟件對(duì)視野內(nèi)的各菌體長(zhǎng)軸向總長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定和統(tǒng)計(jì)；每個(gè)視野內(nèi)的菌體個(gè)數(shù)在6 以上，取每個(gè)視野的平均菌體長(zhǎng)度作為一個(gè)平行。菌體伸長(zhǎng)為孢子平均軸向長(zhǎng)度(約41 μm)兩倍以上視為萌發(fā)(＞82 μm)。孢子萌發(fā)率=視野內(nèi)萌發(fā)的孢子個(gè)數(shù)/視野內(nèi)所有的孢子個(gè)數(shù)×100%。對(duì)于16 h 未萌發(fā)的處理組，移除濾紙片，并將培養(yǎng)皿打開(kāi)，在超凈臺(tái)上通風(fēng)1 h 移除揮發(fā)性物質(zhì)，然后再封口培養(yǎng)72 h，觀察孢子萌發(fā)情況；若孢子再次萌發(fā)則該揮發(fā)性物質(zhì)在該濃度下只具有抑制孢子萌發(fā)的作用，若孢子仍未萌發(fā)則視為該揮發(fā)性物質(zhì)在該濃度下具有殺菌作用。

1.2.5 草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌線粒體膜電位的影響 將100 μL 濃度為5×104個(gè)·mL-1的草莓球腔菌孢子懸液均勻涂布在PDA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d 后，按照1.2.3 中的方法進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸處理16 h。芳樟醇、桃金娘烯醇處理濃度分別設(shè)為0(對(duì)照)、5、50、500 μL·L-1，己醛、反式-2-己烯醛、順式-3-己烯醛處理濃度分別設(shè)為0(對(duì)照)、0.5、5、50 μL·L-1。由于前期1.2.4 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)D-檸檬烯濃度高達(dá)500 μL·L-1時(shí)才對(duì)草莓球腔菌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，而高濃度對(duì)草莓葉片有明顯損傷，因此后續(xù)試驗(yàn)未進(jìn)行D-檸檬烯處理。處理結(jié)束后，從各組中挑取菌絲，利用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)對(duì)菌絲的線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)。熒光強(qiáng)度通過(guò)共聚焦顯微鏡(SP8，萊卡，德國(guó))進(jìn)行檢測(cè)，最終線粒體膜電位結(jié)果以紅色熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)525 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm)與綠色熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm) 的比值表示。10 μmol·L-1的CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑處理作為陽(yáng)性對(duì)照(CCCP 處理會(huì)使得菌絲線粒體膜電位完全喪失)，水處理作為空白對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定 3 次。方差分析(ANOVA)采用SAS 9.4 軟件的一般線性模塊(Proc GLM)進(jìn)行分析。各組之間進(jìn)一步采用最小顯著性差異分析(least significant difference，LSD)，P＜0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓葉片中的主要揮發(fā)性物質(zhì)

草莓葉片經(jīng)GC-MS 檢測(cè)其總離子流色譜圖如圖1 所示，利用NIST05 質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行檢索并對(duì)比揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)(KI)進(jìn)行定性，利用面積歸一化計(jì)算草莓葉片中主要揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)百分含量，結(jié)果如表1 所示。在草莓葉片中共檢測(cè)出12 種主要揮發(fā)性物質(zhì)，其中含量最高的是萜類和醛類，共占總量的95.58%。其中萜類物質(zhì)有3 種，分別是桃金娘烯醇、芳樟醇和少量D-檸檬烯，約占總量的6.09%；C6 醛類物質(zhì)主要包括2-己烯醛、己醛、反式-2-己烯醛、順式-3-己烯醛等，占總量的89.72%。萜類、醛類揮發(fā)性物質(zhì)具有抗菌活性[24]，以草莓葉片中這些揮發(fā)性物質(zhì)的自然含量為參考設(shè)定后續(xù)試驗(yàn)濃度，探究草莓葉片中天然存在的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌的抗菌活性。

圖1 草莓葉片總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatography of the volatile of strawberry leaves

2.2 草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌致病力的影響

適當(dāng)濃度的萜類、C6 醛類揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸處理能減小草莓蛇眼病病斑面積(圖2)。當(dāng)萜類揮發(fā)性物質(zhì)處理濃度為5、50 μL·L-1時(shí)均能減小草莓葉片蛇眼病的病斑面積，其中處理濃度為50 μL·L-1時(shí)效果最好，幾乎完全抑制了病原菌的侵染。C6 醛類揮發(fā)性物質(zhì)中反式-2-己烯醛處理濃度為0.5、5 μL·L-1時(shí)均能減小草莓蛇眼病的病斑面積，其中0.5 μL·L-1效果最好；己醛和順式-3-己烯醛最優(yōu)處理濃度為5 μL·L-1，同時(shí)0.5 和50 μL·L-1濃度處理對(duì)于病害的發(fā)生也具有一定的防治效果。然而，過(guò)高濃度的揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸處理會(huì)對(duì)草莓葉片造成損害，當(dāng)萜類揮發(fā)性物質(zhì)濃度為150 μL·L-1時(shí)，草莓葉片病斑面積反而增加；此外，當(dāng)萜類揮發(fā)性物質(zhì)濃度為150 μL·L-1、C6 醛類揮發(fā)性物質(zhì)中反式-2-己烯醛濃度為50 μL·L-1及更高、己醛和順式-3-己烯醛濃度為500 μL·L-1時(shí)，葉片出現(xiàn)褐紅色，8 d 后葉片幾乎全部被草莓球腔菌侵染，均出現(xiàn)菌斑。

表1 草莓葉片中主要揮發(fā)性物質(zhì)及其含量Table 1 Main volatile substances and contents in strawberry leaves

圖2 揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌侵染草莓葉片的抑制作用Fig.2 Inhibition of volatile substances on strawberry leaves infected by Mycosphaerella fragariae

2.3 草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌孢子萌發(fā)的影響

在正常情況下，草莓球腔菌孢子能夠萌發(fā)與生長(zhǎng)(圖3-B)。揮發(fā)性物質(zhì)能夠抑制菌絲生長(zhǎng)(圖3-C)的最低濃度為最低抑菌濃度；適當(dāng)濃度的揮發(fā)性物質(zhì)能夠抑制孢子的萌發(fā)，但移除揮發(fā)性物質(zhì)后能夠繼續(xù)萌發(fā)(圖3-D)，此時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的濃度為抑菌濃度；揮發(fā)性物質(zhì)濃度過(guò)高，能完全殺死草莓球腔菌，即使移除揮發(fā)性物質(zhì)孢子仍不萌發(fā)，此時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的濃度為殺菌濃度。

由表2 可知，在適當(dāng)濃度下，草莓葉片揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸對(duì)草莓球腔菌孢子萌發(fā)具有顯著抑制作用(P＜0.05)，且隨著濃度的升高，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用也隨之增強(qiáng)。不同揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌孢子萌發(fā)的抑制濃度不同，D-檸檬烯抑菌濃度為500 μL·L-1，遠(yuǎn)大于草莓葉片中檢測(cè)到的濃度且氣味過(guò)于強(qiáng)烈，芳樟醇、桃金娘烯醇抑菌濃度為50 μL·L-1，己醛、順式-3-己烯醛抑菌濃度為5 μL·L-1，反式-2-己烯醛抑菌濃度為0.5 μL·L-1，該濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)孢子萌發(fā)的抑制達(dá)到了顯著水平(P＜0.05)。芳樟醇、桃金娘烯醇?xì)⒕鷿舛葹?00 μL·L-1，己醛殺菌濃度為50 μL·L-1，反式-2-己烯醛、順式-3-己烯醛殺菌濃度為5 μL·L-1，該濃度下具有殺死病原菌的效果，草莓球腔菌孢子萌發(fā)率幾乎為0，熏蒸處理后即使移除揮發(fā)性物質(zhì)，孢子也不再萌發(fā)。

圖3 不同生長(zhǎng)狀態(tài)的草莓球腔菌形態(tài)圖Fig.3 Morphology of Mycosphaerella fragariae in different growth states

表2 草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌子萌發(fā)的影響Table 2 Effect of main volatile substances in strawberry leaves on spore germination of Mycosphaerella fragariae

2.4 草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌菌絲生長(zhǎng)的影響

如圖4 所示，在適當(dāng)?shù)臐舛认?，草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸能顯著抑制草莓球腔菌菌絲的生長(zhǎng)，且隨著濃度的升高，抑制效果越好。由表2 可知，D-檸檬烯最低抑菌濃度為500 μL·L-1，芳樟醇最低抑菌濃度為5 μL·L-1，桃金娘烯醇最低抑菌濃度為50 μL·L-1，己醛、反式-2-己烯醛最低抑菌濃度為0.05 μL·L-1，順式-3-己烯醛最低抑菌濃度為0.5 μL·L-1時(shí)，該濃度下各揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用均達(dá)到顯著水平。當(dāng)D-檸檬烯濃度達(dá)到500 μL·L-1，芳樟醇、桃金娘烯醇濃度達(dá)到50 μL·L-1，己醛、順式-3-己烯醛達(dá)到5 μL·L-1，反式-2-己烯醛濃度達(dá)到0.5 μL·L-1時(shí)，能夠完全抑制菌絲生長(zhǎng)。

圖4 草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of main volatile substances in strawberry leaves on mycelial growth of Mycosphaerella fragariae

2.5 草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌線粒體膜電位的影響

草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸會(huì)影響草莓球腔菌的線粒體膜電位(圖5)，與菌絲生長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)，隨著萜類、C6 醛類揮發(fā)性物質(zhì)濃度的升高，草莓球腔菌菌絲的線粒體膜電位逐步下降，表明其可通過(guò)破壞草莓球腔菌的線粒體膜，進(jìn)而影響菌體的生長(zhǎng)。當(dāng)所采用的3 種C6 醛類揮發(fā)性物質(zhì)和2 種萜烯類揮發(fā)性物質(zhì)濃度達(dá)到50 μL·L-1時(shí)，菌絲的膜電位均較正常生長(zhǎng)顯著降低。當(dāng)芳樟醇濃度達(dá)到500 μL·L-1，反式-2-己烯醛的濃度達(dá)到50 μL·L-1時(shí)，菌絲的線粒體膜電位幾乎完全喪失，與10 μmol·L-1CCCP 處理結(jié)果無(wú)顯著差異，表明此時(shí)已經(jīng)完全破壞草莓球腔菌線粒體。

3 討論

圖5 草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌線粒體膜電位的影響Fig.5 Effect of main volatile substances in strawberry leaves on mitochondrial membrane potential of Mycosphaerella fragariae

綠色植物葉片中主要的揮發(fā)性物質(zhì)，也被稱為“綠色葉片揮發(fā)性物質(zhì)”(green leaf volatile，GLV)，主要包括C6 醇類、醛類、萜烯類及乙酸酯類化合物[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，草莓葉片中的揮發(fā)性物質(zhì)主要是萜類和醛類化合物，尤其是C6 醛類，如2-己烯醛、己醛、反式-2-己烯醛、順式-3-己烯醛，占主導(dǎo)地位，其次為萜類化合物，主要包括芳樟醇、桃金娘烯醇及少量D-檸檬烯。這與Ceuppens 等[29]關(guān)于草莓花器官揮發(fā)性成分的研究結(jié)果類似。不同植物的揮發(fā)性成分有所差異，但主要均是醇類、醛類和萜烯類物質(zhì)，如葡萄葉片中順式-3-己烯醇和反式-2-己烯醛的含量較高[30]，番茄植株中順式-3-己醇與乙酸、丙酸等形成的揮發(fā)性酯含量較高[31]。

植物葉片中的揮發(fā)性物質(zhì)是一種重要的誘導(dǎo)防御機(jī)制，能抑制植物病原菌的生長(zhǎng)和繁殖[28]。Marei等[24]研究了多種單萜類揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)植物病原菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)S-檸檬烯對(duì)病原菌具有較好的抑菌效果。本研究發(fā)現(xiàn)，草莓葉片中的萜類揮發(fā)性物質(zhì)(芳樟醇、桃金娘烯醇)，以及C6 醛類揮發(fā)性物質(zhì)(己醛、反式-2-己烯醛、順式-3-己烯醛)，在適當(dāng)濃度下具有顯著抑制草莓球腔菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的作用。不同類型的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌抑制效果不同，其中在同一濃度下C6 醛類的抑菌效果普遍好于萜類揮發(fā)性物質(zhì)，其抑制草莓蛇眼病的最低熏蒸濃度相差最少一個(gè)數(shù)量級(jí)。反式-2-己烯醛的抑菌效果最好，當(dāng)其濃度達(dá)到0.5 μL·L-1時(shí)，對(duì)孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，而D-檸檬烯濃度則需要達(dá)到500 μL·L-1。Arroyo 等[21]研究了8 種草莓脂氧合酶途徑產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓炭疽病病原菌的體外抑制作用，也發(fā)現(xiàn)反式-2-己烯醛是對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制效果最好的一種揮發(fā)性物質(zhì)，與本研究結(jié)果一致。

Arroyo 等[21]通過(guò)掃描電鏡發(fā)現(xiàn)GLV 體外處理可以改變真菌細(xì)胞壁和細(xì)胞器的正常形態(tài)。本試驗(yàn)研究草莓葉片主要揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)草莓球腔菌線粒體膜電位的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)反式-2-己烯醛、己醛、順式-3-己烯醛、芳樟醇和桃金娘烯醇濃度達(dá)到50 μL·L-1時(shí)，這些揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸處理較對(duì)應(yīng)揮發(fā)性物質(zhì)溶劑處理(空白對(duì)照)會(huì)顯著降低菌絲的線粒體膜電位；繼續(xù)提高揮發(fā)性物質(zhì)濃度(反式-2-己烯醛濃度達(dá)50 μL·L-1)時(shí)，能完全破壞草莓球腔菌線粒體膜。表明揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸處理能夠通過(guò)破壞線粒體膜電位來(lái)影響草莓球腔菌的能量代謝和呼吸鏈傳遞，從而干擾細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。

本研究中，草莓葉片中萜類揮發(fā)性物質(zhì)芳樟醇、桃金娘烯醇及D-檸檬烯濃度為50 μL·L-1，己醛濃度為5 μL·L-1，反式-2-己烯醛濃度為0.5 μL·L-1，順式-3-己烯醛濃度為5 μL·L-1時(shí)，利用揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸均能夠表現(xiàn)出較好的抑菌效果且對(duì)葉片無(wú)任何損傷。但濃度過(guò)高則會(huì)對(duì)草莓葉片帶來(lái)?yè)p害，處理后的葉片會(huì)出現(xiàn)褐紅色，8 d 后葉片幾乎全部被草莓球腔菌侵染，這可能是由于揮發(fā)性物質(zhì)能夠使草莓葉片細(xì)胞受到損害，從而導(dǎo)致葉片更容易受到病原菌的侵染[32]。Neri等[33]研究發(fā)現(xiàn)葉片受損時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)在受損部位濃度會(huì)上升，病原菌可感知葉片的受損傷部位信息，而病原菌可能會(huì)利用揮發(fā)性物質(zhì)傳遞的信號(hào)，從而更容易侵入。

4 結(jié)論

本研究表明，草莓葉片中主要揮發(fā)性物質(zhì)是萜類化合物以及C6 醛類化合物。采用草莓葉片中的天然揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸對(duì)草莓蛇眼病具有較好的抑菌效果，芳樟醇、桃金娘烯醇最低熏蒸濃度為50 μL·L-1，己醛最低熏蒸濃度為5 μL·L-1，反式-2-己烯醛最低熏蒸濃度為0.5 μL·L-1，順式-3-己烯醛最低熏蒸濃度為5 μL·L-1，此濃度下?lián)]發(fā)性物質(zhì)能夠有效抑制草莓球腔菌的侵入，表現(xiàn)出較好的抑菌效果且對(duì)草莓葉片無(wú)明顯損傷，具有良好的應(yīng)用前景。草莓葉片中主要揮發(fā)性物質(zhì)能有效抑制草莓球腔菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，并使其線粒體膜電位下降。本研究為應(yīng)用環(huán)境友好型、綠色無(wú)污染天然揮發(fā)性物質(zhì)有效抗菌劑提供了依據(jù)。