馮 延，武文卿，張靜遠(yuǎn)，李 煜，李壘辰，袁 征，崔淑芳#

（1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物學(xué)教研室，上海 200433；2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動物中心，北京 100071）

外泌體（exosomes）具有脂質(zhì)雙分子層，密度在1.07～1.18 g/mL[1]，直徑在30～150 nm[2]，是一種起源于內(nèi)吞途徑的細(xì)胞外囊泡。多囊泡體（multivesicular body，MVB）與質(zhì)膜融合并排泄到細(xì)胞外微環(huán)境中，外泌體便由MVB產(chǎn)生[3]。外泌體可由體內(nèi)各種活細(xì)胞分泌，普遍存在于不同的細(xì)胞類型中，包括B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞和血小板等，也存在于多種體液中，包括血清、唾液、尿液、母乳、腹水和腦脊髓液等[1]。外泌體還被認(rèn)為是生物醫(yī)學(xué)研究中新興的新型治療靶標(biāo)[4]。不同細(xì)胞來源的外泌體具有不同的功能，可以作為疾病診斷的生物標(biāo)志物[5-6]。外泌體的納米級大小也使其成為開發(fā)藥物輸送系統(tǒng)的理想候選者，該系統(tǒng)可以將有效載荷輸送到目標(biāo)組織、細(xì)胞和器官。已有多項(xiàng)研究支持外泌體可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等特定成分，具有介導(dǎo)細(xì)胞間信號傳遞的重要功能[4-5]，并參與細(xì)胞中許多物理和病理的整合過程[7-9]。

裸鼴鼠具有多種獨(dú)特的生物學(xué)特性，如抗腫瘤、抗衰老、耐低氧及耐疼痛等。自發(fā)現(xiàn)這些特性以來，裸鼴鼠受到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，越來越多地被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，尤其是在腫瘤、衰老、心血管等老年性疾病的研究中有著更好的優(yōu)勢。外泌體最早被發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清液中[10]，隨后在小鼠、大鼠等動物以及人體中也證實(shí)了其廣泛存在，但是目前國際上還沒有關(guān)于裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞外泌體研究的相關(guān)報(bào)道。本研究分離培養(yǎng)了裸鼴鼠的皮膚成纖維細(xì)胞，對其是否分泌外泌體進(jìn)行分離及鑒定，為進(jìn)一步研究裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞外泌體在生物過程中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

新生裸鼴鼠由海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)教研室繁殖，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK（滬）2017-0004]。

1.2 儀器與試劑

主要儀器有：三氣培養(yǎng)箱（新加坡，Esco）、低溫高速離心機(jī)（德國，Eppendorf）、垂直電泳儀（美國，Bio-Rad）、凝膠成像系統(tǒng)（中國，天能）、倒置熒光顯微鏡（德國，Leica）、透射電子顯微鏡（美國，Delong Instruments）、納米流式分析儀（中國，NanoFCM）、超高速低溫離心機(jī)（美國，Beckman）。

主要試劑有：DMEM（低糖）培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素均購自美國Gibco公司；小鼠抗波形蛋白（Vimentin）多克隆抗體（10366-1-AP）購自美國Proteintech公司；兔抗Vimentin (D21H3) XP單克隆抗體（5741S）購自美國CellSignaling Technology公司；小鼠抗CD63單克隆抗體（ab217345）、小鼠抗腫瘤易感基因101（TSG101）單克隆抗體（ab125011）、小鼠抗熱休克蛋白70（Hsp70）單克隆抗體（ab181606）購自英國Abcam公司；山羊抗小鼠抗體（A-11001）購自美國Invitrogen公司；山羊抗兔抗體購自美國Proteintech公司；去外泌體血清（EXO-FBS-50A-1）購自美國System Biosciences公司；抗熒光淬滅封片劑（P0131）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自碧云天生物科技有限公司。

1.3 裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

1.3.1 裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng) 無菌取新生裸鼴鼠背部皮膚，置于含1%青霉素/鏈霉素的PBS中漂洗3次，將其剪碎至1～2 mm2大小，用3 mL 0.25%的胰蛋白酶消化40 min。使用無菌鑷子或槍頭將組織塊盡量平貼于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿鋪4～6塊，置于37 ℃溫箱中30 min使組織塊貼緊于培養(yǎng)皿壁，沿邊緣輕柔加入含20% FBS、1% 青霉素/鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液，置于33℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待組織塊周圍長出的細(xì)胞融合度至90%左右時，加入PBS洗去殘余的培養(yǎng)液，使用0.25%胰蛋白酶消化。一半細(xì)胞變圓后以5～6倍體積的含20%FBS的培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打成單個細(xì)胞，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，此時的細(xì)胞記為第一代（P1代）細(xì)胞。每2～3 d換一次培養(yǎng)液，待P1代細(xì)胞長滿瓶底后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞傳至P3代起進(jìn)行鑒定。

1.3.2 裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞的免疫熒光鑒定 將P3代細(xì)胞以1×106個/mL接種于48孔板，待融合度至80%左右時，用PBS沖洗細(xì)胞2次，加入4%多聚甲醛溶液固定15 min，隨后用PBS洗3次；0.4%TritonX-100的PBS處理5 min，PBS洗3次，加入6%的BSA，置于37 ℃封閉0.5 h，吸棄上清液。加入1%BSA稀釋的小鼠抗Vimentin多克隆一抗（1∶100），4 ℃濕盒中避光孵育過夜；Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS）洗滌3次，加入1%BSA稀釋的山羊抗小鼠二抗（1∶1 000），37 ℃孵育0.5 h，TBS洗滌3次后加入抗熒光淬滅封片劑（含DAPI），4℃保存以備鏡下觀察。

1.3.3 裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡法鑒定 收集細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的P3代細(xì)胞，使用RIPA裂解液充分進(jìn)行裂解后，加入蛋白上樣緩沖液加熱變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉4℃封閉過夜，依次加入兔抗Vimentin單克隆一抗（1∶1 000）、山羊抗兔二抗（1∶10000）進(jìn)行孵育，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測Vimentin表達(dá)情況。

1.4 裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞外泌體的分離與鑒定

1.4.1 裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞外泌體的分離 P4代細(xì)胞融合度為80%左右時，用PBS潤洗細(xì)胞2次，加入含20%去外泌體血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，48 h后收集細(xì)胞上清液80 mL，4℃，300×g離心10min，取上清液；2 000×g離心10 min，取上清液；10 000×g離心30 min，取上清液；100 000×g離心70 min，取沉淀，加入PBS洗滌，100 000×g離心70 min，取沉淀，用200 μL PBS重懸，—80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài) 將外泌體與等量的4%多聚甲醛溶液混合，將5～10 μL懸液滴加到封口膜上，將銅網(wǎng)Formvar膜面朝下放在懸液上，準(zhǔn)備2～3個銅網(wǎng)，將100 μL PBS加到封口膜上，用鑷子將銅網(wǎng)（Formvar膜面朝下）放在PBS液滴上清洗；將銅網(wǎng)放在50 μL 1%戊二醛液滴上5 min，放在100 μL ddH2O中2min（洗8次），將外泌體固定在銅網(wǎng)上。對外泌體進(jìn)行負(fù)染色處理，80kV下拍攝電鏡照片。

1.4.3 納米流式分析顆粒直徑 使用納米流式分析儀進(jìn)行分析檢測，在相同的儀器條件下測試待檢樣品，并用PBS作為實(shí)驗(yàn)空白對照，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得樣本粒徑分布圖。

1.4.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測外泌體相關(guān)特異性蛋白表達(dá) 將分離得到的外泌體樣品加入等體積的外泌體專用裂解液，冰上充分裂解10 min，加入蛋白上樣緩沖液加熱變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉4℃封閉過夜，加入兔抗CD63、TSG101、Hsp70一抗（1∶1000）和山羊抗兔二抗（1∶10000）進(jìn)行孵育，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測CD63、TSG101和Hsp70表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取新生裸鼴鼠背部皮膚，剪碎后鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿，第30小時可見組織塊邊緣有細(xì)胞游出（圖1A），第5天從組織塊游離出的細(xì)胞明顯增加（圖1B）。圖1C和圖1D分別為首次傳代后成纖維細(xì)胞和第3代成纖維細(xì)胞，細(xì)胞呈長梭形或多角形，狀態(tài)良好。

圖 1 裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞顯微圖像（×100）Figure 1 Microscopic images of skin fibroblasts of naked mole rats (×100)

2.2 細(xì)胞免疫熒光

選取P3代皮膚成纖維細(xì)胞，鋪于48孔板進(jìn)行免疫熒光鑒定，白光對照圖中成纖維細(xì)胞呈長梭形（圖2A）；免疫熒光圖片中綠色熒光為皮膚成纖維細(xì)胞中的波形蛋白，藍(lán)色為DAPI著色的細(xì)胞核（圖2B）。細(xì)胞純度在90%以上。

圖 2 裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞免疫熒光鑒定（×200）Figure 2 Immunofluorescence identification of skin fibroblasts of naked mole rats （× 200）

2.3 裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞中波形蛋白表達(dá)

采用波形蛋白單克隆抗體以蛋白質(zhì)印跡法檢測分離培養(yǎng)的P3代裸鼴鼠成纖維細(xì)胞中波形蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)裸鼴鼠成纖維細(xì)胞表達(dá)波形蛋白（圖3），從而證實(shí)分離的細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞的特性。

2.4 外泌體形態(tài)觀察

透射電子顯微鏡下觀察，可見膜狀的杯托樣結(jié)構(gòu)（圖4），符合外泌體結(jié)構(gòu)特征。

圖 3 蛋白質(zhì)印跡法檢測裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞中波形蛋白表達(dá)Figure 3 Western blotting results of vimentin in skin fibroblasts of naked mole rats

圖 4 透射電子顯微鏡觀察裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞來源外泌體Figure 4 Transmission electron microscope observation on the exosomes derived from skin fibroblasts of naked mole rats

2.5 外泌體粒徑大小

納米流式分析結(jié)果顯示，分離獲得的外泌體粒徑大小分布在46.75～206.75 nm，其中大部分分布在30～150nm（圖5），符合外泌體標(biāo)準(zhǔn)粒徑范圍。

2.6 外泌體相關(guān)特異性蛋白表達(dá)

表面標(biāo)志物的表達(dá)是驗(yàn)證外泌體的特征之一，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測分離樣品，結(jié)果證實(shí)表面富含外泌體標(biāo)志物CD63、TSG101和Hsp70蛋白（圖6）。

圖 5 裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞外泌體粒徑大小檢測Figure 5 Particles size analysis of exosomes of skin fibroblasts of naked mole rats

圖 6 蛋白質(zhì)印跡法檢測裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞外泌體Figure 6 Western blotting results of exosomes isolated from skin fibroblasts in naked mole rats

3 討論

與大小鼠等其他嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物相比，裸鼴鼠具有多種獨(dú)特的生物學(xué)特性，裸鼴鼠的成纖維細(xì)胞也具有一定特性，如能分泌超高分子量的透明質(zhì)酸。人類成纖維細(xì)胞分泌的透明質(zhì)酸相對分子量可達(dá)2×106，而成年裸鼴鼠的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的透明質(zhì)酸相對分子量可達(dá)6×106～12×106[11]。研究表明，這種超高分子量的透明質(zhì)酸相較于高分子量的透明質(zhì)酸，具有更好的細(xì)胞保護(hù)性能，不僅能保護(hù)裸鼴鼠細(xì)胞，還可以保護(hù)小鼠和人類細(xì)胞免受壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞死亡的影響，顯示了良好的抗衰老特性[12]。本研究為探索裸鼴鼠成纖維細(xì)胞是否產(chǎn)生外泌體，成功分離培養(yǎng)了裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞[13]，并對其純度進(jìn)行了免疫熒光鑒定。

外泌體起源于晚期內(nèi)體的膜囊泡，與其他類型的囊泡相比，每個外泌體都有獨(dú)特的脂質(zhì)雙分子層。根據(jù)分離方法及粒徑大小可將外泌體與微泡、囊泡或凋亡小體等區(qū)分開，此外，外泌體獨(dú)有的表面蛋白如CD63、TSG101及其他相關(guān)受體等也可用于鑒定外泌體[14]。本研究使用超高速差速離心的方法分離并提取了成纖維細(xì)胞上清培養(yǎng)液，通過鑒定驗(yàn)證了裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞能夠產(chǎn)生外泌體。蛋白質(zhì)印跡法分析中部分蛋白表達(dá)并未顯示唯一的條帶，可能與外泌體中的蛋白存在修飾的情況有關(guān)，有些蛋白被磷酸化和糖基化后會變大，有些蛋白被剪切后會變小。這種情況與國際上已發(fā)表外泌體的蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果[15]也是一致的。值得注意的是，這種蛋白修飾情況是否與其他實(shí)驗(yàn)動物有所區(qū)別，是否參與了某種生理或者病理過程，都需要進(jìn)一步探討。

每個外泌體的生化組成都反映了它們的生物發(fā)生過程和起源。上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞等均能夠釋放外泌體[16]。外泌體活性對于介導(dǎo)細(xì)胞通訊、免疫反應(yīng)、細(xì)胞信號再生和分化是必需的，甚至在病毒復(fù)制中也有報(bào)道，表明外泌體具有促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[17]。外泌體的起源和發(fā)育機(jī)制決定了它們的含量和生物學(xué)功能。例如，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體包含主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC）Ⅰ型、Ⅱ型和T細(xì)胞刺激分子，以誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖[18]。癌細(xì)胞的外泌體包含影響細(xì)胞黏附以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的分子[19]。外泌體的含量也具有明顯的疾病特異性[1]。此外，有研究表明，外泌體以Hsp70依賴的方式預(yù)防心臟纖維化，并且隨著年齡的增長，心臟纖維化的增加可能部分歸因于外泌體中與衰老相關(guān)的Hsp70表達(dá)下降[20]。裸鼴鼠成纖維細(xì)胞分泌的超高分子量的透明質(zhì)酸表現(xiàn)了良好的抗衰老特性，其成纖維細(xì)胞分泌的外泌體是否也參與了抗衰老過程，仍然需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究已經(jīng)初步證實(shí)了裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞能夠分泌外泌體，為今后研究外泌體在裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞中發(fā)揮作用的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。