郭振華，喬松林，鄧瑞廣，張改平,2,3*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450002；3.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

哺乳動(dòng)物口腔液(oral fluids，OF)是一種由唾液和黏膜滲出液組成的混合液體，包含多種電解質(zhì)、蛋白、酶類、抗菌因子和糖蛋白等，同時(shí)也含有通過(guò)齒齦溝和毛細(xì)血管進(jìn)入口腔的血清滲出液等[1]。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，口腔液已廣泛用于疾病診斷和病原微生物、激素及藥物等的檢測(cè)[2]；在獸醫(yī)領(lǐng)域，最早于1905年就有俄羅斯學(xué)者利用馬口腔液開展疫病診斷的報(bào)道[3]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，最早的報(bào)道見(jiàn)于1976年利用豬口腔液開展豬瘟抗體檢測(cè)的研究[3]。2010年以來(lái)，隨著對(duì)豬口腔液作為生物檢材的系統(tǒng)研究，口腔液在豬群健康監(jiān)測(cè)和疫病病原檢測(cè)中才逐漸得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]。豬口腔液作為抗體和病原檢測(cè)的有效檢材，與傳統(tǒng)生物檢材如血液和組織相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，包括采集極為方便、簡(jiǎn)易，對(duì)豬群無(wú)應(yīng)激，少量樣品就可以代表較大的動(dòng)物群體，更為經(jīng)濟(jì)有效[6-7]。目前，豬口腔液已廣泛用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)[8]、豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)[9]、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)[10]、豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)[10]、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)[11]、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)[12]、豬沙門氏菌(SwineSalmonella)[13]、豬支原體(Mycoplasmasuis)[14]等重要病原的臨床監(jiān)測(cè)。

鑒于口腔液成分相對(duì)較為復(fù)雜，目前關(guān)于病毒核酸在口腔液中穩(wěn)定性的相關(guān)報(bào)道較少。本研究利用PRV和PRRSV評(píng)估核酸保護(hù)劑和溫度對(duì)口腔液中病毒核酸穩(wěn)定性的影響，以期為口腔液樣品的正確保存和運(yùn)輸提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 口腔液采集 豬口腔液采自河南鶴壁某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)12周齡左右的豬群。具體方法如下：取直徑1.6 cm、長(zhǎng)度約1.2 m的純棉繩一條，懸掛于欄位的一側(cè)，繩子一端的高度在豬的肩部，以豬方便咬到為宜。讓豬咬繩子約20 min～30 min左右，將繩子潤(rùn)濕的一端放入收集袋中，用力擠壓，以≥2 mL為有效采樣量，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室?？谇灰簶悠? 000 r/min離心3 min，除去大的顆粒物，取上清分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要儀器 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。核酸保護(hù)劑和口腔液按照1∶1體積比進(jìn)行混合，然后分別加入5 × 103TCID50的PRV或者1 × 105TCID50的PRRSV培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置PBS對(duì)照組，分別在4 ℃和室溫條件下保存，在保存后的第1、2、3、4、7天分別收取200 μL樣品，置-80 ℃冰箱備用。

表1 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

表2 本研究所用引物信息

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 所獲得的數(shù)據(jù)利用GraphPad Prim 7進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)。*表示P<0.05；**表示P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 核酸保護(hù)劑對(duì)口腔液中病毒核酸穩(wěn)定性的影響

含有PRRSV或PRV的口腔液，在4 ℃和室溫條件下分別進(jìn)行保存，在指定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，然后利用熒光定量PCR技術(shù)評(píng)估各組樣品中PRRSV或PRV的核酸拷貝數(shù)。如圖1所示，核酸保護(hù)劑組(DNA/RNA shield)和PBS組相比，在4 ℃條件下保存1 d后，PRRSV核酸含量要比對(duì)照組高10倍～20倍(圖1A)，PRV核酸含量則要高6倍～40倍(圖1B)；而在室溫條件下保存1 d后，PRRSV核酸含量要比對(duì)照組高40倍～60倍(圖1C)，而PRV的核酸含量則要高100倍～200倍(圖1D)。病毒核酸含量在PBS組和核酸保護(hù)劑組之間存在顯著差異。結(jié)果表明，核酸保護(hù)劑可以有效保護(hù)口腔液中的病毒核酸不被降解。

A.PRRSV/4 ℃;B.PRV/4 ℃;C.PRRSV/室溫;D.PRV/室溫A.PRRSV/4 ℃;B.PRV/4 ℃;C.PRRSV/Room temperature;D.PRV/Room temperature

2.2 溫度對(duì)口腔液中病毒核酸穩(wěn)定性的影響

核酸保護(hù)劑(DNA/RNA shield)組(圖2A和圖2C)和PBS對(duì)照組(圖2B和圖2D)分別在保存1、2、3 d時(shí)采集樣品，然后利用熒光定量PCR評(píng)估樣品中PRRSV和PRV的核酸含量。結(jié)果如圖2所示。當(dāng)添加核酸保護(hù)劑時(shí)，樣品在4 ℃或者在室溫條件保存1 d～3 d，PRRSV和PRV的核酸含量都基本一致(圖2A和圖2C)，各組之間差異不顯著；而在PBS對(duì)照組，樣品在4℃和室溫保存1d后，4 ℃條件下的PRRSV和PRV的核酸含量要比室溫條件下高10倍左右(圖2B和圖2D)。結(jié)果表明低溫條件可以有效延緩病毒核酸的降解，當(dāng)加入核酸保護(hù)劑時(shí)，基本可以克服溫度對(duì)樣品保存過(guò)程中核酸穩(wěn)定性的影響。

A.PRRSV/核酸保護(hù)劑;B.PRRSV/PBS;C.PRV/核酸保護(hù)劑;D.PRV/PBSA.PRRSV/Nucleic acids shield;B.PRRSV/PBS;C.PRV/Nucleic acids shield;D.PRV/PBS

2.3 核酸保護(hù)劑對(duì)不同核酸提取試劑盒提取核酸效率的影響

核酸保護(hù)劑是一種強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，為進(jìn)一步評(píng)估核酸保護(hù)劑的使用是否能夠兼容不同公司的核酸提取試劑盒。本研究針對(duì)同一份樣品，分別用配套的核酸提取產(chǎn)品(ZYMO RESEARCH)和TaKaRa公司的核酸提取產(chǎn)品，進(jìn)行病毒核酸的提取，然后利用熒光定量PCR分別評(píng)估PRRSV和PRV的核酸含量。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)使用TaKaRa公司(T company)的核酸提取產(chǎn)品時(shí)，與核酸保護(hù)劑自帶的核酸提取產(chǎn)品(Z company)相比，PRRSV和PRV的核酸得率基本一致，二者之間無(wú)顯著差異。

A.PRRSV;B.PRV

3 討論

傳統(tǒng)意義上豬病的臨床診斷和豬群健康監(jiān)測(cè)，主要以豬的血液和組織作為臨床檢測(cè)材料，采集過(guò)程中對(duì)豬的應(yīng)激較大，且耗時(shí)費(fèi)力，當(dāng)檢測(cè)樣本量大時(shí)又面臨高昂的費(fèi)用成本，且樣品采集有一定的技術(shù)要求。針對(duì)以上問(wèn)題，體液檢測(cè)或者豬的排泄物、分泌物等越來(lái)越被獸醫(yī)技術(shù)人員和養(yǎng)殖生產(chǎn)者所青睞。其中豬口腔液具有采樣簡(jiǎn)便易行、對(duì)動(dòng)物無(wú)應(yīng)激、更為經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的被作為臨床疫病診斷和豬群健康監(jiān)測(cè)的材料使用[6-7,17]。Klaas D等報(bào)道了利用口腔液開展豬瘟病毒早期檢測(cè)的研究[18]；Alejandro R等利用豬口腔液對(duì)10個(gè)豬場(chǎng)開展了PCV2、PRRSV和SIV等病毒感染情況的監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示PCV2的檢出率為85%，PRRSV的檢出率約為12%，而SIV的檢出率約為8%[3]；Yaowalak P等比較了PRV感染后豬口腔液和血清中PRV核酸的檢出情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染后3 d～21 d，口腔液樣品的檢出率為20%～100%，而血清樣品中未檢測(cè)到病毒核酸[11]。Marisa等以PRRSV為例，系統(tǒng)介紹了利用口腔液開展動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)時(shí)的采樣方案及注意事項(xiàng)[19]。此外，也有多篇研究報(bào)道了利用口腔液開展豬丹毒絲菌、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，PM)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)和豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)等細(xì)菌的檢測(cè)[5]。

我國(guó)自2018年非洲豬瘟暴發(fā)以來(lái)，豬口腔液是臨床開展疫病監(jiān)測(cè)和非洲豬瘟定點(diǎn)清除時(shí)使用的最為廣泛的一種生物檢材[12,20]。口腔液樣品的保存和運(yùn)輸，很大程度上影響了后續(xù)檢測(cè)環(huán)節(jié)的成敗[17]。同時(shí)，口腔液成分相對(duì)較為復(fù)雜，包括黏液素、淀粉酶、溶菌酶、脂肪酶、富脯氨酸糖蛋白以及血清滲出液等[1-2]，目前病原微生物核酸在口腔液中穩(wěn)定性的研究還相對(duì)較少。柴偉東等[21]以PRRSV和PRV的核酸為例，報(bào)道了樣品保存液在豬口腔液檢測(cè)中的應(yīng)用，評(píng)估了不同樣品保護(hù)液對(duì)病毒核酸的保護(hù)作用。本研究旨在評(píng)估核酸保護(hù)劑以及口腔液樣品保存運(yùn)輸?shù)臏囟葘?duì)PRRSV和PRV核酸穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)使用核酸保護(hù)劑時(shí)，口腔液樣品保存1 d后，PRRSV和PRV的核酸含量在低溫條件下(4 ℃)會(huì)比PBS對(duì)照組高10倍左右，而在室溫條件下，PRRSV和PRV的核酸含量則要高100倍左右；當(dāng)不使用核酸保護(hù)劑時(shí)，口腔液樣品在4 ℃與室溫條件下保存1 d后，4 ℃保存條件下，PRRSV和PRV的核酸含量仍比室溫條件下高10倍左右。而在核酸保護(hù)劑存在的條件下，PRRSV和PRV的核酸在室溫與4 ℃條件下保存1 d～3 d，核酸含量基本保持一致，不受外在保存溫度的影響。本研究還進(jìn)一步評(píng)估了核酸保護(hù)劑對(duì)不同核酸提取產(chǎn)品提取核酸效率的影響。結(jié)果顯示核酸保護(hù)劑可以兼容不同的核酸提取產(chǎn)品。此外，核酸保護(hù)劑作為一種強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，可以殺滅細(xì)菌、病毒和真菌等多種微生物，因此，經(jīng)過(guò)核酸保護(hù)劑處理的樣品，在最大限度保持所含核酸物質(zhì)穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，還有助于避免在樣品運(yùn)輸及后續(xù)的處理過(guò)程中帶來(lái)的二次污染問(wèn)題，具有重要的生物安全意義。

核酸保護(hù)劑的使用和低溫運(yùn)輸對(duì)于維持口腔液中核酸穩(wěn)定性具有重要的作用，為口腔液作為生物檢材的科學(xué)使用提供了有價(jià)值的信息。