姜孝成,周詩(shī)琪

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410081)

種質(zhì)資源(germplasm resources)是生物遺傳信息的載體,是現(xiàn)代種業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力和農(nóng)業(yè)科技原始創(chuàng)新的物質(zhì)基礎(chǔ),是保障國(guó)家糧食、生態(tài)及能源安全的重要戰(zhàn)略性資源[1]。為避免種質(zhì)資源的丟失,有必要對(duì)其安全保存[2]。種子是種質(zhì)資源保存的重要載體,但生理成熟后的種子在貯藏過(guò)程中質(zhì)量會(huì)不可逆轉(zhuǎn)地逐漸下降,這種變化稱為老化或劣變(aging or deterioration)。種子因老化而面對(duì)外界脅迫挑戰(zhàn)的脆弱性增加,種子活力降低[3]。種子老化程度因貯藏條件不當(dāng)特別是高溫高濕條件而不斷加重[4～5]；在此期間,種子內(nèi)部會(huì)發(fā)生一系列有害變化,例如種皮機(jī)械耐性下降[6]、細(xì)胞膜損傷、蛋白質(zhì)變性、DNA損傷和突變、核酸合成系統(tǒng)破壞等[7～9],最終導(dǎo)致種子活力的喪失。如果種子在貯藏過(guò)程中老化或活力下降的問(wèn)題得不到解決,就會(huì)造成種子萌發(fā)遲緩、生長(zhǎng)勢(shì)差、抗逆性弱、生物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量降低,從而影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展,特別是高通量測(cè)序技術(shù)和各種組學(xué)技術(shù)等的更新?lián)Q代,在種子活力或抗老化能力方面的分子機(jī)制研究取得了顯著進(jìn)展,本文進(jìn)行了相關(guān)綜述,試圖為進(jìn)一步利用分子生物學(xué)技術(shù)手段提高農(nóng)作物種子活力或抗老化能力,高效保存種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1 主要農(nóng)作物種子活力或抗老化能力相關(guān)QTLs和候選基因鑒定

生物中大多數(shù)可見(jiàn)性狀的遺傳變異是受多基因控制的,這些性狀被稱為數(shù)量性狀,控制數(shù)量性狀的單個(gè)基因座(individual loci)即稱為QTL(quantitative trait loci)。種子活力即是由多基因控制的數(shù)量性狀,適合QTL分析[10～15]。QTL分析首先根據(jù)某標(biāo)記基因?qū)⒋郎y(cè)群體劃分為不同的基因型類別,然后使用相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析來(lái)確定某個(gè)基因型的個(gè)體與其他基因型的個(gè)體在所測(cè)量的性狀(表型)方面是否存在顯著差異；如果表型顯著不同,即被認(rèn)為影響該性狀的基因與標(biāo)記基因連鎖；然后對(duì)整個(gè)基因組中的其他標(biāo)記基因重復(fù)該分析過(guò)程,以檢測(cè)出盡可能多的與該性狀連鎖的標(biāo)記基因。由于無(wú)法確定該性狀是否是與標(biāo)記基因連鎖的一個(gè)或多個(gè)基因相關(guān),因此創(chuàng)造了數(shù)量性狀基因座(QTL)一詞來(lái)描述對(duì)數(shù)量性狀有顯著影響的染色體區(qū)域(通常通過(guò)與標(biāo)記基因的連鎖來(lái)定義)[16]。確定一個(gè)QTL是否由一個(gè)或多個(gè)基因組成一直是數(shù)量遺傳學(xué)中最困難的工作之一。近年來(lái),水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)等主要農(nóng)作物中與種子活力或抗老化相關(guān)的QTLs及候選基因鑒定備受關(guān)注。

1.1 水稻種子活力或抗老化能力相關(guān)QTLs和候選基因鑒定

雜交水稻自1976年開(kāi)始商業(yè)化種植,目前已覆蓋中國(guó)水稻總種植面積的50%以上。但雜交水稻種子由于貯藏耐性差或貯藏措施不當(dāng)而導(dǎo)致種子質(zhì)量下降,嚴(yán)重影響水稻生產(chǎn)的情況時(shí)有發(fā)生。因此,了解水稻種子活力或抗老化能力的分子機(jī)制,培育出種子貯藏耐性好的雜交水稻基因型至關(guān)重要[17～18]。Li等[18]使用來(lái)自粳稻 CJ06 和秈稻TN1的雜交后代的DH(double haploid)株系群體,在12條染色體上檢測(cè)到19個(gè)與種子活力相關(guān)的QTLs,其中與萌發(fā)率相關(guān)的QTL qGP9定位在9號(hào)染色體(chromosome 9,Chr9)上。幼苗活力是種子活力的表現(xiàn)之一,直接影響水稻的健壯成苗。Xie等[19]使用秈稻珍汕97和明恢63雜交的重組近交系(recombinant inbred lines,RILs)定位了8個(gè)與種子活力相關(guān)的QTLs,其中,qSV-1、qSV-5b、qSV-6a、qSV-6b和qSV-11影響幼苗建成,qSV-5a、qSV-5c和 qSV-8僅影響發(fā)芽；此外,qSV-1、qSV-5b、qSV-6a、qSV-6b 和 qSV-8 是低溫特異性QTLs。Abe等[20]利用來(lái)自粳稻Kakehashi和Dunghan Shali雜交的RILs,鑒定到4個(gè)與苗高相關(guān)的QTLs,其中,控制苗高的qPHS3-2定位于Chr3長(zhǎng)臂末端,并在該位點(diǎn)預(yù)測(cè)到一個(gè)與赤霉素(gibberellin,GA)生物合成相關(guān)的候選基因——OsGA20ox1。Jin 等[21]以野生稻(Oryza longistaminata)與秈稻9311雜交后,再以9311作為輪回親本得到的BC2F20回交株系(backcross inbred lines,BILs)為材料,運(yùn)用基因組重測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因分型,檢測(cè)到與種子活力相關(guān)的36個(gè)QTLs；其中,老化過(guò)程中種子萌發(fā)能力相關(guān)的q9GR8.1與q9GP8.1擁有相同的定位,該位點(diǎn)包含8個(gè)候選基因(MH08g0-020600、MH08g0020700、MH08g0020800、MH08g-0020900、MH08g0021000、MH08g0021100、MH08-g0021200和MH08g0021-300)；老化處理種子萌發(fā)后的幼苗長(zhǎng)度相關(guān)的q9SL1.1與q3SL1.1和q6SL1.1有相同定位,該位點(diǎn)鑒定到15個(gè)候選基因(MH01g0725700、MH01g0725800、MH01g0725-900、MH01g0726000、MH01g0726100、MH01g072-6200、MH01g0726300、MH01g0726400、MH01g07-26500、MH01g0726600、MH01g0726700、MH01g0-726800、MH01g0726900、MH01g0727000 和 MH-01g0727100)。Sasaki等[22]從來(lái)自 Milyang23/Akihikari的RILs,檢測(cè)到了4個(gè)與種子壽命相關(guān)的QTLs(RC7、RC9-1、RC9-2 和 RC9-3)。Jiang等[23]從來(lái)自Milyang23/Tong88-7和Dasanbyeo/TR22-183的兩組RILs,發(fā)現(xiàn)了8個(gè)與種子貯藏耐性相關(guān)的 QTLs(qMT-SGC1.1、qMT-SGC5.1、qMTSGC7.1、qMT-SGC7.2、qMT-SGC9.1、qDT-SGC2.1、qDT-SGC3.1 和 qDT-SGC9.1)。Li等[24]利用 Koshihikari/Kasalath的BILs種子,鑒定到位于Chr2、Chr3、Chr4、Chr6、Chr9 和 Chr11 上與種子貯藏耐性相關(guān)的 6 個(gè) QTLs(qSS-2、qSS-3、qSS-4、qSS-6、qSS-9 和 qSS-11)。Miura 等[11]使用 Nip-ponbare/Kasalath的BILs,在Chr2、Chr4和Chr9上鑒定到3個(gè)與種子壽命相關(guān)的QTLs(qLG-2、qLG-4和qLG-9)。Zeng等[25]利用來(lái)自秈粳雜交ZYQ8/JX17的DH株系，檢測(cè)到分別位于 Chr9、Chr11和Chr12上的與種子貯藏耐性相關(guān)的3個(gè)QTLs(qLS-9、qLS-11和qLS-12)。Xue 等[26]使用來(lái)自秈粳雜交IR24/Aso-minori的RILs,獲得了分別位于Chr1、Chr3和Chr9上與種子貯藏耐性相關(guān)的3個(gè)QTLs(qRGR-1、qRGR-3 和 qRGR-9)。Lin 等[27]使用以N22作為共同親本的Nanjing35(ja-ponica)/N22//Nanjing35的BILs和USSR5(japoni-ca)/N22的 RILs,在Chr1、Chr2、Chr5、Chr6 和 Chr9 上鑒定到7個(gè)QTLs,包括兩個(gè)群體種子所共有的qSSn-9,只存在于 BILs的 qSSnj-2-1、qSSn-2-2、qSSn-5、qSSn-6和只存在于RILs的qSSn-1。Hang等[28]利用Sasanishiki(粳稻)/Habataki(秈稻,有強(qiáng)貯藏耐性)//Sasanishiki的 BILs,在 Chr1、Chr2、Chr3、Chr4、Chr5、Chr7、Chr11 和 Chr12上鑒定到與種子貯藏耐性相關(guān)的13個(gè)QTLs,其中兩個(gè)QTLs(qSSh-2-1和qSSh-2-2)與自然和人工老化均相關(guān),4個(gè) QTLs(qSSh-4、qSSs-5-1、qSSs-5-2和 qSSh-12)和 7 個(gè) QTLs(qSSh-1、qSSh-3-1、qSSh-3-2、qSSh-3-3、qSSh-7-1、qSSh-7-2 和 qSSh-11)分別與自然和人工老化相關(guān)。Yuan等[29]利用粳稻Nipponbare和秈稻9311的雜交后代的BILs,鑒定到位于 Chr1、Chr2、Chr3、Chr8、Chr9 和 Chr11 上與種子貯藏耐性相關(guān)的7個(gè)QTLs(qSS1、qSS2、qSS3.1、qSS3.2、qG6S8、qG6S9 和 qG6S11),其中qSS1被證實(shí)與種子貯藏耐性的改良有關(guān),qSS3.1為種子貯藏耐性和抗氧化脅迫能力所共有；并從qSS3.1中篩選到1個(gè)編碼脂肪酸羥化酶的候選基因OsFAH2,過(guò)表達(dá)OsFAH2能降低種子中脂質(zhì)過(guò)氧化和提高種子貯藏耐性。

1.2 小麥、玉米和大豆等農(nóng)作物種子活力或抗老化能力相關(guān)QTLs和候選基因鑒定

當(dāng)前,小麥、玉米和大豆等農(nóng)作物中與種子活力或抗老化能力相關(guān)的QTLs也有報(bào)道。Shi等[30]利用小麥Hanxuan 10×Lumai 14雜交后代的DH品系,挖掘出與種子活力相關(guān)的49個(gè)QTLs,分別定位 于1B、2D、3A、3B、3D、4A、4D、5A、5B、5D、6D和7A等12條染色體上,并從Chr5B上分布的13 個(gè) QTLs(QGEe5B、QGIe5B、QSLc5B、QSLd5B、QSLf5B、QRLd5B、QRLe5B、QRLf5B、QVId5B、QVIe5B、QVIf5B、QSVId5B 和 QSVIe5B)鑒定到 7 個(gè)候選基因(gRAESCS5B01G564900、gRAESCS5B0-1G5642 00、gRAESCS5B01G562600、graesCS5B02-G562700、gRAESCS5B01G561300、gRAESCS5B01-G561400和gRAESCS5B01G562100),這些基因主要參與調(diào)節(jié)老化種子萌發(fā)期間的碳水化合物和脂質(zhì)代謝,轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞分裂等。Han等[31]基于兩個(gè)玉米雜交組合Yu82×Shen137和Yu537A×Shen137,通過(guò)單粒系選法獲得兩類F10RIL群體,鑒定到與種子活力相關(guān)的65個(gè)QTLs,其中61個(gè)QTLs被整合為18個(gè)meta-QTLs(mQTLs)(用Bio-Mercator 2.1對(duì)每條染色體上的QTLs進(jìn)行整合分析,當(dāng)整合得到的某個(gè)QTL簇是兩類RIL群體共有時(shí)稱為1個(gè)mQTL),并從13個(gè)mQTLs(mQTL1-1、mQTL1-2、mQTL3-1、mQTL3-2、mQTL3-3、mQTL3-4、mQTL4-2、mQTL4-3、mQTL5-2、mQTL6-1、mQTL6-2、mQTL7-1 和 mQTL7-2)中鑒定到與玉米種子活力相關(guān)的24個(gè)候選基因(226532762、224061823、242056533、195605946、162459222、327195227、302810918、At1g45050、224143836、162459414、At5g19550、AT5G51440、195658029、226508796、At3g04120、326509331、AT1G57720、At5g67360、45238345、At1g70730、AT1G09640、226247007、AT1-G56340 和 AT3G21720),它們主要參與糖酵解途徑和蛋白質(zhì)代謝；且推測(cè)mQTL2、mQTL3-2、mQTL3-4和mQTL5-2的染色體區(qū)域可能是與種子活力相關(guān)的熱區(qū)(hot spots)。Zhang等[32]以大豆品種Zhengyanghuangdou×Meng 8206(ZM6)與 Linhefenqingdou × Meng 8206(LM6)雜交的兩個(gè)RILs為材料,共鑒定出11條染色體上與種子貯藏耐性相關(guān)的34個(gè)QTLs,其中21個(gè)QTLs分布在 4條染色體(Chr3、Chr5、Chr17和 Chr18)上5個(gè)QTL簇中,位于Chr17和Chr5的兩個(gè)簇上的QTLs的密度最高,各有7個(gè)QTLs(qrGR-17-1、qr-GR-17-2、qrFW-17-1、qrFW-17-2、qrGR-17-3、qrSL-17-1 和 qrFW-17-3)和 6 個(gè)QTLs(qGR-5-1、qGR-5-2、qFW-5-1、qGR-5-3、qFW-5-2 和qrSL-5-1),分別被定義為QTL hotspot A和QTL hotspot B。研究人員從這兩個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域中已篩選到與種子發(fā)育、萌發(fā)和休眠,種皮形成,脂肪酸/脂質(zhì)代謝過(guò)程和種子貯藏耐性等相關(guān)的19個(gè)候選基因(Glyma05g25030、Glyma05g25320、Glyma05g25460、Glyma05g25970、Glyma05g26150、Glyma05g26830、Glyma05g27190、Glyma05g27240、Glyma05g27250、Glyma05g28250、Glyma05g28950、Glyma05g29190、Glyma05g28030、Glyma05g28720、Glyma17g36080、Glyma17g36620、Glyma17g36730、Glyma17g37090和Glyma17g37110),但這些候選基因調(diào)控種子活力或抗老化能力的分子作用機(jī)制及哪個(gè)或哪些是關(guān)鍵基因或主效基因、彼此間是否存在相互作用等尚未見(jiàn)報(bào)道。

2 GWAS和多組學(xué)分析優(yōu)化種子活力或抗老化能力相關(guān)QTLs和候選基因

2.1 GWAS用于鑒定種子活力或抗老化能力相關(guān)QTLs和候選基因

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)是以研究對(duì)象的基因組中大量單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)為分子遺傳標(biāo)記,通過(guò)將SNPs與某數(shù)量性狀進(jìn)行連鎖作圖,來(lái)獲得該性狀的QTLs的分析方法。與QTL連鎖分析相比,GWAS通常使用大量不相關(guān)的多樣化種質(zhì)為試驗(yàn)材料,以增加等位基因和單倍型的多樣性,從而克服了QTL分析只能在特定F2代的雜交親本之間或RIL群體內(nèi)進(jìn)行等位基因多樣性分析,以及遺傳圖譜分辨率受到重組株系數(shù)量限制的缺點(diǎn)[33～34]。近年來(lái),GWAS在種子抗老化能力的分子機(jī)制研究上已得到廣泛應(yīng)用。

Renard等[35]對(duì)經(jīng)自然老化和加速老化處理后的270個(gè)自然變異的擬南芥(Arabidopsis thaliana)種質(zhì)的種子進(jìn)行GWAS分析,確定了多個(gè)與種子壽命相關(guān)的基因區(qū)域,在Columbia生態(tài)型中鑒定到20個(gè)與種子活力相關(guān)的候選基因,其中7個(gè)(PSAD1、SSLEA、SSTPR、DHAR1、CYP86A8、MYB-47和SPCH)與種子壽命正相關(guān),5個(gè)(RBOHD、RBOHE、RBOHF、KNAT7 和 SEP3)與種子壽命負(fù)相關(guān)；且證明氧化脅迫相關(guān)的RBOHs(NADPH氧化酶基因)、DHAR1(脫氫抗壞血酸還原酶基因)和PSAD1(光系統(tǒng)Ⅰ亞基基因)在種子老化過(guò)程中扮演主要角色,CYP86A8(細(xì)胞色素P-450羥化酶基因)和轉(zhuǎn)錄因子基因(MYB47、KNAT7 和 SEP3)在種子老化過(guò)程中對(duì)種皮有保護(hù)作用。

通過(guò)GWAS分析,熊豆[36]從271份水稻種質(zhì)中共檢測(cè)到48個(gè)種子貯藏耐性相關(guān)SNPs,其中,3個(gè)SNPs與人工老化處理相關(guān)聯(lián),45個(gè)SNPs與自然老化相關(guān)聯(lián)；同時(shí),從其中兩個(gè)SNPs dd110-00467(Chr11_21953047)和id11008475(Chr11_22-000109)的上、下游各100 kb區(qū)域內(nèi)鑒定到控制水稻種子貯藏耐性的兩個(gè)候選基因Os011g37640和Os011g37730,它們?cè)诎l(fā)芽率高的材料中的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于發(fā)芽率低的品種。Lee等[37]從299個(gè)秈稻種質(zhì)中鑒定到與種子壽命相關(guān)的8個(gè)候選基因(Os03g51050、Os04g01160、Os04g01280、Os09g37250、Os11g01439、Os03g06890、Os03g069-00和Os03g03870),它們主要參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、糖代謝、活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除以及胚胎和根發(fā)育過(guò)程等。Wu等[38]從456個(gè)不同水稻種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了9個(gè)新的QTLs(qSS1-1、qSS1-2、qSS2-1、qSS3-1、qSS5-1、qSS5-2、qSS7-1、qSS8-1和 qSS11-1),其中,qSS1-2和 qSS8-1分別與已報(bào)道的qSS1/OsGH3-2和OsPIMT1共定位；并發(fā)現(xiàn)這些QTLs可以很好地解釋為何水稻秈亞種的種子的貯藏耐性優(yōu)于粳亞種的種子。最近,Yuan等[39]通過(guò)對(duì)不同水稻種質(zhì)的種子進(jìn)行GWAS分析發(fā)現(xiàn),吲哚-3-乙酸(IAA)-酰胺合成酶基因(GRETCHEN HAGEN3-2,OsGH3-2)是一個(gè)種子貯藏耐性相關(guān)基因,OsGH3-2主要在發(fā)育的種子中表達(dá)并催化IAA與氨基酸結(jié)合,使其形成無(wú)活性的生長(zhǎng)素；OsGH3-2的過(guò)表達(dá)顯著降低種子的貯藏耐性,而基因敲除或敲低增強(qiáng)種子的貯藏耐性；OsGH3-2可能通過(guò)調(diào)節(jié)脫落酸(abscisic acid,ABA)信號(hào)途徑作為種子貯藏耐性的負(fù)調(diào)節(jié)因子。Shi等[40]對(duì)478個(gè)不同水稻品種的種子在鹽脅迫條件下的萌發(fā)相關(guān)性狀進(jìn)行GWAS分析,鑒定到11個(gè)與耐鹽性顯著相關(guān)的QTLs,其中位于Chr2的一個(gè)QTL包含兩個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因OsNRT2.1和OsNRT2.2,其表達(dá)受到鹽脅迫的影響。Magwaa等[41]對(duì)350個(gè)水稻indica、japonica和Aus亞型品種的種子休眠特性進(jìn)行GWAS分析,鑒定到16個(gè)SNPs與新鮮收獲種子的萌發(fā)率相關(guān)聯(lián),38個(gè)SNPs與后熟種子的萌發(fā)率相關(guān)聯(lián)(其中3個(gè)也是存在于新鮮收獲種子中的SNPs)；在新鮮收獲種子中,有3個(gè)關(guān)聯(lián)SNPs與GA/IAA鈍化基因GA2ox3、EUI1和GH3-2以及休眠基因Sdr4距離約100 kb；在后熟種子中,有1個(gè)關(guān)聯(lián)SNP毗鄰ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因ABI5。

胚芽鞘長(zhǎng)的小麥品種對(duì)于深播種植有積極意義。然而,對(duì)GA不敏感的矮化基因Rht-B1b和Rht-D1b的廣泛使用不利于培育具有胚芽鞘長(zhǎng)的矮化小麥品種。Li等[42]對(duì)893個(gè)小麥品種進(jìn)行GWAS分析,鑒定到8個(gè)胚芽鞘長(zhǎng)度相關(guān)QTLs(QCL.stars-4DC1、QCL.stars-4BS1、QCL.stars-2DC1、QCL.stars-2DS1、QCL.stars-5BL1、QCL.stars-1BS1、QCL.stars-4BS2和QCL.stars-5B/5D),且證明Rht-B1b和Rht-D1b的表達(dá)顯著降低胚芽鞘長(zhǎng)度。種子活力也影響幼苗的根系統(tǒng)建成(root system archi-tecture,RSA),該性狀對(duì)于農(nóng)作物在脅迫條件下的水分和養(yǎng)分利用十分重要。Alemu等[43]對(duì)192個(gè)小麥品種進(jìn)行GWAS分析,鑒定到38個(gè)RSA相關(guān)QTLs,其中 4個(gè)QTLs(EPdwRGA-6A、EPdwRDW-4A、EPdwiTGW-3B.1和 EPdwIRW-5A)特別是 EP-dwRGA-6A可能對(duì)RSA起關(guān)鍵作用。

Nagel等[44]通過(guò)對(duì)175個(gè)大麥(Hordeum vulgare)品種的種子進(jìn)行GWAS分析,發(fā)現(xiàn)了基因型、非生物和生物脅迫影響種子老化和壽命的107個(gè)標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)(marker trait associations,MTAs)；未發(fā)現(xiàn)種子老化與脂溶性生育酚、油、淀粉和蛋白質(zhì)含量之間存在相關(guān)性；而長(zhǎng)期干燥貯藏或人工老化處理的種子中,水溶性谷胱甘肽和相關(guān)硫醇轉(zhuǎn)化為二硫化物,表明其細(xì)胞內(nèi)變得更具氧化性；不同貯藏和老化方式影響細(xì)胞內(nèi)pH和生化過(guò)程進(jìn)而導(dǎo)致種子老化；此外,種子響應(yīng)老化處理或貯藏耐性似乎受到母本環(huán)境(maternal environment)和遺傳背景的顯著影響。

Huang等[45]對(duì) 650個(gè)燕麥(Avena sativa)株系種子活力相關(guān)性狀進(jìn)行GWAS分析,獲得根、芽性狀相關(guān)QTLs分別為34個(gè)和16個(gè),各對(duì)應(yīng)于41個(gè)和16個(gè)SNPs；其中5個(gè)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的序列與水稻、短柄草和玉米的同源序列匹配,且3個(gè)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的序列與種子活力相關(guān)的基因匹配,分別是葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶基因(Os01g067550-0、Bradi2g46410 和 Zm00001d043879)、包含線粒體載體蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白編碼基因(Os03g0191100、Bradi1g71800、Zm00001d048218 和 Zm00001d02-8008)和鐵硫簇蛋白基因(Os06g0146400d、Bradi-1g51010.1d 和 Zm00001d036145)。

Upadhyaya等[46]對(duì)242份高粱(Sorghum bicolor)種質(zhì)進(jìn)行GWAS分析,發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(Locus 7-2)與種子的低溫發(fā)芽顯著相關(guān),該位點(diǎn)與高粱耐寒性相關(guān)的QTL qSbCT07.10共定位[47],并鑒定到1個(gè)編碼CBL(calcineurin B-like protein)-互作蛋白激酶的候選基因(007G140900),該基因與水稻Chr8上的耐冷性基因LOC_Os08g34240高度同源[48～49],其小麥同源基因(TaCIPK14)在煙草中過(guò)表達(dá)時(shí),能提高煙草種子的耐寒性和發(fā)芽率[50]。

通過(guò)GWAS分析,Tan等[51]從520個(gè)油菜(Brassica napus)品種中鑒定到干旱和鹽脅迫條件下23個(gè)SNPs關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與種子萌發(fā)率相關(guān),20個(gè)SNPs關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與種子萌發(fā)指數(shù)相關(guān),其中,位于Chr_C08的SNP關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與鹽和干旱響應(yīng)基因BnaC08g41070距離3.32 kb,位于Chr_A4的SNP關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與干旱響應(yīng)基因BnaA04g02620D距離2.20 kb,位于Chr_C06的SNP關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與干旱響應(yīng)基因BnaC06g01910D重疊；此外,還鑒定到37個(gè)與干旱和鹽脅迫下種子萌發(fā)率或萌發(fā)指數(shù)相關(guān)的候選基因,且這些候選基因大多數(shù)調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脯氨酸生物合成,或編碼泛素連接酶(ubiquitin ligase)E3。Hatzig等[52]從248個(gè)油菜品種中鑒定到幾個(gè)候選基因所在的基因組區(qū)間與種子萌發(fā)率、萌發(fā)速率、幼苗生長(zhǎng)和千粒重等性狀相關(guān)聯(lián),且其中有些是擬南芥基因SCO1(SNOWY COTYLEDON 1)、ARR4(ARABIDOPSIS TWO-COMONENT RES-PONSE REGULATOR 4)和ATE1(ARGINYL-t-RNA PROTEIN TRANSFERASE 1)的同源基因。Luo等[53]基于442個(gè)油菜品種在低溫和正常溫度條件下的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)特性差異,鑒定到22個(gè)與種子活力的低溫脅迫耐性顯著關(guān)聯(lián)的QTLs,并從中篩選到62個(gè)候選基因,這些基因的功能涉及DNA修復(fù)、RNA翻譯、線粒體激活和能量產(chǎn)生、蛋白質(zhì)的泛素化和降解、抗氧化系統(tǒng)以及植物激素和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,其中最值得關(guān)注的有BnaA03g40290D、BnaA06g07530D、BnaA0-9g06240D、BnaA09g06250D和BnaC02g10720D等。

2.2 多組學(xué)分析鑒定種子活力或抗老化能力相關(guān)基因及其代謝途徑

種子活力或抗老化能力的多組學(xué)(multi-omics)分析包括全基因組水平上的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、降解組學(xué)和代謝組學(xué)分析等,可全面鑒定相關(guān)基因及其代謝途徑[54]。

2.2.1 基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定種子活力或抗老化能力相關(guān)基因及其代謝途徑

迄今為止,已有大量與種子活力相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究報(bào)道。

Li等[55]通過(guò)對(duì)壽命長(zhǎng)短不一的兩個(gè)玉米株系的種子進(jìn)行人工老化處理前后的轉(zhuǎn)錄組比較分析,從差異表達(dá)基因中挖掘出13個(gè)可能與種子壽命相關(guān)的基因(GRMZM2G058970、GRMZM2G3-02913、GRMZM2G358618、GRMZM2G375807、GRMZM2G379913、GRMZM2G379929、GRMZM2G43-8938、GRMZM5G867767、GRMZM2G181135、GRMZM5G800586、GRMZM5G877838、GRMZM2G07-4604和GRMZM5G824439),其中11個(gè)基因在Chr3上,2個(gè)基因在Chr5上,10個(gè)基因有注釋信息。Gu等[56]對(duì)20個(gè)含油量不同的油菜品種種子進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)整合分析,鑒定到165個(gè)差異蛋白質(zhì)；含油量高的種子具有較高的代謝活性,尤其是含硫氨基酸代謝；31個(gè)特有基因在高含油量和低含油量種子的萌發(fā)過(guò)程中表現(xiàn)出顯著差異,其中13個(gè)基因(BnaC-01g43710D、BnaC-06g19960D、BnaC06g20420D、BnaA07g20290D、B-naA07g20210D、BnaA06g16950D、BnaC04g42010-D、BnaC06g09330D、BnaC03g70070D、BnaA07g33-310D、BnaC06g38200D、BnaC06g14990D 和 BnaC-06g14670D)可能與種子萌發(fā)活力相關(guān)。

針對(duì)具有不同活力水平的擬南芥種子的比較蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明,蛋白質(zhì)合成能力、貯藏物質(zhì)動(dòng)員和細(xì)胞解毒作用相關(guān)蛋白質(zhì)與種子活力密切相關(guān)[57]。Catusse等[58]分別對(duì)吸水促萌和人工老化處理獲得的不同活力的甜菜種子進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)有18個(gè)蛋白質(zhì)在吸水促萌處理時(shí)上調(diào),老化處理時(shí)下調(diào),且老化處理后再經(jīng)吸水促萌處理時(shí)又上調(diào)；另有11個(gè)蛋白質(zhì)則表現(xiàn)出相反的豐度變化。這些蛋白質(zhì)涉及脂類和淀粉的動(dòng)員、蛋白質(zhì)合成或甲基循環(huán)等代謝途徑,乙醛酸酶、異檸檬酸裂解酶、蛋白質(zhì)合成能力以及ABA信號(hào)途徑等相關(guān)的蛋白質(zhì)被認(rèn)為可能是種子活力的主要參與者。雜交水稻和白楊種子的蛋白組學(xué)研究也發(fā)現(xiàn),能量代謝、細(xì)胞防御和修復(fù)相關(guān)蛋白質(zhì)、貯藏蛋白、胚乳中與貯藏物代謝分解相關(guān)的酶、蛋白質(zhì)合成與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白質(zhì)等在種子人工老化后變化很明顯,特別是胚中的糖酵解相關(guān)酶類以及丙酮酸脫氫酶和乙醇脫氫酶在種子老化期間豐度顯著增加,暗示它們與種子活力變化有關(guān)[59～60]。大豆種子的發(fā)育通常對(duì)高溫和高濕敏感,Wei等[61]研究發(fā)現(xiàn),種子發(fā)育階段對(duì)高溫高濕耐性不同的兩個(gè)品種在子葉、胚和葉中分別有120、144和438個(gè)豐度差異蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)功能主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝、光合作用、蛋白質(zhì)加工、折疊和組裝、蛋白質(zhì)生物合成或降解、植物-病原體相互作用、淀粉和蔗糖代謝以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等代謝途徑和細(xì)胞過(guò)程,且高耐品種的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、上述代謝途徑和生理生化變化較小。Chen等[62]對(duì)不同含水量的燕麥種子在不同溫度條件下處理一定時(shí)間的蛋白質(zhì)組和生理生化變化進(jìn)行比較和關(guān)聯(lián)分析,獲得21個(gè)豐度有顯著差異的蛋白質(zhì),其中包括隨種子老化而下調(diào)的19個(gè)蛋白質(zhì)和上調(diào)的2個(gè)蛋白質(zhì)；下調(diào)蛋白質(zhì)中有6個(gè)熱激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和2個(gè)ATP合酶,參與碳水化合物和能量代謝、平衡其他蛋白質(zhì)的合成與降解等；上調(diào)蛋白質(zhì)中有1個(gè)是精氨基琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthase),參與脯氨酸合成,可維持細(xì)胞中ROS穩(wěn)態(tài),對(duì)于種子的熱脅迫抗性十分重要。另有研究表明,OsHSP18.2(Ⅱ類胞質(zhì)HSP)是一個(gè)老化反應(yīng)蛋白質(zhì),在人工老化處理的水稻種子中豐度顯著上調(diào)；OsHSP18.2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在種子成熟后期顯著增加,在干種子中含量很高,而在種子發(fā)芽后急劇減少。生化分析表明,OsHSP18.2通過(guò)形成同源十二聚體,作為分子伴侶發(fā)揮作用,可防止檸檬酸合酶的熱失活,因此研究者認(rèn)為OsHSP18.2可能通過(guò)限制ROS積累來(lái)保護(hù)和穩(wěn)定細(xì)胞中酶的結(jié)構(gòu)和功能,使其免受不可逆損傷,在種子成熟干燥、老化和萌發(fā)過(guò)程中,提高種子活力、壽命和有利于幼苗建成[63]。Wang等[64]研究了花生萌發(fā)種子胚軸不同部位脫水耐性及其蛋白質(zhì)組學(xué)差異,發(fā)現(xiàn)一些特殊的LEA(late embryogenesis abundant)蛋白、脫水素(dehydrin)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin)、脂氧合酶 3(LOX3)、ABA 響應(yīng)蛋白以及脫毒反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)等的豐度與胚軸不同部位的脫水耐性高度相關(guān)。

miRNAs也參與種子活力或抗老化能力的調(diào)控,其中miR164c的表達(dá)與種子活力負(fù)相關(guān),而miR168a的表達(dá)與種子活力正相關(guān)[65]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析和基因-蛋白質(zhì)互作分析,研究人員發(fā)現(xiàn)miR164c通過(guò)其靶基因PSK5和TIL1調(diào)控核心基因RPS27AA,后者通過(guò)其下游的六大類功能蛋白質(zhì),包括脅迫響應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、胚發(fā)育、絲氨酸內(nèi)肽酶抑制劑、能量代謝和“其他”關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì),共同調(diào)控水稻種子活力或抗老化能力[66]。

2.2.2 代謝組學(xué)分析鑒定種子活力或抗老化能力相關(guān)的代謝標(biāo)志物

代謝組學(xué)(metabonomics/metabolomics)分析指對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析,以探討代謝物與生物體生理病理變化的關(guān)系。近期,該技術(shù)已被用于鑒定種子老化程度或種子壽命的代謝標(biāo)志物(metabolic markers)。

種子引發(fā)(seed priming)是改善種子活力的重要措施。最近,基于納米材料的小尺寸和獨(dú)特的物理化學(xué)特性,納米引發(fā)物開(kāi)始應(yīng)用于種子萌發(fā)特性的改良。比如,使用洋蔥(Allium cepa)提取物作為還原劑合成銀、金納米顆粒,以及使用食品工業(yè)副產(chǎn)品柑橘籽油和去除姜黃素后的姜黃油樹(shù)脂制備納米乳液,用于引發(fā)洋蔥種子,可增加種子發(fā)芽率和出苗率；代謝組學(xué)研究表明,納米材料引發(fā)處理后洋蔥種子和幼苗中的ABA和順式-(+)-12-氧代植物二烯酸(cis-(+)-12-oxo-phytodienoic acid)的產(chǎn)生受到顯著抑制,萌發(fā)促進(jìn)物如γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)和玉米素(zeatin)的含量則增加[67]。適當(dāng)濃度的激動(dòng)素處理苜蓿(Medicago truncatula)種子可加速其萌發(fā),但會(huì)傷害幼苗生長(zhǎng)。采用非靶向代謝組學(xué)(non-targeted metabolomics)分析經(jīng)水和0.5 mmol/L激動(dòng)素分別浸泡2 h和8 h的苜蓿種子以及胚根伸出階段種子中的代謝物組成,結(jié)果表明,無(wú)論是水或激動(dòng)素浸泡處理,五磷酸肌醇、胍丁胺、二半乳糖基甘油、六磷酸肌醇和油酰膽堿等是3個(gè)不同處理的種子中主要的差異代謝物；27種代謝物的平均相對(duì)含量在激動(dòng)素與水處理之間形成顯著差異,但僅發(fā)生在胚根伸出階段；這些代謝物消耗可能與種子更快的發(fā)芽有關(guān)；較長(zhǎng)時(shí)間暴露于激動(dòng)素引起的DNA損傷或基因毒性損傷(genotoxic injury)可能是激動(dòng)素傷害幼苗生長(zhǎng)的原因[68]。

Chen等[69]對(duì)來(lái)自4個(gè)不育系和4個(gè)恢復(fù)系的16個(gè)雜交水稻組合的種子進(jìn)行人工老化和自然老化處理后的代謝組學(xué)分析,共鑒定出56個(gè)代謝物,其中大多數(shù)與初級(jí)代謝有關(guān)；在種子老化過(guò)程中,半乳糖、葡萄糖酸、果糖和甘油的含量顯著增加；絕對(duì)定量結(jié)果表明,在不同老化處理下,半乳糖和葡萄糖酸與種子的發(fā)芽率極顯著負(fù)相關(guān)；棉子糖的相對(duì)含量在種子貯藏過(guò)程中變化不大,但與人工老化種子的發(fā)芽率顯著正相關(guān)。Min等[70]將正常組和人工老化組人參種子均用赤霉素處理后,使用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析比較兩組樣品之間的代謝物變化,確定了44種內(nèi)源性代謝物,其中9種含量呈顯著差異的代謝物可作為預(yù)測(cè)人參種子壽命的潛在標(biāo)志物。

2.2.3 降解組學(xué)分析鑒定種子活力或抗老化能力相關(guān)的miRNAs及其靶基因

降解組測(cè)序(degradome sequencing)主要針對(duì)miRNA介導(dǎo)的mRNA剪切片段進(jìn)行測(cè)序,從而篩選miRNA作用的靶基因。降解組學(xué)分析已用于鑒定與種子活力或抗老化相關(guān)miRNAs及其靶基因。Gong等[71]分別對(duì)正常的和人工老化處理2 d的玉米種子進(jìn)行miRNA測(cè)序,共發(fā)現(xiàn)27個(gè)差異表達(dá)的miRNAs,其中10個(gè)被RT-qPCR證實(shí)；降解組測(cè)序共鑒定到1 142個(gè)可能被131個(gè)miRNAs切割的靶轉(zhuǎn)錄本,其中9個(gè)差異表達(dá)的miRNAs的26個(gè)靶基因可能在種子活力調(diào)控中發(fā)揮作用。Huang等[72]分別對(duì)二倍體水稻和四倍體水稻的種子進(jìn)行老化處理,結(jié)果表明,四倍體水稻種子的抗老化能力強(qiáng)于二倍體水稻種子。降解組測(cè)序發(fā)現(xiàn),Osa-miR164d的靶基因轉(zhuǎn)錄本的降解片段只在四倍體水稻種子中檢測(cè)到,推測(cè)OsamiR164d可能通過(guò)調(diào)控靶基因的差異表達(dá)參與調(diào)控水稻種子抗老化能力,該結(jié)果與本研究室關(guān)于miR164c調(diào)控水稻種子活力的作用機(jī)制[65～66]一致。

3 種子活力或抗老化相關(guān)基因的功能及其分子作用機(jī)制研究

基因編輯技術(shù)是研究基因生物學(xué)功能的主要手段,包括過(guò)表達(dá)(overexpression)轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除或敲減技術(shù)(knockout/knockdown)、基因沉默(RNAi)技術(shù)等[73～75]。這些技術(shù)在種子活力或抗老化能力相關(guān)基因的功能及其分子作用機(jī)制研究中發(fā)揮了重要作用。

3.1 活性氧毒性清除相關(guān)基因的功能及其分子作用機(jī)制

種子在脫水、貯藏和萌發(fā)過(guò)程中,不斷地產(chǎn)生有毒副產(chǎn)品ROS,導(dǎo)致種子劣變以致壽命下降。ROS的毒性源于其不加區(qū)別地與細(xì)胞中幾乎所有組分如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等發(fā)生反應(yīng)。由ROS引起的基因組傷害被認(rèn)為是種子老化的重要原因之一,如引起DNA中形成7,8-二氫-8-氧鳥(niǎo)嘌呤(7,8-dihydro-8-oxoguanine,8-oxo-G),該產(chǎn)物在DNA復(fù)制過(guò)程中與腺嘌呤而不是胞嘧啶形成堿基對(duì),從而導(dǎo)致GC→TA顛換。有研究表明,擬南芥中的AtOGG1參與堿基切除修復(fù),清除DNA中的8-oxo-G。AtOGG1的轉(zhuǎn)錄本在種子干燥和萌發(fā)吸水過(guò)程中顯著上調(diào),同時(shí)在轉(zhuǎn)基因種子中8-oxo-G含量下降,提示過(guò)表達(dá)該基因增強(qiáng)了種子的非生物脅迫耐性,延緩老化,進(jìn)而延長(zhǎng)種子壽命[76]。另外,在許多植物中,1-Cys過(guò)氧化物酶(1-cys peroxiredoxin,1-Cys Prx,也稱為PER1)是一類種子專一性抗氧化劑,可保護(hù)半胱氨酸殘基免受ROS的傷害。Chen等[77]從荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)種子中鑒定和表征了NnPER1蛋白,NnPER1能夠保護(hù)DNA免受ROS的切割,NnPER1的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)積累在種子干燥、吸漲以及非生物脅迫處理期間增加；NnPER1在擬南芥中的異位表達(dá)可提高擬南芥種子的壽命和抗老化能力,且轉(zhuǎn)基因種子中ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化水平顯著低于野生型種子。

3.2 脂氧合酶基因的功能及其分子作用機(jī)制

膜脂的過(guò)氧化和自由基的增殖是種子活力下降的兩個(gè)重要原因[10]。脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是催化不飽和脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶之一,隨著LOX活性的增加,不飽和脂肪酸的水平降低,脂肪酸被氧化,形成自由基,然后種子迅速變質(zhì)[14]。LOX家族的一些成員在種子萌發(fā)過(guò)程中起到降解脂質(zhì)的作用。在種子貯藏過(guò)程中,由于LOX活性增強(qiáng),不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng),會(huì)直接導(dǎo)致種子活力降低和谷物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)變差,因此LOX與種子壽命和抗老化能力關(guān)系密切,通過(guò)RNAi技術(shù)降低種子中LOX活性可以提高種子的抗老化能力[78]。比如,與野生型相比,過(guò)表達(dá)OsLOX2水稻株系的種子在正常條件下萌發(fā)加速,貯藏過(guò)程中種子加速老化,活力加速降低；而OsLOX2的RNAi導(dǎo)致種子發(fā)芽延遲和壽命延長(zhǎng),但Os-LOX2活性受到強(qiáng)烈抑制的RNAi株系的種子在加速老化后完全失去發(fā)芽能力,因此若既要不影響正常條件下種子發(fā)芽,又能延緩貯藏中種子的老化進(jìn)程,適當(dāng)抑制OsLOX2的表達(dá)可能是必要的[79]。另有研究報(bào)道,缺失脂氧合酶LOX3的水稻種子在貯藏過(guò)程中的抗老化能力比LOX3正常的水稻種子強(qiáng)；OsLOX3反義構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因水稻種子的胚乳中OsLOX3表達(dá)下調(diào)、OsLOX mRNA水平顯著降低,LOX3的活性即將亞油酸轉(zhuǎn)化為9-氫過(guò)氧十八碳二烯酸(9-hydroperoxyoctadecadienoic acid,9-HPOD)的能力顯著低于野生型種子,該轉(zhuǎn)基因植株表型和生命周期正常,但種子的貯藏耐性得到改善[80]。

3.3 乙醛脫氫酶基因和醛-酮還原酶基因的功能及其分子作用機(jī)制

水稻的乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase 7,OsALDH7)可能通過(guò)解毒脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的醛,從而維持種子活力。OsALDH7的T-DNA插入突變體受非生物脅迫顯著影響,突變體種子在干燥和貯藏過(guò)程中,胚乳有類黑素(melanoidin)積累；與野生型相比,突變體種子對(duì)人工老化處理更敏感,并且積累更多的丙二醛[81]。在種子貯藏過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化介導(dǎo)產(chǎn)生的還原性羰基化合物(reactive carbonyl compounds,RCC)也是細(xì)胞毒性物質(zhì)之一,其積累會(huì)降低種子活力。醛酮還原酶(aldo-ketoreductase,AKR1)對(duì)RCC的解毒作用能夠延長(zhǎng)種子壽命,AKR1過(guò)表達(dá)的水稻和煙草種子的抗老化能力明顯高于野生型[82]。

3.4 L-異戊烯基甲基轉(zhuǎn)移酶基因的功能及其分子作用機(jī)制

非生物脅迫會(huì)加速細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)中異天冬氨酰(isoAsp)殘基的形成,從而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。L-異戊烯基甲基轉(zhuǎn)移酶(protein L-isoaspartyl methyltransferase,PIMT)通過(guò)將有害的isoAsp殘基恢復(fù)為功能性天冬氨酰殘基來(lái)修復(fù)其他蛋白質(zhì)[83]。該酶在植物中有兩個(gè)不同的編碼基因—PIMT1和PIMT2。早在1993年,即有報(bào)道PIMT可能與小麥種子的生活力有關(guān)[84]。擬南芥種子中PIMT1含量增加可降低蛋白質(zhì)中isoAsp殘基的積累,使種子壽命延長(zhǎng)和活力提高；相反,PIMT1含量減少時(shí),新鮮的干燥成熟種子的蛋白質(zhì)中isoAsp殘基的積累量增加,導(dǎo)致種子對(duì)老化處理的敏感性提高和在脅迫發(fā)芽條件下種子活力喪失[85]。不同PIMT亞型的生化活性有差異,在發(fā)育、成熟以及暫時(shí)靜止?fàn)顟B(tài)的正常水稻種子中高活性PIMT是必需的[86]。Wei等[87]從水稻中克隆到兩個(gè)PIMT基因——OsPIMT1和OsPIMT2,翻譯產(chǎn)物OsPIMT2主要存在于綠色組織的葉綠體和細(xì)胞核中,而OsPIMT1在種子胚中大量積累；OsPIMT1突變株系的種子對(duì)人工老化高度敏感,而過(guò)表達(dá)株系的種子中減少了isoAsp殘基的積累,種子活力增強(qiáng),人工老化21 d的過(guò)表達(dá)株系種子的發(fā)芽率與野生型相比提高9%～15%；來(lái)自O(shè)sPIMT1 RNAi株系的種子在胚中過(guò)度積累isoAsp殘基,種子發(fā)芽能力快速喪失。同樣,人工老化處理后的鷹嘴豆(Cicer arietinum)種子發(fā)芽率顯著降低,種子中CaPIMT活性也降低；進(jìn)一步研究表明,CaPIMT2可使核蛋白中的異常isoAsp殘基得到修復(fù),而CaPIMT1主要在細(xì)胞質(zhì)部分修復(fù)此類異常蛋白質(zhì),從而增強(qiáng)種子活力和壽命[88]。

3.5 生育酚(維生素E)基因的功能及其分子作用機(jī)制

生育酚(tocopherols或vitamin E,維生素E)是植物合成的一類親脂性抗氧化劑,在種子中含量特別高。Simontacch等[89]發(fā)現(xiàn)大豆胚軸中α-tocopherol含量隨種子所處的外界氧化脅迫條件而發(fā)生變化,高活力或抗氧化能力強(qiáng)的種子中α-tocopherol含量也高。Sattler等[90]在擬南芥中分離并表征了兩個(gè)維生素E基因(VTE1和VTE2),這兩個(gè)基因的突變都會(huì)導(dǎo)致組織中生育酚缺乏；但兩者作用機(jī)制有區(qū)別,vte1破壞生育酚環(huán)化酶活性并積累氧化還原生物合成中間產(chǎn)物,而vte2破壞尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶(homogentisate phytyltransferase)的活性,不積累中間產(chǎn)物；與野生型相比,這兩個(gè)基因中任何一個(gè)突變均會(huì)導(dǎo)致種子壽命大大降低。

3.6 金屬硫蛋白基因和熱激蛋白基因的功能及其分子作用機(jī)制

金屬硫蛋白(metallothioneins,MTs)是一類能夠結(jié)合金屬離子的低相對(duì)分子質(zhì)量、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì),主要參與生物體內(nèi)重金屬離子的穩(wěn)態(tài)維持和活性氧的清除反應(yīng)。在植物中,HSPs極其豐富和多樣,并且與多種非生物脅迫逆境有關(guān)。周玉亮[91]研究蓮MTs和HSPs的生物學(xué)功能時(shí)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá) NnMT2a、NnMT3或 NnHSP17.5的擬南芥種子與野生型種子相比表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗人工老化的能力。Yuan等[92]研究發(fā)現(xiàn),在水稻中,Os-MT2b(MET-ALLOTHIONEIN2b)優(yōu)先在水稻未成熟穗、萌發(fā)胚的盾片和側(cè)根原基中表達(dá),且細(xì)胞分裂素下調(diào)其表達(dá)；在OsM-T2b過(guò)表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因植株中,內(nèi)源細(xì)胞分裂素——異戊烯基腺苷(isopentenyladenosine)的含量差異表明,OsMT2b可能通過(guò)反饋調(diào)節(jié)內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平而參與水稻根發(fā)育和種子胚萌發(fā)的調(diào)控。

4 展望

在貯藏過(guò)程中,種子老化或活力下降是不可避免的,每年農(nóng)作物種子因老化而給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[93]。近十多年來(lái),分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于種子活力或抗老化能力領(lǐng)域的研究,取得了顯著進(jìn)展,越來(lái)越多的種子抗老化相關(guān)基因得到發(fā)掘和克隆。對(duì)這些基因的生物學(xué)功能、基因之間的相互作用及其分子調(diào)控機(jī)制的研究,將有助于闡明種子活力或抗老化能力的分子調(diào)控機(jī)制；在分子設(shè)計(jì)育種中,通過(guò)基因編輯技術(shù)對(duì)獲得的優(yōu)良基因進(jìn)行整合和開(kāi)發(fā)利用,可望培育出種子抗老化的農(nóng)作物新品種,從而確保種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存,以及滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)高質(zhì)量種子的需求。