陳婷婷 易桂生

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸科，桂林 541000)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是一種類型比較特殊的哮喘，它主要以咳嗽為臨床表現(xiàn)[1]。CVA 是慢性咳嗽的主要病因之一[2]。CVA的基本特征是對支氣管擴張藥治療延長了非生產(chǎn)性咳嗽，無喘息或呼吸困難史，聽診無喘息音，正?？人苑瓷涿舾行院椭夤芊磻?yīng)性略有增加[3]。目前，很多學者認為CVA是典型哮喘的前體疾病或是典型哮喘在氣道炎癥比較輕微狀態(tài)下的一種過渡性表現(xiàn)，30%的CVA可能會演變成為典型哮喘[4-5]。因此，CVA的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療就顯得尤為重要。本文將現(xiàn)有CVA模型加以綜述，比較其優(yōu)缺點，以期未來能復(fù)制出理想的CVA動物模型，為CVA的防治和研究提供有效的途徑。

1 咳嗽變異性哮喘病理生理改變

1.1 CVA的病理生理機制

氣道慢性炎癥反應(yīng)是一種多因子共同參與和相互作用的特殊反應(yīng)，它涉及多種炎癥細胞、炎癥介質(zhì)以及細胞因子[6]。眾多研究表明，輔助性T淋巴細胞亞群功能紊亂是CVA發(fā)病中的一個重要環(huán)節(jié)，其發(fā)展主要與T輔助2(Th2)淋巴細胞過度激活有關(guān)[7]。有人提出過敏性哮喘最初是由過敏原暴露引起的2型免疫機制激活不當引起的。這隨后導(dǎo)致氣道局部改變，包括氣道上皮細胞的改變，如杯狀細胞增生、屏障完整性改變和上皮下細胞外基質(zhì)(ECM)等重塑過程[8]。CD4 T 淋巴細胞主要分為 Th1和 Th2 兩個亞群，分別具有免疫調(diào)節(jié)、抗感染和抗變態(tài)反應(yīng)的作用，二者在正常人體內(nèi)呈平衡狀態(tài)；Th2細胞通過釋放2型細胞因子(如促進B細胞合成免疫球蛋白的IL-4)來啟動過敏性哮喘的免疫反應(yīng)[9]。其中，IL-4 是 Th2 細胞的自分泌生長因子，能促進 B 淋巴細胞合成免疫球蛋白(IgE)和使Th0 細胞分化為 Th2 細胞，IL-4也具有炎癥趨化因子的作用可導(dǎo)致炎癥細胞浸潤[7]。

1.2 氣道高反應(yīng)性與CVA

氣道高反應(yīng)性(AHR)是指氣道對一系列刺激因素(如食物、藥物、空氣中各種致敏原等)刺激時所呈現(xiàn)的高度敏感狀態(tài)，目前更多認識是持續(xù)性的慢性氣道炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致AHR最重要的發(fā)病機制。當氣道受到過敏原或其他刺激后， 在多種炎癥細胞(如巨噬細胞、嗜酸性粒細胞)、炎癥介質(zhì)和細胞因子共同反應(yīng)下，氣道上皮和上皮內(nèi)神經(jīng)會受到損害而導(dǎo)致AHR[10]。研究表明，CVA與典型哮喘患者具有相似的氣道高反應(yīng)性和小氣道功能障礙[11]。 陳樹煜等[11]發(fā)現(xiàn)典型哮喘激發(fā)實驗陽性組[TA BPT(+)]和典型哮喘舒張實驗陽性組[TA BDT(+)]激發(fā)實驗前后IOS指標變化量較CVA大，提示患有典型哮喘者對不同劑量下乙酰甲膽堿刺激所產(chǎn)生的反應(yīng)明顯高于CVA患者，同時氣道高反應(yīng)性也較CVA更加敏感。從而證明了CVA是CV的早期階段，推測CVA、TA BPT(+)、TA BDT(+)是CV的不同階段。當CVA未控制可發(fā)展為TA BPT(+)；繼續(xù)進展可出現(xiàn)氣道功能改變(氣道高反應(yīng)性增加，氣道重塑加重)及肺功能進一步損害，慢慢發(fā)展為TA BDT(+)，再進展為典型哮喘。

1.3 氣道重塑與CVA

氣道重塑的病理改變有：氣道上皮結(jié)構(gòu)受損、上皮細胞、纖維母細胞肥大增生、上皮下網(wǎng)狀基底膜增厚、細胞外基質(zhì)增加、新生血管形成等改變[12]。還有研究表明[13]缺乏維生素D可激活Wnt5a/β-catenin 通路活性，增加CVA大鼠氣道炎癥反應(yīng)和氣道重塑的構(gòu)建。Niimi等[14]通過對哮喘患者行支氣管黏膜活檢測量基底膜厚度，證實了典型哮喘患者氣道重塑較CVA患者更嚴重。Matsumoto等[15]發(fā)現(xiàn) CVA 患者的中央性氣道壁厚度增加，而NAC(非哮喘性慢性咳嗽)患者的中央氣道壁增厚較小，而CVA患者程度與NAC相比較則增厚較大，但兩組之間的氣道管腔面積卻無差異。這表明CVA 患者具有氣道基底膜增厚的特點，且CVA患者與健康對照組相比較，CVA患者的小氣道炎癥細胞、氣道管徑和杯狀細胞面積均有所增加，推斷出這些結(jié)構(gòu)的改變可能使CVA患者氣道壁增厚。氣道黏膜在暴露于各種機械力作用下會刺激細胞生長并調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的沉積，這為以后進一步研究氣道基底膜改變提供了一個新的研究方向[16]。

2 CVA的造模

2.1 大鼠CVA模型

目前，我國最常使用的大鼠CVA造模品種，都以SD大鼠、Wister大鼠為主?，F(xiàn)在很多研究團隊也在嘗試使用Brown-Norway(BN)大鼠來復(fù)制CVA模型。現(xiàn)在關(guān)于大鼠CVA模型的構(gòu)建，常用的試劑及儀器大同小異，我們通過查閱文獻，列舉以下幾種方法。

2.1.1實驗方法Ⅰ[18-19]：第1天造模組腹腔注射1 mL混合液，包括 2 mg 卵蛋白(OVA)和 100 mg 氫氧化鋁凝膠。3周后，再次腹腔注射1 mL混合液，包括0.01 mg OVA 及100 mg氫氧化鋁凝膠。正常組注射等量的生理鹽水。3周后，模型組和給藥組開始用 1% OVA 對大鼠進行玻璃罩內(nèi)霧化，正常對照組用生理鹽水，霧化，時間為隔日一次，共7次，最后一次霧化結(jié)束后用1×10-4mol/L辣椒素霧化2 min誘咳，用測肺功能(激發(fā)實驗)的方法判斷效果，比較模型組與正常對照組咳嗽次數(shù)的變化，采用有創(chuàng)肺功能檢測方法，觀察不同劑量下乙酰甲膽堿激發(fā)實驗中大鼠吸氣總氣道阻力(RL)和動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)趨勢的變化情況。

2.1.2實驗方法Ⅱ[19-21]：每只大鼠以配制好的1 mg/mL OVA與氫氧化鋁凝膠混合液，進行皮下注射，注射部位分別為兩后足跖、腹股溝區(qū)、腰、背、頸部等10個部位，每個部位皮下注射 0.05 mL溶液，同時腹腔再次注射0.5 mL溶液，在1周后用相同的方法重復(fù)注射1次，以致加強致敏。第15天，用1%OVA溶液進行霧化吸入20 min以激發(fā)哮喘，或是以O(shè)VA和氫氧化鋁凝膠佐劑直接腹腔注射后，第15天進行用OVA霧化進行激發(fā)，加強致敏效果，若觀察到大鼠腹肌明顯收縮則為陽性，直到出現(xiàn)呼吸快、深、急促等氣道痙攣表現(xiàn)則提示造模成功。再用1×10-4mol/L辣椒素激發(fā)實驗考察各組大鼠的咳嗽時氣道敏感性。

2.1.3實驗方法Ⅲ[22]：通過腹膜內(nèi)注射1 mg OVA+10 mg氫氧化鋁凝膠混合液進行1次OVA致敏，并在21 d后，在大鼠鼻內(nèi)滴注含有75 μg OVA的生理鹽水，所有組均接受OVA攻擊。此方法通過測定AHR來評估。文獻中未對測定結(jié)果是否是CVA模型成功的評估做出具體說明。

通過比較以上三種常用方法可以得出實驗方法Ⅰ更傾向于用實驗方法評估大鼠的氣道高反應(yīng)性以及大鼠對咳嗽敏感性的變化來證實造模的成功與否。實驗方法Ⅱ針對大鼠的多部位注射，實施起來比較困難，評估辦法僅對咳嗽次數(shù)進行了客觀評價，在氣道高反應(yīng)性上卻未進行研究和提供相應(yīng)的實驗數(shù)據(jù)，來比較兩組模型變化。實驗方法Ⅲ只在測定氣道高反應(yīng)性是否增加，未說明是否是CVA模型成功的判斷。

2.2 豚鼠CVA模型

豚鼠CVA造模方法基本都是參照以下方法進行的。

Nishitsuji等[3]參照Muraki等[23]方法進行了造模，方法如下：第1天，在豚鼠腹腔內(nèi)注射30 mg/kg環(huán)磷酰胺溶液，用來增加氣道高反應(yīng)性，2 d后腹腔注射OVA 2 mg與氫氧化鋁凝膠100 mg，3周后再次腹腔注射OVA 0.01 mg與氫氧化鋁凝膠100 mg。再隔3周以后，在豚鼠腹腔內(nèi)注射20 mg/kg苯海拉明溶液抗過敏反應(yīng)，30 min后霧化吸入1%OVA溶液90 s。評判標準為測量模型組和正常組之間咳嗽次數(shù)和不同劑量乙酰膽堿下氣道特異阻力(sRaw)的變化情況?？人允且环N短暫的壓力變化(一種快速的靈感，然后是快速的過期)，無視鼻腔運動和打噴嚏等相關(guān)性的壓力變化，動物的運動被視覺監(jiān)測?？人源螖?shù)由經(jīng)過訓(xùn)練的觀察者統(tǒng)計，并通過特征姿勢和壓力傳感器來識別。目前，此方法應(yīng)用較為廣泛[24-25]。

蔡黎等[26]根據(jù)經(jīng)典哮喘模型的造模方式衍生出針對豚鼠CVA模型的制作，方法如下：第1天，肌肉注射4%OVA溶液0.5 mL，同時腹腔注射2%氫氧化鋁凝膠0.2 mL；14 d后，CVA模型組用10 mg/mL的OVA溶液霧化吸入，15 s/次，隔天霧化1次，共7次；第29天，用1×10-4mol/L辣椒素溶液引咳建立CVA豚鼠模型。霧化吸入1×10-4mol/L 辣椒素溶液, 用特征姿勢和壓力傳感器記錄2 min內(nèi)各豚鼠的咳嗽次數(shù)。評判標準:①造模后總體外觀；②肺病理切片觀察、炎癥細胞浸潤情況，以嗜酸性粒細胞(EOS)為主；③肺泡灌洗液(BALF)中的細胞計數(shù)及分類，重點是以EOS是否升高為判斷；④生理功能指標，如氣道阻力、氣道壓力、順應(yīng)性等。到28 d成模時，豚鼠死亡率為13%，總結(jié)為該模型制造方法死亡率較高，穩(wěn)定性較差。

高明等[27]在參考經(jīng)典哮喘模型構(gòu)建方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合熏煙的方式，增加豚鼠氣道的高反應(yīng)性，誘使咳嗽反應(yīng)。通過比較兩組模型，探討建立與臨床表現(xiàn)及特征相似度更高的CVA模型。方法如下：模型1組(CVA組)：1～29 d，熏煙 30 min/d；第15天，每只豚鼠注射 2% OVA 1 mL 和 200 mg氫氧化鋁凝膠；第22天，每只豚鼠注射 2% OVA 1 mL和200 mg氫氧化鋁凝膠加強致敏1次，第29～35天，用 1% OVA霧化吸入，1次/d，連續(xù)7 d。模型2組(CV組)不用煙霧攻擊，在第15天，每只豚鼠注射同樣注射2% OVA 1 mL和200 mg氫氧化鋁凝膠；第22天，每只豚鼠注射 2% OVA 1 mL和200 mg氫氧化鋁凝膠加強致敏1次，第 29～35 天用 1% OVA 霧化攻擊，1次/d。連續(xù)7 d，最后觀察兩組豚鼠之間的咳嗽次數(shù)及不同濃度乙酰膽堿激發(fā)實驗下氣道阻力(RI)的統(tǒng)計學差異。結(jié)果表明：咳嗽反應(yīng)結(jié)果表明，熏煙使模型1組豚鼠的咳嗽次數(shù)比模型2組增加，但兩組之間的咳嗽次數(shù)比較顯示差異無統(tǒng)計學意義。氣道阻力結(jié)果顯示：模型2組的RI隨著乙酰甲膽堿的濃度升高而逐漸升高，模型1組的RI 在低濃度激發(fā)時反應(yīng)高于模型2組，但在高濃度下與模型2組比較差異無統(tǒng)計學意義?？偨Y(jié)為模型1組的豚鼠表現(xiàn)與臨床CVA患者的基本癥狀和特征是相似的。但該模型依然存在豚鼠死亡率較高的問題，模型是否穩(wěn)定需進一步探索與完善。

2.3 小鼠CVA模型

小鼠CVA模型制造，方法如下[28-30]：在第1天和第14天分別通過腹膜內(nèi)注射80 μg OVA 0.1 mL和等體積的氫氧化鋁凝膠溶液致敏。自第2次致敏后的第10天開始，用1.5%OVA溶液霧化攻擊小鼠持續(xù)20 d。麻醉后將小鼠暴露于濃度不斷增加的乙酰甲膽堿(0～50 mg/mL)中，使用Buxco Pulmonary機械系統(tǒng)來評估這些小鼠插管中的肺氣道阻力。由于小鼠體積小，活動更加靈活，注射、灌胃等操作實施較困難，且自主呼吸時咳嗽及肺功能測定存在技術(shù)難度，因此，應(yīng)用小鼠制作CVA模型在一定程度上受到限制，因此并未成為常規(guī)造模動物。

3 總結(jié)

CVA和CV具有相似的嗜酸性粒細胞浸潤和相關(guān)的Th1/Th2細胞失衡等發(fā)病機制，CVA是慢性咳嗽最常見的原因之一[9]。CVA患者發(fā)生氣道上皮下層增厚，但程度低于CA患者。針對CVA的病理生理研究，成熟、完善的模型制作方式就顯得格外重要。目前，CVA動物模型中采用的實驗試劑基本相似，只是在實驗方法上不盡相同。不同的造模方法使得CVA模型的建立也不相同，這種差異對實驗結(jié)果及臨床意義也有一定影響，研究人員需要在造模方式下更加研究推敲，試劑用量也需反復(fù)進行研究和探索，分析并比較造模后動物各項指標的差異，以建立和臨床更加相似的相對成熟穩(wěn)定的CVA動物模型[27]。根據(jù)上述不同動物CVA模型的建立方法，總結(jié)以下幾點評估CVA模型是否成功的條件：①觀察動物的體征變化，如毛發(fā)改變、咳嗽情況、腹肌抽搐等氣道痙攣。②氣道高反應(yīng)性變化否滿足，無論是無創(chuàng)或是有創(chuàng)操作，通過觀察氣道阻力的變化。③肺病理切片中炎癥浸潤，肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞計數(shù)。

4 展望

CVA被認為是支氣管哮喘(CA)的前期表現(xiàn)形式。然而，這些類似疾病對支氣管收縮的咳嗽反應(yīng)不同。反復(fù)支氣管狹窄內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)的失衡可能影響咳嗽反應(yīng)。Yamamura等[31]研究表明反復(fù)支氣管收縮可減輕支氣管收縮的咳嗽反應(yīng)。支氣管收縮產(chǎn)生的內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)也影響咳嗽反應(yīng)。反復(fù)支氣管擴張收縮和由此產(chǎn)生的內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)失衡可能是導(dǎo)致CVA和BA之間支氣管收縮的不同咳嗽反應(yīng)的因素。此外，它可能是CVA進展到典型的CA的一種機制。FeNO主要由于氣道上皮細胞所產(chǎn)生，當氣道發(fā)生炎癥反應(yīng)時，氣道上皮細胞內(nèi)的一氧化氮合酶(iNOS)表達增加，使FeNO水平升高，因此 FeNO可作為反應(yīng)和監(jiān)測氣道炎癥的標記物，這一系列反應(yīng)主要與氣道嗜酸性炎癥有密切關(guān)[32]。Zhang等[33]通過mate分析表明在CVA患者持續(xù)存在慢性氣道炎癥的情況下，上皮細胞中的可誘導(dǎo)型 iNOS活性增加，從而導(dǎo)致呼出氣中檢測到的NO水平明顯升高。FeNO測試用于CVA的診斷具有很高的價值。但是，需要進一步的研究以更大的樣本量和亞組分析來確認當前的結(jié)論。因此，我們提出該假設(shè)：能否在動物模型制備后進行小氣道炎癥反應(yīng)的檢測(包括無創(chuàng)或有創(chuàng)的FeNO檢測)，來進一步佐證模型和臨床CVA病理機制更加相近，從而證實模型的成功？這可能對推進CVA發(fā)病機制研究及挖掘診治新靶點更加有益處，還更有助于CVA患者未來診斷的明確化和治療中的個體化。