宋彬彬， 董文洲， 賈炳泉， 甄 然， 彭 宇， 楊 璇， 于 佳

（北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬北京老年醫(yī)院，北京 100095）

蛋白質(zhì)降解是細(xì)胞重要的生命活動(dòng)，具有蛋白質(zhì)量控制、清除細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)、促進(jìn)蛋白激活等作用。真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解通路主要有3種：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）、自噬（autophagy）和鈣蛋白酶（Calpain）系統(tǒng)，三者降解底物或作用部位各有不同[1-2]，且受到多種分子的精細(xì)調(diào)控，包括UPS中的泛素（Ubiquitin），自噬通路中的組織蛋白酶D（Cathepsin D）、溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2（lysosomalassociated membrane protein 2，LAMP2)、自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3A/B（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3，LC3A/B）、自噬相關(guān)蛋白3（autophagy-related protein 3，Atg3）和Ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白7（Ras-related GTP-binding protein 7，Rab7），以及Calpain途徑中的Calpain和鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin）等。本實(shí)驗(yàn)通過生物化學(xué)方法，以小鼠眼、腦、脊髓、坐骨神經(jīng)和肌肉組織為材料，檢測(cè)C57BL/6J小鼠完整的神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白質(zhì)降解通路相關(guān)蛋白在不同組織、解剖部位和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（胞體和軸突）的表達(dá)和分布差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡野生型C57BL/6J小鼠，雄性4只，雌性1只，體質(zhì)量16～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011]，飼養(yǎng)于北京老年醫(yī)院屏障設(shè)施[SYXK(京)2019-0012]，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)管理規(guī)定進(jìn)行操作和處理。小鼠處死后迅速取眼（eye）、嗅球（olfactory bulb）、皮層（cortex）、海馬體（hippocampus）、紋狀體（striatum）、中腦（midbrain）、小腦（cerebellum）、腦干（brain stem）、脊髓（spinal cord，SC）、坐骨神經(jīng)（sciatic nerve，SN）和肌肉（muscle），凍存于－80℃冰箱。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本單位動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018BJLNYY-倫理-意見第2018-013號(hào)）。

1.2 主要試劑和儀器

10%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液、蛋白酶抑制劑、PierceTMBCA 蛋白定量試劑盒、蛋白質(zhì)電泳預(yù)制膠和超聲波細(xì)胞破碎儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；10% TGX Acrylamide Kit、Turbo小型預(yù)制轉(zhuǎn)印包和Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；兔抗Calpain1大亞基（large）多克隆抗體、兔抗Calpastatin多克隆抗體、兔抗LC3A/B多克隆抗體和兔抗Atg3多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，大鼠抗LAMP2單克隆抗體、兔抗Ubiquitin單克隆抗體、鼠抗Rab7單克隆抗體和雞抗神經(jīng)絲重鏈（neurofilamen heavy polypeptide，NFH）多克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，鼠抗β-actin和Calpain小亞基（small）單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，山羊抗Cathepsin D多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司；熒光標(biāo)記二抗和Odyssey CLX雙色紅外激光成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)LI-COR Bioscience公司。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

速凍的小鼠組織稱質(zhì)量后，按30 μL/mg加入 1% SDS裂解液，迅速剪碎，超聲破碎，室溫16 800 ×g離心10 min，收集上清液為總蛋白提取液。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量，取各組等量蛋白提取液，經(jīng)10% SDS-PAGE（Bio-Rad TGX acrylamide kit）或4%～12% NuPAGE Bis-Tris預(yù)制凝膠電泳分離，再將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維素膜放入5%脫脂牛乳中室溫封閉1 h或Odyssey封閉液中室溫封閉30min后，加入山羊抗Cathepsin D（1∶1 000）、大鼠抗LAMP2（1∶1 000）、兔抗LC3A/B（1∶1000）、兔抗Atg3（1∶1000）、鼠抗Rab7（1∶1 000）、兔抗Ubiquitin（1∶500）、兔抗Calpain1 large（1∶1 000）、鼠抗Calpain small（1∶500）、兔抗 Calpastatin（1∶1 000）、雞抗NFH（1∶5 000）、鼠抗β-actin（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育過夜。PBST（含0.1% Tween-20的磷酸鹽緩沖液）漂洗3次（每次5 min）后，將膜放入熒光素IRDye標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG（1∶5 000）二抗中，室溫避光孵育1 h，PBST充分漂洗后，采用Odyssey凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶的顯色情況，使用Image J軟件分析蛋白條帶的相對(duì)灰度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 7（美國(guó)GraphPad Software公司）進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以表示，空間分布用柱形圖表示，兩組均數(shù)間差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自噬和鈣蛋白酶途徑調(diào)控分子在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中的分布

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，Cathepsin D、LAMP2、LC3A/B、Atg3、Rab7、Calpain大小亞基和Calpastatin在小鼠眼、嗅球、皮層、海馬、紋狀體、中腦、小腦、腦干、SC、SN和肌肉中都有一定表達(dá)（圖1A），但含量具有組織和解剖部位差異性（圖1B）。肌動(dòng)蛋白β-actin為非肌肉型肌動(dòng)蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，在肌肉中不表達(dá)。

2.2 蛋白質(zhì)降解調(diào)控分子在小鼠脊髓和坐骨神經(jīng)中表達(dá)和分布

圖 1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬和鈣蛋白酶途徑調(diào)控分子在小鼠組織中表達(dá)Figure 1 Expression of autophagy and Calpain pathway molecules in the tissues of mice detected by Western blotting

圖 2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白質(zhì)降解通路調(diào)控分子在小鼠脊髓和坐骨神經(jīng)中表達(dá)和分布Figure 2 Expression of protein degradation pathway molecules in the spinal cord and sciatic nerve of mice detected by Western blotting

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)降解通路調(diào)控分子在小鼠SC和SN中有差異性表達(dá)（圖2A）。與SC相比，小鼠SN中UPS關(guān)鍵蛋白Ubiquitin和自噬通路中的Cathepsin D、LAMP2、總LC3A/B、Atg3、Rab7含量均明顯下降（P＜0.01），且未檢測(cè)到LC3A/B-Ⅱ蛋白；鈣蛋白酶途徑中的Calpain1 large總含量（包含全長(zhǎng)相對(duì)分子量80 000和剪切型相對(duì)分子量75 000）明顯下降（P＜0.05），但剪切型Calpain1 large含量相對(duì)增加；而Calpain small總含量（包含全長(zhǎng)相對(duì)分子量26 000和剪切型相對(duì)分子量18 000）明顯增加（P＜0.001），且剪切型Calpain small含量增加相對(duì)明顯；Calpastatin含量無(wú)明顯差異（P＞0.05）（圖2B）。

3 討論

UPS是高效、高度選擇的蛋白降解途徑，其廣泛參與機(jī)體多種代謝活動(dòng)，主要降解短壽命蛋白質(zhì)和應(yīng)激條件下細(xì)胞內(nèi)異常蛋白。UPS由Ubiquitin、泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）、泛素連接酶（E3）、蛋白酶體和去泛素化酶組成。在ATP作用下，Ubiquitin被活化后與E1結(jié)合，轉(zhuǎn)移到E2，再通過E3與靶蛋白結(jié)合，泛素化的靶蛋白進(jìn)入26S蛋白酶體（ATP依賴性蛋白水解復(fù)合體）被降解為多肽或氨基酸。去泛素化酶可將Ubiquitin從底物上解離下來(lái)，繼續(xù)識(shí)別其他待降解蛋白質(zhì)[3-4]。Pasquini等[5]早期研究提出，SN中不易形成泛素-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。本研究發(fā)現(xiàn)，與SC相比，SN中Ubiquitin含量明顯減少，這可能使蛋白質(zhì)泛素化過程受阻，從而引起軸突束中UPS降解蛋白質(zhì)功能減弱。

自噬是真核細(xì)胞中廣泛存在的一種溶酶體依賴的降解途徑，較UPS具有更強(qiáng)的降解能力，可降解長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)（錯(cuò)誤折疊蛋白、蛋白質(zhì)復(fù)合物、積聚物）以及受損細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)病原體[6]。自噬過程分為3個(gè)階段：?jiǎn)⑹?、成熟和降解[7]。自噬起始復(fù)合物（ULK1、ULK2、ATG13、FIP200和ATG101）磷酸化后激活，活化的ULK1可以招募自噬相關(guān)蛋白（Atg）到自噬體形成位點(diǎn)，觸發(fā)自噬體形成[8]。前自噬體結(jié)構(gòu)（pre-autophagosomal structure，PAS）初步延伸可包裹待降解物，隨后形成Atg5-Atg12-Atg16復(fù)合物，與3-磷酸磷脂酰肌醇結(jié)合且定位到自噬體膜上使膜延伸；或者Atg8經(jīng)泛素樣酶Atg7和Atg3加工后，與磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）結(jié)合形成Atg8-PE，Atg8-PE位于自噬體膜，促進(jìn)自噬體膜延伸和招募待降解物[9]。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Atg4家族蛋白還可以剪切LC3前體生成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ可通過Atg7和Atg3與PE偶聯(lián)后形成LC3Ⅱ，故LC3Ⅱ特異性與自噬體結(jié)合，LC3Ⅱ水平與自噬體數(shù)量正相關(guān)，可作為自噬體形成的標(biāo)志物[10]。包裹待降解蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的自噬體（autophagosome）被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中被降解，且降解產(chǎn)物可供細(xì)胞再循環(huán)利用，以維護(hù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。Cathepsin D是溶酶體中主要水解酶[11]。LAMPs是溶酶體膜上含量豐富的跨膜蛋白，LAMP1和LAMP2共占溶酶體膜蛋白的約80%，可維持溶酶體膜完整性[12]。LAMPs在溶酶體腔面的氨基末端高度糖基化，以防止溶酶體腔內(nèi)酸性水解酶對(duì)其自身結(jié)構(gòu)造成破壞[13]。細(xì)胞內(nèi)吞形成內(nèi)體，晚期內(nèi)體也可攜帶特定待降解蛋白質(zhì)，與溶酶體融合后進(jìn)行降解。Rab7既位于晚期內(nèi)體，也定位于自噬體，參與調(diào)控自噬體與溶酶體的結(jié)合，影響自噬體成熟和運(yùn)輸[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與SC相比，SN中Cathepsin D、LAMP2、總LC3A/B、Atg3和Rab7含量均明顯減少，且未檢測(cè)到LC3A/B-Ⅱ。這說明自噬體和溶酶體主要分布在神經(jīng)元胞體，軸突束中自噬體形成和溶酶體分布均相對(duì)減少。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SN受到損傷的早期，LC3-Ⅱ蛋白含量顯著增加，自噬水平提高可促進(jìn)軸突、髓鞘再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[15-16]。

當(dāng)細(xì)胞受損、刺激等引起細(xì)胞質(zhì)中鈣離子水平升高時(shí)，Calpain被活化，發(fā)揮蛋白降解功能。Calpain可水解細(xì)胞骨架蛋白、膜相關(guān)蛋白、激酶和磷酸酶、轉(zhuǎn)錄因子和凋亡相關(guān)蛋白等百余種蛋白質(zhì)，參與維護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、死亡等過程[17-18]。根據(jù)激活所需鈣離子濃度差異可將Calpain分為μ-Calpain（Calpain1）和m-Calpain（Calpain2），二者是哺乳動(dòng)物普遍表達(dá)類型，均由具有催化活性的大亞基和具有調(diào)節(jié)活性的小亞基組成[19]。Calpain大亞基具有4個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：當(dāng)Calpain大亞基被鈣離子激活后，結(jié)構(gòu)域Ⅰ發(fā)生自溶，可暴露水解活性域；結(jié)構(gòu)域Ⅱ是蛋白質(zhì)水解的主要功能域，可分為Ⅱa和Ⅱb，鈣離子水平較低時(shí)，兩亞區(qū)域分離，抑制蛋白質(zhì)水解；結(jié)構(gòu)域Ⅲ為調(diào)節(jié)中心，參與Calpain膜轉(zhuǎn)移過程；結(jié)構(gòu)域Ⅳ含有5個(gè)EF手性結(jié)構(gòu)域，直接與鈣離子結(jié)合后，酶構(gòu)象改變，大小亞基分離，逐步暴露水解活性結(jié)構(gòu)域Ⅱa和Ⅱb，參與底物水解[20]。本研究中Calpain1 large抗體可檢測(cè)全長(zhǎng)（相對(duì)分子量80 000）和28位亮氨酸自剪切后（相對(duì)分子量75 000）的Calpain1large蛋白。與SC相比，SN中總Calpain1large含量明顯減少，但剪切型Calpain1large蛋白（相對(duì)分子量75 000）含量相對(duì)增加。Calpain1和Calpain2具有相同的Calpain small，Calpain small為調(diào)節(jié)亞基，具有Ⅰ、Ⅱ兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，對(duì)于維持Calpain活性具有重要作用。本研究中Calpian small抗體可檢測(cè)全長(zhǎng)（相對(duì)分子量26 000）和自溶剪切型（相對(duì)分子量18 000）Calpain small。研究發(fā)現(xiàn)，與SC相比，SN中總Calpain small含量明顯增加，且剪切型Calpain small含量增加相對(duì)明顯，提示Calpain small較活化。Calpain活性隨鈣離子濃度提高而增加，當(dāng)Calpain過度活化時(shí)，Calpastatin可特異性抑制Calpain活性[21]。Baudry[22]研究提出，Calpain廣泛分布于機(jī)體各組織。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)中，SC與SN相比，Calpastatin含量無(wú)明顯差異；而SC和SN中Calpain大小亞基含量和活性具有明顯差異，提示Calpain調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解主要發(fā)生在神經(jīng)元軸突，較少發(fā)生于胞體。當(dāng)SN受損時(shí)，軸突內(nèi)鈣離子水平迅速升高可激活Calpain[23]，降解細(xì)胞骨架蛋白使軸突變性[24]，而Calpastatin對(duì)軸突和突觸結(jié)構(gòu)及功能具有保護(hù)作用[25]。

蛋白質(zhì)合成與降解平衡是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要條件，蛋白質(zhì)降解通路受損引起蛋白質(zhì)異常積聚可導(dǎo)致多種神經(jīng)退行性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，與SC相比，小鼠SN中UPS和自噬通路相關(guān)蛋白含量明顯降低，而依賴于鈣離子的Calpain系統(tǒng)中Calpain small含量明顯增加，這提示UPS和自噬主要降解神經(jīng)元胞體中蛋白質(zhì)，而軸突束中主要通過Calpain途徑降解底物。在正常生理?xiàng)l件下，Calpain參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和軸突發(fā)育等；但在氧化應(yīng)激、創(chuàng)傷、興奮毒性等病理?xiàng)l件下，鈣離子大量?jī)?nèi)流，Calpain高度活化，可能導(dǎo)致軸突變性、斷裂，甚至神經(jīng)元死亡。蛋白質(zhì)降解通路異常與疾病發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，深入研究蛋白質(zhì)降解通路及其關(guān)鍵分子可為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的思路。