陳麗 ，王霄霜 ，周忠志 ，趙思如 ，胡晉婷 ，譚瀅 ，高蘭天 ，王婷婷

（1．湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，汕頭 515041；3．湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007）

糖尿病潰瘍（DU）發(fā)病率高，具有難愈、易感染等特點(diǎn)，其難愈主要與線粒體功能缺陷有關(guān)[1-2]。研究表明，高糖環(huán)境下線粒體結(jié)構(gòu)破壞致產(chǎn)生的三磷酸腺苷（ATP）不能滿足機(jī)體能量需求、產(chǎn)生過(guò)多的活性氧分子（ROS）可能為糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的共同機(jī)制[3-4]。因此，關(guān)注糖尿病潰瘍中線粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙，為改善潰瘍愈合中能量代謝缺陷、降低氧化應(yīng)激狀態(tài)從而促進(jìn)愈合有重大意義。前期研究表明[5]，仙藕乳蒲方可加快小鼠創(chuàng)面愈合，蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明其作用的關(guān)鍵蛋白定位在線粒體中。因此，本課題組通過(guò)制作糖尿病大鼠潰瘍模型，電鏡下觀察兩組潰瘍組織中線粒體結(jié)構(gòu)，檢測(cè)創(chuàng)面組織ATP、ROS含量，探究仙藕乳蒲方對(duì)糖尿病潰瘍中線粒體功能的具體影響，為臨床糖尿病潰瘍治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買雄性SD大鼠48只（SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，許可證號(hào)：SYXK湘2016-0002）。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室（許可證號(hào)：SYXK湘2015-0003），溫度維持在20～22℃。實(shí)驗(yàn)操作遵循實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理準(zhǔn)則和使用指南。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 仙藕乳蒲方即仙鶴草、藕節(jié)、乳香、蒲黃粉制劑，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室參考課題組已發(fā)表論文制備[6]。0．1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)Cat#C1013，100 mL）。鏈脲佐菌素（STZ，上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)：60256ES60，100 mg），6-正丙基-2-硫代尿嘧啶（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：530643，25 g），豬膽酸鈉（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S30219，100 g），食用豬油（GB/T8937，生產(chǎn)許可QS430102030013），吐溫-80（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130128，500 mL），1、2-丙二醇（湖南省天虹試劑有限公司，批號(hào)：20160412，500 mL），Rat ROS 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）Kit（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)：RA20694），Rat ATP ELISA Kit（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)：RA20768），酶標(biāo)儀（Labsystems Multiskan MS，型號(hào)：352型），洗板機(jī)（Thermo Labsystems，型號(hào)：AC-8），離心機(jī)（國(guó)產(chǎn)微量高速離心機(jī)，型號(hào)：TG16W，培養(yǎng)箱（國(guó)產(chǎn)隔水式恒溫培養(yǎng)箱，型號(hào)GNP-9080），HT7700透射電子顯微鏡（日本日立公司，批號(hào)2114-05）。

1.3 高脂乳劑的配制 取50 g膽固醇分次加入研缽中，研磨至無(wú)亮光后將其加入已融化的100 g豬油。加入同時(shí)注意攪拌，待充分混勻后依次加入1 g丙硫氧嘧啶、10 g膽酸鈉、100 mL已預(yù)熱的吐溫-80和100 mL已預(yù)熱的丙二醇，最后緩慢加入蒸餾水定容至500 mL。

1.4 STZ溶液的配制 在避光條件下取出冷凍保存的STZ粉末100 mg和冷藏保存的檸檬酸鈉緩沖液，配制濃度為20 mg/mL的STZ溶液，時(shí)間控制在半小時(shí)內(nèi)。

1.5 分組及糖尿病大鼠潰瘍模型制備 所有大鼠使用高脂乳劑每日2 mL/只連續(xù)灌胃14 d后，按照40 mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液建立大鼠糖尿病模型。3 d后，尾靜脈采血，測(cè)定任意血糖水平，連續(xù)3 d血糖≥16.7 mmol/L則為糖尿病模型造模成功。將糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、仙藕乳蒲方組，按照10%水合氯醛3.5 mL/kg劑量對(duì)兩組糖尿病大鼠腹腔注射進(jìn)行麻醉，在背部剃毛形成1個(gè)4 cm×4 cm正方形裸皮區(qū)域，用絡(luò)合碘與乙醇消毒處理后在大鼠背部用打孔器創(chuàng)設(shè)1個(gè)直徑為1 cm的圓形全層皮膚缺損區(qū)域，即成功建立糖尿病大鼠背部潰瘍模型。仙藕乳蒲方組大鼠創(chuàng)面敷以仙藕乳蒲方粉末，模型對(duì)照組創(chuàng)面不予處理。

1.6 標(biāo)本采集 大鼠于傷后第3天、第7天、第14天處死，冰上取材，從背部切取一個(gè)以創(chuàng)面為中心的2 cm×2 cm的深至腹膜的正方形組織塊。將取下的組織塊放入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中清洗3次，分為3份，電鏡樣本放入2.5%的戊二醛溶液固定，并于4℃保存，送電鏡室檢測(cè)。ATP及ROS檢測(cè)樣本置于2mL凍存管中，-80℃冰箱凍存，行ELISA檢測(cè)。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 創(chuàng)面愈合率 于造模對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用標(biāo)尺標(biāo)記潰瘍創(chuàng)面并用相機(jī)拍下，再通過(guò)圖像分析軟件Image pro plus 6.0計(jì)算創(chuàng)面面積，創(chuàng)面愈合率A（%）=（原始創(chuàng)面面積-觀察時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.7.2 電鏡觀察創(chuàng)面潰瘍組織形態(tài) 將標(biāo)本送中南大學(xué)湘雅醫(yī)院電鏡室，經(jīng)脫水、浸透、包埋、聚合、切片等步驟制作好切片后，利用透射電鏡觀察大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變且拍照。

1.7.3 ELISA檢測(cè)ATP含量 按照ELISA試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)的大致步驟如下：

1）將皮膚組織樣本消化為組織液。

2）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備6支做好標(biāo)記的小試管，向所有試管中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100 μL，然后取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品100 μL加入第1支試管中，輕輕混勻，再依次從上1支試管中取100 μL液體加入下1支試管并混勻，到第5支試管時(shí)，取100 μL液體丟棄，第6支試管作為標(biāo)準(zhǔn)0，則最終各管標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為 3 200、1 600、800、400、200、0 nmol/L。在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，依次加入上述濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。

3）添加樣品：分別設(shè)空白對(duì)照孔及待測(cè)樣品孔，先加40 μL樣品至待測(cè)樣品孔，然后再加10 μL生物素化的抗ATP抗體。

4）加酶：向所有待測(cè)孔加入酶標(biāo)試劑50 μL。

5）溫育：用封板膜封板后于37℃下溫育30min。

6）配液：用蒸餾水30倍稀釋濃縮洗滌液后備用。

7）洗滌：小心揭掉封板膜，丟棄液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

8）顯色：每孔先后加入顯色劑A與B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min。

9）終止：每孔加終止液 50 μL，終止反應(yīng)，此時(shí)見(jiàn)藍(lán)色轉(zhuǎn)黃色。

10）測(cè)定：在加終止液后15 min以內(nèi)，以空白孔調(diào)零，于450 nm波長(zhǎng)處依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。

1.7.4 ELISA檢測(cè)ROS含量 按照ELISA試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后各管濃度分別是：12、6.0、3.0、1.5、0.75、0 U/mL，加樣時(shí)加生物素化的抗ROS抗體10 μL，其余同上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料兩個(gè)樣本間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組潰瘍創(chuàng)面愈合率 與模型對(duì)照組相比，創(chuàng)面愈合第7、14天，仙藕乳蒲方組創(chuàng)面愈合加速，且創(chuàng)面愈合率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見(jiàn)圖1、表1。

2.2 兩組創(chuàng)面皮膚組織超微結(jié)構(gòu)觀察 創(chuàng)面愈合第3天，模型對(duì)照組膠原纖維較少；腫脹線粒體多、部分嵴消失（見(jiàn)圖2A）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少且伴部分?jǐn)U張、脫顆粒；仙藕乳蒲方組膠原纖維豐富，排列緊密；線粒體輕度腫脹，少數(shù)嵴消失（見(jiàn)圖2B）；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量多，顆粒附著明顯。第7天，模型對(duì)照組膠原纖維減前稀疏，排列散亂；細(xì)胞核內(nèi)容物松散染色淺；線粒體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，腫脹較前加重，伴聚集、擠壓、融合等改變（見(jiàn)圖2C）；未見(jiàn)明顯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；仙藕乳蒲方組膠原纖維豐富，排列緊密有序；細(xì)胞核內(nèi)容物致密染色深；線粒體腫脹較前減輕，較多可見(jiàn)清楚嵴結(jié)構(gòu)的線粒體（見(jiàn)圖2D）。第14天，模型對(duì)照組膠原纖維較前豐富，腫脹線粒體數(shù)量減少，部分可見(jiàn)清楚嵴結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖2E）；仙藕乳蒲方組膠原纖維豐富，線粒體未見(jiàn)明顯腫脹，形態(tài)正常、嵴結(jié)構(gòu)清楚的線粒體聚集（見(jiàn)圖2F）。

2.3 兩組創(chuàng)面皮膚組織ATP含量 與模型對(duì)照組相比，創(chuàng)面愈合第7、14天時(shí)仙藕乳蒲方組ATP含量均高于模型對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見(jiàn)表 2。

圖1 兩組潰瘍創(chuàng)面不同時(shí)間點(diǎn)肉眼觀察Fig.1 Visual observation of ulcer wounds in two groups at different time points

表1 兩組大鼠創(chuàng)面愈合率比較（±s）Tab.1 Comparison of wound healing rates of rats between two groups（±s）%

表1 兩組大鼠創(chuàng)面愈合率比較（±s）Tab.1 Comparison of wound healing rates of rats between two groups（±s）%

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0．05。

組別 動(dòng)物數(shù) 時(shí)間第3天 第7天 第14天模型對(duì)照組 6 85．95±6．49仙藕乳蒲方組 6 93．70±3．64*28．40±11．29 33．44±15．99 45．83±11．59 69．38± 9．36*

圖2 兩組創(chuàng)面皮膚組織超微結(jié)構(gòu)（×10 000）Fig.2 Ultrastructure of the wound skin tissue of rats between two groups（×10 000）

表2 兩組創(chuàng)面皮膚組織ATP含量（±s）Tab.2 The ATP content in the skin tissues between two groups（±s）nmol/L

表2 兩組創(chuàng)面皮膚組織ATP含量（±s）Tab.2 The ATP content in the skin tissues between two groups（±s）nmol/L

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0．05。

組別 動(dòng)物數(shù) 時(shí)間第3天 第7天 第14天模型對(duì)照組 6 634．03±7．44仙藕乳蒲方組 6 1 108．22±26．74*938．19±4．67 965．12±34．42 827．03±8．24 1 123．50±25．63*

2.4 兩組創(chuàng)面皮膚組織ROS含量 與模型對(duì)照組相比，創(chuàng)面愈合第7、14天時(shí)仙藕乳蒲方組ROS含量均低于模型對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見(jiàn)表 3。

表3 兩組創(chuàng)面皮膚組織ROS含量（±s）Tab.3 The ROS content in the skin tissues between two groups（±s）nmol/L

表3 兩組創(chuàng)面皮膚組織ROS含量（±s）Tab.3 The ROS content in the skin tissues between two groups（±s）nmol/L

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0．05。

組別 動(dòng)物數(shù) 時(shí)間第3天 第7天 第14天模型對(duì)照組 6 4．34±0．07仙藕乳蒲方組 6 3．89±0．03*4．23±0．10 4．08±0．07*4．86±0．07 3．98±0．08*

3 討論

近年來(lái)，糖尿病潰瘍發(fā)病率增高，且因其長(zhǎng)期不愈、反復(fù)感染、病理機(jī)制復(fù)雜等臨床特點(diǎn)，目前仍是臨床治療的重點(diǎn)難點(diǎn)[7]。線粒體是有氧代謝的樞紐，通過(guò)呼吸鏈遞氫遞電子參與生物氧化。胡永勝等[8]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠創(chuàng)面存在線粒體功能障礙、能量代謝失衡及三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成與分解水平下降的特點(diǎn)，導(dǎo)致了創(chuàng)面的修復(fù)障礙。且有研究表明，在糖尿病進(jìn)程中，持續(xù)高糖環(huán)境作用下可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷，進(jìn)而使氧化呼吸鏈無(wú)法發(fā)揮正常功能，這一方面使得ROS產(chǎn)生增加，造成高水平氧化應(yīng)激狀態(tài)，而后者已被證實(shí)[9]是導(dǎo)致糖尿病潰瘍難愈的重要機(jī)制；另一方面線粒體作為人體能量生成的主要場(chǎng)所，被破壞后無(wú)法維持細(xì)胞能量代謝，ATP產(chǎn)生減少，使得機(jī)體包括創(chuàng)面修復(fù)在內(nèi)的各種生命活動(dòng)受阻。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[10]，紅外光可通過(guò)刺激光感受器細(xì)胞色素C氧化酶，使大鼠糖尿病創(chuàng)面能量產(chǎn)生增加、物質(zhì)代謝加快，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞和組織修復(fù)。由此可見(jiàn)，線粒體正常結(jié)構(gòu)的維持和功能的發(fā)揮可被看作糖尿病潰瘍治療過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前，隨著對(duì)各種疾病發(fā)病機(jī)制及治療的深入研究，線粒體已經(jīng)成為許多諸如肝病、心臟病、阿爾茨海默病等疾病治療的靶點(diǎn)，且線粒體在糖尿病潰瘍治療方面的作用逐漸引起重視，但其作為糖尿病潰瘍的治療靶點(diǎn)的相關(guān)研究卻相對(duì)較少，尤其在中醫(yī)藥方面。仙藕乳蒲方由仙鶴草、藕節(jié)、乳香和蒲黃四味中藥制成，在急慢性創(chuàng)面愈合中均起到一定療效。前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，仙藕乳蒲方可加快小鼠創(chuàng)面愈合，且蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明差異表達(dá)蛋白主要定位在線粒體中，但仙藕乳蒲方對(duì)糖尿病潰瘍皮膚組織中線粒體的影響尚不清楚。

本研究通過(guò)構(gòu)建糖尿病大鼠潰瘍模型發(fā)現(xiàn)，使用仙藕乳蒲方干預(yù)后，在愈合中晚期大鼠潰瘍愈合加速，且在透射電鏡下觀察到此時(shí)潰瘍皮膚組織成纖維細(xì)胞中線粒體破壞程度更輕，結(jié)構(gòu)完整的線粒體豐富。與此同時(shí)，ELISA結(jié)果顯示出在愈合中晚期，仙藕乳蒲方組創(chuàng)面組織中ATP含量更高，而ROS含量則更低。這表明在糖尿病潰瘍愈合的第7、14天，仙藕乳蒲方可通過(guò)減輕高糖環(huán)境下線粒體結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，改善細(xì)胞能量代謝，降低氧化應(yīng)激水平，從而改善組織愈合環(huán)境，加快糖尿病潰瘍愈合進(jìn)程。另外，筆者的研究中發(fā)現(xiàn)在潰瘍愈合第3天，仙藕乳蒲方組的ROS水平較模型對(duì)照組低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與線粒體并不是ROS的唯一來(lái)源有關(guān)，也證實(shí)了在糖尿病高糖環(huán)境下線粒體是氧化應(yīng)激損傷的主要靶位，即持續(xù)的氧化應(yīng)激與線粒體損傷之間互為因果、惡性循環(huán)[11-12]，仙藕乳蒲方可能還作用于其他分子通路而降低糖尿病潰瘍創(chuàng)面的氧化應(yīng)激水平，有待深入探討研究。

綜上，筆者證實(shí)仙藕乳蒲方具有通過(guò)防護(hù)線粒體損傷，促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的療效，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，此外，這也為研發(fā)以線粒體為靶點(diǎn)治療糖尿病潰瘍愈合藥物提供了新的思路。