劉 琳，王偉佳，霍 炬，郇 帥,3，趙 瑛

(1.哈爾濱商業(yè)大學 藥學院，哈爾濱 150076； 2.哈爾濱工業(yè)大學 電氣工程及自動化學院，哈爾濱 150006；3.哈爾濱商業(yè)大學 基礎科學學院，哈爾濱 150028)

腦缺血是以大腦中動脈缺血為主的腦血管疾病，是世界范圍內(nèi)導致疾病和死亡的主要疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復發(fā)率等特點[1-2].腦缺血后腦血流量呈低灌注或血流減少，導致氧和能量供應中斷，神經(jīng)細胞死亡并引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[3].隨著腦缺血情況的不斷加劇，引發(fā)的血管性癡呆(vascular dementia, VD)已成為腦缺血困擾社會和家庭的主要并發(fā)癥之一[4].目前實驗建立腦缺血模型方法主要有兩血管阻斷法(two-vessel occlusion, 2-VO)、三血管阻斷法(three-vessel occlusion, 3-VO)、低氧缺氧法、化學試劑法、急性重復缺氧法等[5].基于2-VO法建立腦缺血模型是研究血管性認知障礙(vascular cognitive impairment, VCI)及VD的常用建模方法.既往在2-VO法建立腦缺血模型過程中發(fā)現(xiàn)，不同操作者或同一操作者在不同次操作過程中對實驗動物進行結扎后，其腦血流量變化程度及腦組織形態(tài)學變化程度不盡相同，結扎力施加至最大且無限位量化，最終導致模型建立的一致性不佳，重復性較差，實驗動物具有較高死亡率[6].

阻斷拉力儀是一種能夠檢測物體承受拉力數(shù)值的檢測工具，目前在對血管進行結扎過程中，往往需要進行拉力檢測，既要保證不同操作者結扎一致性，又要防止出現(xiàn)結扎不到位導致后期血管崩裂現(xiàn)象.基于上述背景需求，目前在對血管進行結扎過程中檢測技術還存在以下不足：一是安全性較低，在操作時往往是通過手感進行檢測，在手動拉伸時很難掌控力度，如拉力過大容易造成血管崩裂現(xiàn)象[7-8]；二是機械結構復雜且結構不夠完善，現(xiàn)有裝置在檢測中，因未設置相應的限位結構,很難快速精準地找到規(guī)定位置，反復調(diào)整浪費檢測時間[9-10]，無法保證不同操作者之間的一致性.

以應變計為核心元件研制的阻斷拉力儀具有結構簡單，成本低，可實現(xiàn)拉力量化、限位的優(yōu)點.根據(jù)不同應用需求將應變計粘貼于各種彈性敏感元件上，可制作測量拉力、壓力、加速度、位移等傳感器.目前應變計的種類達到上萬種，其中金屬應變計在生物、醫(yī)藥等學科領域應用廣泛[11-14]，占全世界傳感器總量的80%以上[15].在應變、應力、拉力等傳感器研制過程中，將金屬應變計采用α-氰基丙烯酸酯[16]粘貼于一定尺寸的彈性基底上，然后在其表面進行涂覆層處理以保護應變片避免外界損傷.當結構件受到外力作用時，由于基底產(chǎn)生形變傳導至金屬應變計進而使其電阻發(fā)生改變，電阻與所施加外力呈線性或非線性關系，通過解調(diào)電路將電阻信號進行解調(diào)，實現(xiàn)對各種外力的測量[17].針對現(xiàn)有技術的缺陷及結構復雜等問題，同時考慮生物實驗室恒溫、恒濕環(huán)境，設計了便攜式血管阻斷拉力儀(簡稱拉力儀)，用于在2-VO法造模過程中對結扎拉力進行實時檢測，實現(xiàn)對結扎力的量化，控制施加拉力標準偏差，減少組內(nèi)建模差異，為后續(xù)生物學實驗數(shù)據(jù)提供客觀依據(jù)與支撐，在醫(yī)藥學基礎實驗研究領域具有重要意義.

1 金屬應變計力學傳感原理

1.1 金屬應變計傳感原理

金屬應變計的工作原理是基于應變效應[11]，金屬絲的電阻與其材料的性質(zhì)、金屬柵絲的長度及橫截面積有關.將封裝好的金屬應變計粘貼于結構件，當構件受力時，金屬柵絲的長度和橫截面積均隨之發(fā)生改變，進而發(fā)生電阻變化.電阻R與應變ε之間關系為

(1)

式中,Ks為材料的靈敏系數(shù)，其物理意義是單位應變的電阻變化率ε，為測試點處的應變，常用με為單位表示.由此可知，金屬絲在產(chǎn)生應變效應時，應變ε與電阻變化率dR/R成線性關系.

1.2 金屬應變計力學傳感機理

將金屬應變計采用α-氰基丙烯酸酯或環(huán)氧樹脂粘貼于一定尺寸的彈性基底上，當其受到外力作用時，其形變傳導至金屬應變計使電阻發(fā)生改變，由于粘膠、金屬應變計、基底材料具有不同的彈性模量，因此通常在應變、應力檢測中存在傳遞減敏效應帶來的誤差.故此，研究者在采用金屬應變計設計力學傳感器時通常要考慮待測量程，進而選取靈敏度足夠大的應變計結合基底參數(shù)進行設計[18].

2 便攜式金屬應變計血管阻斷拉力儀制備

本文設計的便攜式血管阻斷拉力儀由傳感探頭、解調(diào)電路及外殼3部分組成，結構見圖1.

圖1 便攜式血管阻斷拉力儀結構示意

2.1 探頭設計

通過仿真應力分析，基底結構設計為圓柱與薄片結合結構，以降低重復性誤差，見圖2.

圖2 血管阻斷拉力儀探頭設計

由于金屬應變計尺寸小、質(zhì)地脆、易折斷，故采用704軟膠對其進行封裝保護.為了避免金屬應變計粘貼不均導致受力不均現(xiàn)象，懸臂梁采用粗、細砂紙打磨光滑，乙醇清洗、擦拭后采用α-氰基丙烯酸酯用聚四氟乙烯薄膜按壓固定.用此方法按壓固定金屬應變計的優(yōu)點為受力均勻，同時聚四氟乙烯不會與α-氰基丙烯酸酯產(chǎn)生化學反應而被粘結.按壓待1 min左右，去掉聚四氟乙烯薄膜，使懸臂梁發(fā)生輕度形變以釋放粘貼初始應力，均勻涂704軟膠于金屬應變計導線根部，將雙導線粘接于基底，同時覆蓋金屬應變計作為涂覆層保護，固化24 h.

2.2 解調(diào)電路設計

便攜式血管阻斷拉力儀解調(diào)電路由供電電路、前放電路及數(shù)字電壓表3部分組成，見圖3.

本文所設計的供電電路為調(diào)制解調(diào)儀提供+5 V、-5 V直流供電，采用該設計方式節(jié)省交流變壓器的一個抽頭，輸出電壓穩(wěn)定且降低成本.前置放大電路可將信號放大至0～250 mV，最終由數(shù)字電壓表電路的四位數(shù)碼管顯示.

2.3 便攜式血管阻斷拉力儀的標定

便攜式血管阻斷拉力儀標定裝置主要由探頭、解調(diào)電路、外殼及標定系統(tǒng)組成，見圖4.

1)標定實驗.標定過程中采用砝碼加載，操作簡單、穩(wěn)定，通過使加載力的方向旋轉90°模擬了2-VO法結扎過程中外力的加載過程.采用鋼鍍鉻的M1級精度物理天平砝碼，細線為外殼手術用“0”號手術縫合線，線徑0.5 mm，最大承受100 N.將探頭固定端事先固定到標定平臺并延伸出標定平臺，探頭形變方向與地面垂直，在探頭拉力端的結扎線上，累加掛以不同質(zhì)量的砝碼，讀取儀器主板的電壓輸出信號，記錄砝碼重力與輸出電壓的對應數(shù)據(jù).

2)標定結果.將鋼鍍鉻的M1級精度物理天平砝碼以0.1 N為步長逐個加載至探頭，得出砝碼重力與電壓輸出之間的數(shù)據(jù)，見表1.

表1 標定數(shù)據(jù)表

3)標定曲線.隨著砝碼重力的增加，解調(diào)電路示數(shù)隨之增大，其標定曲線見圖5.

圖5 砝碼重力與解調(diào)電路示數(shù)關系曲線

經(jīng)分析可知，血管阻斷拉力儀的靈敏度為70 mV/N，在0～3.0 N變化范圍對應電壓輸出為0～199 mV，分辨率為1 mV(0.014 N).結果表明，該血管阻斷拉力儀在量程范圍內(nèi)具有較好的線性度.誤差主要來源于金屬應變計粘貼工藝及鋁合金基底結構加工偏差.

3 生物學實驗

3.1 血管阻斷拉力儀體外驗證

在血管阻斷拉力儀進行雙側頸總動脈結扎前，需驗證其可行性.因我們無法將大鼠血管進行體外實驗，因此選取和大鼠血管彈性相近的靜脈輸液管及大鼠的小腸進行實驗.血管阻斷拉力儀的使用范圍在0～3.0 N之間，按每0.5 N遞增，選取0 N、0.5 N、1 N、1.5 N、2 N、2.5 N進行體外試驗.

3.2 單位時間內(nèi)流過體積結果

結扎靜脈輸液管和小腸在單位時間內(nèi)體積的變化表明血管阻斷拉力儀設備的可行性.可應用于大鼠雙側頸總動脈結扎的實驗中，鑒于量程為0～3.0 N，且以0.5 N為步長作用于靜脈輸液管和小腸時單位時間流過體積變化不明顯，如表2所示；同時考慮較低樣本量即可完成對儀器可行性的研究.因此，在進行大鼠雙側頸總動脈結扎時擬選取0.5 N、1.5 N、2.5 N 3個力開展實驗.

表2 單位時間流過體積

3.3 實驗動物及分組

SPF級成年健康Wistar大鼠100只，體重為(300±30) g，由長春億斯實驗動物技術有限責任公司提供，合格證編號：201900018900.實驗動物采用標準飼料喂養(yǎng)，實驗期間自由飲水、攝食.實驗動物飼養(yǎng)于溫度(23±1)℃，相對濕度(50±5)%且12 h明暗交替的環(huán)境中.

實驗動物適應飼養(yǎng)7 d后，根據(jù)體重按照隨機數(shù)字表法隨機分為：假手術(sham operation, SO)組、非儀器結扎(2-VO)組、儀器結扎(0.5 N結扎組、1.5 N結扎組、2.5 N結扎組)組.

3.4 血管性認知障礙模型建立

非儀器結扎(2-VO)組：大鼠術前12 h禁食，4 h禁水，采用1%的戊巴比妥那注射麻醉大鼠仰臥位固定，頸部去毛，消毒，手術刀開口，鈍性分離頸部肌肉，暴露雙側頸總動脈，分離神經(jīng)，采用0號手術線結扎雙側，0號線縫合，術后每天肌肉注射青霉素，防止術后感染.

儀器結扎組：儀器結扎組基于血管阻斷拉力儀,采用雙側頸總動脈結扎的方法對大鼠雙側頸總動脈套以0號絲線在0.5 N、1.5 N、2.5 N雙重結扎，逐層縫合，除結扎拉力與非儀器結扎組不同，其余條件相同.

假手術組(SO組)：只分離暴露頸總動脈不結扎，其余條件相同.

3.5 大鼠額葉皮層腦血流量的測定

腦血流量實驗前的預處理：實驗前7 d，所有大鼠麻醉后仰臥，放置于腦立體定位儀上，固定頭部，采取平顱固定法進行大鼠頭顱的立體定位.之后頭部剃毛，剪開頭部皮膚2 cm，用過氧化氫擦拭清除軟組織，暴露出顱骨[19]，確定額葉(FrA)位置[20]，為后期正式試驗做準備.分別于模型建立0 d、14 d、28 d、42 d后，采用雙通道激光多普勒腦血流儀進行腦血流量的測定.大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉20 min后，將多普勒探頭固定至額葉處，記錄腦血流量，測定時間為10 min.腦血流量單位采用血流灌注單位PU.

3.6 蘇木素-伊紅(HE)染色法

采用4%多聚甲醛的磷酸緩沖液固定大鼠后，參照《大鼠腦立體定位圖譜》確定好海馬區(qū)域取材.將取好的海馬組織固定于4%多聚甲醛中24 h后采用石蠟包埋并切片，切片厚度4 μm.切片并脫蠟后，采用蘇木素初染、伊紅復染，并脫水封片后于顯微鏡下觀察并拍照.

3.7 實驗結果

1)大鼠死亡率.基于血管阻斷拉力儀采用雙側頸總動脈結扎法建立的血管性認知障礙模型降低了動物死亡率，由以往的53.33%降低為11.11%，見表3.基于此方法的成模率增加.

表3 各組大鼠死亡率

2)腦血流量測定結果.于模型建立0 d、14 d、28 d、42 d后，與SO組相比，0.5 N結扎組、1.5 N結扎組、2.5 N結扎組、2-VO組腦血流量顯著下降(P<0.01)；與2-VO組相比，0.5 N結扎組腦血流量顯著上升(P<0.01，P<0.05)、2.5 N結扎組顯著下降，1.5 N結扎組無明顯變化.結果顯示，腦缺血后腦血流量顯著下降，且不同程度腦缺血腦血流量遞增下降.并且非儀器結扎(2-VO)組的結扎力介于0.5 N～2.5 N之間，與1.5 N結果比較接近，見圖6.

注：SO組n=10；2-VO組 n=10；0.5 N結扎組 n=10；1.5 N結扎組n=10；2.5 N結扎組n=10與SO組比較，**P<0.01有非常顯著性差異；與2-VO組比較，△△P<0.01，有非常顯著性差異；△P<0.05有顯著性差異.

3)大鼠海馬組織染色結果.海馬是與認知功能密切相關的大腦組織結構，根據(jù)解剖學可知，海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在信息處理中發(fā)揮重要作用，是掌握學習記憶功能的重要腦區(qū)，目前關于認知的研究大多集中于海馬組織，海馬神經(jīng)元損傷后，表現(xiàn)出典型認知障礙[21].所以本研究選取海馬組織作HE染色研究.

在光鏡下，海馬組織見圖7，從(a)到(f)依次為SO組、2-VO組、0.5 N結扎組、1.5 N結扎組、2.5 N結扎組海馬組織圖.從圖中可以看出，SO組海馬組織細胞排列整齊緊密，細胞核圓而大，核仁清晰；2-VO組CA1區(qū)可見神經(jīng)元排列稍亂，神經(jīng)元減少，神經(jīng)元胞漿染色變淡，尼氏小體減少；0.5 N結扎組海馬組織偶見固縮神經(jīng)元，表現(xiàn)為胞核和胞漿收縮；1.5 N結扎組海馬組織神經(jīng)元排列松散，神經(jīng)元減少，齒狀回偶見固縮神經(jīng)元；2.5 N結扎組CA1區(qū)可見神經(jīng)元減少，神經(jīng)元消失，可見神經(jīng)元固縮，神經(jīng)氈排列疏松.結果表明，大鼠除在行為上的變化外，其腦部組織也會出現(xiàn)不同損傷，且不同結扎拉力對應大鼠腦組織形態(tài)學的改變也不同.

圖7 海馬部位HE染色切片

對大鼠海馬組織錐體細胞數(shù)進行處理，見圖8，與SO組相比，2-VO組、0.5 N結扎組、1.5 N結扎組、2.5 N結扎組錐體細胞數(shù)減少.表明腦缺血后核破碎情況增加.

4)大鼠Morris水迷宮測定結果.Morris水迷宮法是檢測大鼠學習記憶能力的最典型的方法，是關于學習記憶實驗最常用的檢測方法，Morris水迷宮定位航行實驗可考察大鼠學習能力，空間探索可考察大鼠記憶能力，本研究采用Morris水迷宮實驗檢測大鼠42 d學習記憶能力.

a)搜索策略.試驗開始初期各組大鼠的搜索策略均為隨機式以及邊緣式，隨著訓練次數(shù)增加，首先SO組，其次手術組的搜索策略轉變趨向式及直線式.如圖9(a)所示，SO組呈現(xiàn)趨向式的搜索策略，而相比較手術組仍以隨機式以及邊緣式為主要搜索策略.

注：SO組n=10；2-VO組n=10；0.5 N結扎組n=10；1.5 N結扎組n=10；2.5 N結扎組n=10與SO組相比較，*P<0.05有顯著性差異.

圖9 水迷宮試驗各組大鼠搜索策略

b)Morris水迷宮結果.模型建立42 d后，對各組大鼠進行Morris水迷宮測試，如圖10所示.與SO組比，1.5 N結扎組、2.5 N結扎組大鼠逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)，1.5 N結扎組大鼠站臺穿越次數(shù)顯著下降(P<0.05)；可視平臺結果顯示，受試大鼠均能登上平臺，排除了因2-VO造成的全腦低灌注狀態(tài)引起的視神經(jīng)缺血損傷對結果造成的影響.平均速度結果顯示各組大鼠的平均速度無明顯變化，排除了動物自身的因素對實驗結果造成的影響.腦缺血后學習記憶能力下降，不同結扎拉力對應大鼠學習記憶能力不同，1.5 N結扎組大鼠學習記憶能力個體差異小，模型建立更穩(wěn)定.

注：SO組n=10；2-VO組n=10；0.5 N結扎組n=10；1.5 N結扎組n=10；2.5 N結扎組n=10與SO組比較，P<0.05有顯著性差異.

4 結 論

本文設計了一種用于2-VO法建立腦缺血模型使用的便攜式血管阻斷拉力儀.該血管阻斷拉力儀量程為0～3.0 N，分辨率為0.014 N，靈敏度為70 mV/N，在量程內(nèi)具有較高的靈敏度，較好的線性度重復性.從腦血流量檢測、形態(tài)學和行為學進行生物學驗證,結果表明:通過該便攜式血管阻斷拉力儀建立的腦缺血模型具有穩(wěn)定性高、死亡率低、重現(xiàn)性佳、組內(nèi)動物個體差異小等特點.

在此便攜式血管阻斷拉力儀監(jiān)控下將不同結扎力施加于大鼠雙側頸總動脈后，與2-VO組比較，死亡率由原來的53.33%降低為11.11%.通過結扎力量化后組間觀察，大鼠腦血流量顯著下降，且下降程度與結扎力遞增呈對應關系；HE染色后光鏡檢測發(fā)現(xiàn)組間神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變，組內(nèi)大鼠海馬組織形態(tài)個體差異降低；Morris水迷宮測試發(fā)現(xiàn)，腦缺血后學習記憶能力下降，不同結扎拉力對應大鼠學習記憶能力不同，1.5 N結扎組大鼠學習記憶能力個體差異較小，模型建立更穩(wěn)定.本課題組前期在2-VO法建立腦缺血模型中采用手動快速結扎的造模方式導致動物死亡率過高，不能控制結扎拉力的量化及標準偏差導致成模動物個體差異較大.采用該便攜式血管阻斷拉力儀實現(xiàn)了結扎力的量化，降低了動物死亡率，提高了動物成模率并減小組內(nèi)動物個體性差異.本文設計的便攜式血管阻斷拉力儀可用于涉及腦缺血、卒中、腦低灌注引發(fā)的認知障礙的研究中，實現(xiàn)對2-VO法模型建立過程中結扎力的實時檢測，為后續(xù)降低實驗動物死亡率及精準診療的模型建立提供基本保障.