曹嘯天 陳秀金 李兆周 仇彩霞 郭金英 王 耀

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽 471000)

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，人們傾向于使用一些有保護(hù)植物作用的殺菌劑來提高作物產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。然而，有些生產(chǎn)者由于受利益驅(qū)使長期濫用殺菌劑，造成了農(nóng)產(chǎn)品中的殺菌劑殘留超標(biāo)。研究表明：多種殺菌劑的低濃度殘留可能會(huì)對(duì)人類和其他動(dòng)物造成不良后果，甚至誘發(fā)癌癥[1]。因此，需要嚴(yán)格控制農(nóng)產(chǎn)品中的殺菌劑殘留量。為了更好地保障農(nóng)產(chǎn)品的安全和消費(fèi)者的利益，歐盟對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中殺菌劑的最大殘留限量進(jìn)行了規(guī)定，如水果中殺菌劑的最大殘留限量0.05 mg/kg；谷物中殺菌劑的最大殘留限量0.01 mg/kg；蔬菜中殺菌劑的最大殘留限量0.05 mg/kg；堅(jiān)果中殺菌劑的最大殘留限量0.05 mg/kg[2]。我國對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中殺菌劑最大殘留限量進(jìn)行了限定，如水果中不同殺菌劑的最大殘留限量0.1～15 mg/kg；谷物中殺菌劑最大殘留限量為0.01～5 mg/kg；蔬菜中殺菌劑的最大殘留限量0.05～10 mg/kg；堅(jiān)果中殺菌劑的最大殘留限量0.01～0.3 mg/kg[3]。

目前，氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4-13]等儀器分析法已廣泛用于殺菌劑殘留檢測，這些方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但需要昂貴的儀器、專業(yè)的操作人員、大量的有機(jī)溶劑和繁瑣的樣品前處理，無法滿足現(xiàn)場檢測需求[14]。而免疫分析技術(shù)正好可以彌補(bǔ)上述不足，具有簡單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[15]。本文對(duì)用于殺菌劑檢測的免疫分析法和儀器分析法進(jìn)行比較[16]，結(jié)果見表1。

表1 免疫分析法和儀器分析法的比較Tab.1 Comparison of immunoassays and instrumental methods

免疫分析技術(shù)的靈敏度主要取決于抗體的質(zhì)量，而半抗原的設(shè)計(jì)和合成對(duì)抗體質(zhì)量好壞起到?jīng)Q定性作用。因此，本文對(duì)殺菌劑半抗原的合成及免疫分析技術(shù)在殺菌劑殘留檢測中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 殺菌劑半抗原的合成

半抗原的設(shè)計(jì)要求既要盡可能保留分析物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，還要盡量減少對(duì)分析物的空間構(gòu)象和電荷分布的影響。下面按照殺菌劑種類不同分別對(duì)半抗原合成進(jìn)行介紹。

1.1三唑類殺菌劑半抗原的合成 三唑類殺菌劑是目前生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的一類殺菌劑，具有廣譜、高效和內(nèi)吸性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[17]，其共同結(jié)構(gòu)是主碳鏈上含有羥基(或酮基)、取代苯基和1，2，4-三唑基，其半抗原的合成途徑有5種，一是對(duì)三唑類殺菌劑分子中的羰基(或羥基)進(jìn)行修飾，如Newsome等[18]通過還原分子中的羰基得到羥基，然后與琥珀酸酐反應(yīng)得到三唑酮的半抗原。Jiang等[19]在烯唑醇分子的羥基上引入四碳間隔臂，合成相應(yīng)的半抗原。Cao等[20]用4-溴甲基-苯甲酸把多效唑分子上的羥基氧化為羧基，獲得相應(yīng)的半抗原。王明明等[21]采用琥珀酸酐和多效唑分子上的羥基進(jìn)行反應(yīng)，合成了多效唑的半抗原。二是對(duì)三唑類殺菌劑分子中的氰基進(jìn)行修飾，如Székács等[22]將腈菌唑分子中的氰基水解成氨基得到相應(yīng)的半抗原。三是對(duì)三唑類殺菌劑苯環(huán)上的氯原子進(jìn)行取代，如Danks等[23]采用羥基和氨基分別取代戊唑醇苯環(huán)上的氯原子合成了戊唑醇的半抗原1和半抗原2，四是利用三唑類殺菌劑的代謝物為原料合成半抗原，F(xiàn)orlani等[24]以氟醚唑的代謝物為原料合成半抗原。五是利用從頭合成途徑合成半抗原；Liu等[25]采用1-氯-3-(4-氯苯氧基)苯為原料，合成了苯醚甲環(huán)唑的兩種半抗原。其中半抗原1的結(jié)構(gòu)含有苯醚甲環(huán)唑的部分結(jié)構(gòu)，而半抗原2的結(jié)構(gòu)含有苯醚甲環(huán)唑的完整結(jié)構(gòu)。

1.2酰苯胺類殺菌劑半抗原的合成 酰苯胺類殺菌劑是一類內(nèi)吸傳導(dǎo)性殺菌劑，其中大多數(shù)品種對(duì)卵菌綱病害有優(yōu)異的防效。酰苯胺類殺菌劑半抗原的合成途徑有3種：一是通過水解殺菌劑制備半抗原，如研究者Rosso[26]和Newsome[27]分別通過水解苯霜靈和甲霜靈分子中的甲基得到苯霜靈和甲霜靈的半抗原；二是利用從頭合成途徑合成半抗原，如劉蓉蓉等[28]從頭合成了菌核凈的半抗原戊二酸半酯；三是以殺菌劑為原料進(jìn)行衍生，如Watanabe[29]等直接對(duì)氟酰胺分子的甲基末端進(jìn)行衍生得到羧基，合成了氟酰胺半抗原。

1.3酰亞胺類殺菌劑半抗原的合成 酰亞胺類殺菌劑是含有酰亞胺結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，用于殺滅種子上病原菌和葉面病原菌。酰亞胺類殺菌劑半抗原的合成途徑有2種：一是通過置換殺菌劑苯環(huán)上的氯原子制備半抗原，如Liu等[30]用6-氨基己酸取代百菌清分子苯環(huán)上的氯原子得到百菌清的半抗原。二是利用目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)類似物為原料合成半抗原，如王松等[31]利用四氫鄰苯二甲酰亞胺和鄰苯二甲酰亞胺為原料，分別與5-溴戊酸發(fā)生取代反應(yīng)，得到克菌丹的半抗原。

1.4苯胺基嘧啶類殺菌劑半抗原的合成 苯胺基嘧啶類殺菌劑具有高效性和低毒性的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)灰葡萄孢所致的各種病害有特效。其半抗原的合成途徑有3種情況：一是以殺菌劑為原料合成半抗原，如Esteve等[32]以嘧菌胺為原料，經(jīng)過兩步反應(yīng)合成半抗原1，同時(shí)以1-碘-3-硝基苯和2，4-二氯-6-甲基嘧啶為原料合成半抗原2。二是以殺菌劑結(jié)構(gòu)類似物為原料合成半抗原。如姜震等[33]以2-氯-4,6-二甲基嘧啶和4-硝基苯胺為起始原料，經(jīng)過3步反應(yīng)得到的產(chǎn)物與琥珀酸酐反應(yīng)，在分子中引入羧基得到嘧霉胺的半抗原。三是利用從頭合成途徑合成半抗原，如Esteve等[34]從頭合成了2種半抗原。

1.5其他類殺菌劑半抗原的合成 Mercader等[35,36]研究了醚菌酯和肟菌酯為原料，經(jīng)堿水解合成了兩種半抗原。Mercader等[37]設(shè)計(jì)了氟唑菌酰胺的2種半抗原，半抗原1是以3-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯為原料，經(jīng)過6步反應(yīng)，用間隔臂取代目標(biāo)物吡唑環(huán)上的甲基獲得的；半抗原2是以氟唑菌酰胺為原料經(jīng)過5步反應(yīng)，用六碳羧基手臂取代目標(biāo)物吡唑環(huán)上的二氟甲基獲得的。Ceballos等[38]制備了2種含有羧基活性基團(tuán)的半抗原，分別是用五碳羧化脂肪族直鏈取代吡唑N-甲基基團(tuán)制成的和是用間隔臂取代了噻吩環(huán)鄰位上的支鏈4-甲基戊-2-基取代基制成的。李瀟瀟[39]等以噻呋酰胺分子部分結(jié)構(gòu)2-甲基-4-三氟甲基-5-噻唑甲酸作為半抗原。

2 免疫分析技術(shù)

2.1ELSA ELISA作為一種快速檢測大量樣品的方法，被成功地用于殺菌劑殘留的檢測。本文總結(jié)了檢測殺菌劑殘留的抗體類型、半數(shù)抑制濃度和ELISA的檢測限見表2。

由表2可知，近十年來，國內(nèi)外研究者主要應(yīng)用單克隆抗體建立了檢測殺菌劑殘留的ELSA方法，方法的IC50均低于19.6 μg/ml,最低檢測限達(dá)到了0.01 ng/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐盟和我國規(guī)定農(nóng)產(chǎn)品中殺菌劑的最大殘留限量。對(duì)殺菌劑殘留的檢測樣品不僅有水果、蔬菜和谷物，還包括了環(huán)境土樣和水樣，添加回收率范圍在70%-130%。這些研究表明，ELISA已經(jīng)廣泛用于殺菌劑殘留的檢測。從表2還可以得出，目前研究者建立單一殺菌劑殘留檢測的ELISA比較多，關(guān)于殺菌劑多殘留檢測的ELISA比較少，但是農(nóng)產(chǎn)品中往往是多種殺菌劑同時(shí)殘留，由此將來需要研究對(duì)多種殺菌劑殘留同時(shí)檢測的ELISA。

表2 ELISA用于檢測殺菌劑殘留Tab.2 ELISA for detection of fungicide residues

2.2免疫層析法 免疫層析法(immunochromato-graphy assay，ICA)是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的一種涵蓋了免疫分析、標(biāo)記和層析的綜合科學(xué)技術(shù)，根據(jù)示蹤標(biāo)記物將ICA分為量子點(diǎn)免疫層析法、膠體金免疫層析法(gold immunochromatography assay,GICA)等。所謂量子點(diǎn)ICA是以量子點(diǎn)為標(biāo)記物的ICA，已用于戊唑醇的檢測。如Wang等[63]開發(fā)了基于量子點(diǎn)珠的熒光免疫層析試紙條，用于快速靈敏地檢測農(nóng)產(chǎn)品中的戊唑醇?xì)埩?，檢測限為0.02 ng/ml。GICA是以金納米粒子為標(biāo)記物的免疫層析法，已廣泛地用于殺菌劑的快檢。如Luo等[64]采用應(yīng)對(duì)蘋果中的異菌脲進(jìn)行檢測，檢測限為25 ng/ml。Yang等[65]運(yùn)用EICA試紙條對(duì)黃瓜中的百菌清殘留進(jìn)行檢測，消線值小于100 ng/ml，使用讀卡器定量檢測時(shí)，檢測限為91.78 ng/ml。袁寶鳳等[66]對(duì)比了甲霜靈和吡蟲啉殺菌劑試紙條和色譜法的檢測結(jié)果。表明甲霜靈膠體金試紙檢測結(jié)果與色譜儀檢測結(jié)果具有很好的相關(guān)性。樓小華等[67]采用EICA對(duì)煙葉中三唑酮和三唑醇?xì)埩袅窟M(jìn)行快速檢測，檢測限為1 mg/kg。Xing等[68]應(yīng)用ICA檢測飲用水中的百菌清殘留，消線值為5 ng/ml。由于GICA具有快速、簡單、便攜性強(qiáng)、可用于現(xiàn)場檢測等顯著優(yōu)點(diǎn)，將會(huì)受到越來越多的關(guān)注[69]。

2.3時(shí)間分辨熒光免疫分析法 時(shí)間分辨熒光免疫分析方法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是以具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合劑作為示蹤物，建立的一種新型的非放射性微量分析技術(shù)。該方法也已開始用于殺菌劑殘留的分析檢測。例如王明明等[21]建立了檢測多效唑的TRFIA法，線性檢測范圍是0.067-23.05 ng/ml，IC50為1.09 ng/ml，檢測限為0.012 ng/ml，同ELISA相比，靈敏度提高了19.6倍。Sheng等[70]以銪(Eu3+)和釤(SM3+)作為熒光標(biāo)記物，研制了一種高靈敏度的雙標(biāo)TRFIA，用于檢測食品中的噻蟲胺和烯唑醇。在優(yōu)化后的條件下，得到噻蟲胺的IC50和檢測限分別為5.08 ng/ml和0.021 ng/ml，烯唑醇的IC50和檢測限分別為13.14 ng/ml和0.029 ng/ml。與傳統(tǒng)的ELISA相比，TRFIA法的靈敏度更高，穩(wěn)定性更好，動(dòng)態(tài)范圍更寬，試劑保存期更長，無放射性危害，在國際上被公認(rèn)為現(xiàn)代標(biāo)記免疫的最佳方法之一[71]。

2.4免疫傳感器 免疫傳感器(immunosensor，IA)是基于抗原抗體特異性識(shí)別功能而研制成的一類生物傳感器，現(xiàn)已應(yīng)用于殺菌劑殘留的檢測。如Hirakawa等[72]利用IA對(duì)蔬菜中的百菌清殘留量進(jìn)行檢測，定量檢測范圍為8.0～44 ng/ml，IC50為25 ng/ml。另外，Mauriz等[73]應(yīng)用表面等離子共振IA對(duì)果汁中吡唑菌胺酯進(jìn)行分析，方法的檢測限低至15 ng/ml，在蔬菜中的回收率75%～90%。Hirakawa等[74]也研制了檢測蔬菜中啶酰菌胺的表面等離子體共振IA，方法檢測限為15～93 ng/ml。IA縮短了分析時(shí)間，提高了方法的靈敏度和測試精準(zhǔn)度，也簡化了測定過程，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 存在問題與展望

3.1半抗原的設(shè)計(jì) 目標(biāo)物半抗原分子設(shè)計(jì)的合理性是免疫分析方法中抗體制備的關(guān)鍵。然而，大部分殺菌劑中原本的設(shè)計(jì)是通過反復(fù)的動(dòng)物免疫試驗(yàn)來驗(yàn)證，具有很大的盲目性。近十年來，免疫學(xué)家正嘗試通過引入分子模擬技術(shù)，預(yù)測半抗原設(shè)計(jì)的可行性，大大提高了半抗原設(shè)計(jì)的科學(xué)性。

3.2免疫試劑的穩(wěn)定性 近年來，免疫產(chǎn)品的應(yīng)用與開發(fā)受到抗體穩(wěn)定性的制約。一方面，新型小分子抗體的發(fā)展，可以在一定程度上解決抗體試劑的穩(wěn)定性。如納米抗體因具有較好的耐熱穩(wěn)定性和耐有機(jī)溶劑的性質(zhì)，可以更好地用于免疫產(chǎn)品的開發(fā)。另外，研究者利用分子印跡技術(shù)制備仿生抗體也能夠很好地彌補(bǔ)生物抗體的穩(wěn)定性不足，促進(jìn)免疫分析的發(fā)展。

綜上所述，分子模擬技術(shù)的引入、新型小分子抗體和仿生抗體的研究和發(fā)展，能夠較好地解決免疫分析技術(shù)應(yīng)用時(shí)存在的問題。另外，近年來還出現(xiàn)了免疫分析方法和納米材料(熒光納米材料)的結(jié)合，不僅可以提高免疫分析方法的靈敏度，還可以拓寬方法的檢測范圍。因此，隨著免疫分析技術(shù)和其他技術(shù)的不斷結(jié)合和發(fā)展，檢測分析技術(shù)將會(huì)朝著綠色、快速、多殘留、高靈敏、低成本和商品化的方向發(fā)展，將會(huì)在殺菌劑殘留檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用。