顏 衛(wèi) , 傅宏慶 , 李嘯雪 , 盧賢忠 , 徐學(xué)良 , 巢鈺陽

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 寵物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

食源性疾病是食品安全的主要問題，世界衛(wèi)生組織(WHO)將食源性疾病定義為“通過攝食進(jìn)入人體導(dǎo)致人體患感染性或中毒性的疾病”。WHO估算每年有多達(dá) 6 億人因食用受到污染的食品而生病，所有食源性疾病中58.2%由細(xì)菌引起[1]。食源性病原菌中有許多是人獸共患病原菌。WHO及世界動物衛(wèi)生組織(OIE)指出，引起人致病的重要食源性人獸共患細(xì)菌主要包括沙門菌、大腸桿菌 O157∶H7、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、空腸彎曲菌等。本試驗從食品、人群、動物3個維度對沙門菌、彎曲菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌3種食源性人獸共患細(xì)菌的流行現(xiàn)狀進(jìn)行監(jiān)測，及時的風(fēng)險預(yù)警具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、三糖鐵瓊脂(TSI)、腦心浸液肉湯(BHI)、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基、水解酪蛋白培養(yǎng)基(MH)、WS瓊脂、布氏肉湯、Carry-Blair運送培養(yǎng)基，均購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；CCDA、李斯特選擇培養(yǎng)基OXFORD，購自O(shè)XOID公司；李斯特增菌培養(yǎng)基，購自BD公司；微氧產(chǎn)氣袋，購自MGC公司；綿羊全血，購自蘭州民海生物工程有限公司；Buffer、dNTPs、Taq酶、低分子量DNA Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 樣品來源 2018年3月—2019年2月在江蘇泰州地區(qū)采集人源樣本296份(257份為醫(yī)院腹瀉患者糞便樣本、39份為腦脊液樣本)、動物源樣本544份(285份雞群肛拭樣本、259份羊群肛拭樣本)、食品源樣本503份，共1 343份樣品進(jìn)行沙門菌、彎曲菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測。棉拭樣品用Cary-Blair運送培養(yǎng)基運送，其余樣品置于4 ℃冰盒6 h內(nèi)送達(dá)實驗室檢測。

1.3 病原菌的分離

1.3.1 沙門菌的分離 腹瀉患者的糞便樣本按國標(biāo)方法進(jìn)行常規(guī)檢驗，主要步驟為：約10 g糞樣于10 mL SC增菌液中37 ℃增菌18～24 h，WS平板分離培養(yǎng)24 h，疑似菌落接種TSI斜面培養(yǎng)18～24 h，可疑菌苔進(jìn)行玻板凝集試驗，陽性者做生化鑒定。雞群泄殖腔樣本接種5 mL TTB增菌液42 ℃培養(yǎng)24 h，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基37 ℃分離培養(yǎng)24 h，挑取紫色單菌落純培養(yǎng)后做生化鑒定。食源樣本參照GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗 沙門菌檢驗》進(jìn)行分離。

1.3.2 彎曲菌的分離 Carry-Blair培養(yǎng)基中的棉拭樣本、食源樣本1 g剪碎，加入9 mL布氏肉湯(含抗生素和生長促進(jìn)劑)，厭氧培養(yǎng)罐42 ℃搖床培養(yǎng)24 h，CCDA平板42 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑選濕潤、灰白色、有金屬光澤的菌落3～5個，溶于50 μL超純水，隔水煮沸20 min后取出置于冰上，8 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行PCR檢測。

1.3.3 單核細(xì)胞增生性李斯特菌的分離 Carry-Blair培養(yǎng)基中的棉拭樣本、食源樣本1 g剪碎，加入9 mL LEB中培養(yǎng)24 h，OXFORD選擇培養(yǎng)培養(yǎng)24 h， 挑選細(xì)小、濕潤、黑色的疑似菌落BHI過夜純培養(yǎng)，溶菌酶-蛋白酶K法提取菌液的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 沙門菌的鑒定 純培養(yǎng)物首先進(jìn)行生化鑒定，包括糖發(fā)酵試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、甲基紅試驗、硫化氫試驗、尿素試驗，生化鑒定陽性的菌株采用熱裂解法制備菌株DNA模板后擴(kuò)增保守基因invA， 目的擴(kuò)增片段為284 bp。擴(kuò)增體系25 μL，其中ddH2O 17.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、Taq酶2 μL、 10 μmol/L引物1 μL、DNA模板1 μL。擴(kuò)增程序：93 ℃ 5 min；93 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.4.2 彎曲菌的鑒定 參照何蕊等[2]的方法，選取彎曲菌屬16S rRNA基因、空腸彎曲菌mapA基因、結(jié)腸彎曲菌CeuE基因設(shè)計引物。PCR體系中各成分的量為：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 3 pmol，16S rRNA的引物分別為20 pmol，mapA引物，CeuE引物各為37.5 pmol，模板溶液2 μL，Taq酶0.2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min?？漳c彎曲菌在857 bp 和589 bp處分別出現(xiàn)屬特異性條帶和種特異性條帶，結(jié)腸彎曲菌在857 bp和462 bp處分別出現(xiàn)屬特異性條帶和種特異性條帶。

1.4.3 單核細(xì)胞增生性李斯特菌的鑒定 參照周曉輝等[3]的方法，擴(kuò)增Lm毒力基因溶血素基因hly，目的擴(kuò)增片段850 bp。PCR體系中各成分的量：10×Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，dNTPs 5 pmol，hly引物各10 pmol，模板DNA 3 μL，Taq酶0.2 μL，去離子水14.8 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2 結(jié)果

2.1 人源樣本病原菌的監(jiān)測 296份人源樣本中39份為醫(yī)院腦脊液樣本，257份為醫(yī)院腹瀉患者的糞便樣本。腦脊液樣本未分離到單核細(xì)胞增生性李斯特菌，腹瀉患者樣本分離到沙門菌和彎曲菌共16株，陽性率為6.23%，其中沙門菌4株，陽性率為1.56%，空腸彎曲菌10株，陽性率為3.89%，結(jié)腸彎曲菌2株，陽性率為0.78%。124份5歲以下嬰幼兒樣品中分離到病原菌9株，陽性率為7.26%，其中沙門菌1株，陽性率為0.81%，空腸彎曲菌7株，陽性率為5.65%，結(jié)腸彎曲菌1株，陽性率為0.81%。133份6歲及以上腹瀉患者樣本中分離到病原菌7株，陽性率為5.26%，其中沙門菌3株，空腸彎曲菌3株，陽性率均為2.26%，結(jié)腸彎曲菌1株，陽性率為0.75%(見表1)。不同時期的樣品監(jiān)測結(jié)果顯示，3～5月分離到沙門菌和彎曲菌各1株，陽性率為3.23%；6～8月分離到彎曲菌4株，包括3株空腸彎曲菌和1株結(jié)腸彎曲菌，陽性率為8.70%；9～11月分離到7株病原菌，包括1株沙門菌、1株結(jié)腸彎曲菌和5株空腸彎曲菌，陽性率為9.59%；12月到次年2月分離到3株病原菌，包括2株沙門菌和1株空腸彎曲菌，陽性率為3.95%(見表2)。

表1 不同年齡腹瀉患者樣本病原菌監(jiān)測結(jié)果Table 1 The results of pathogenic bacteria in diarrhea patients of different ages

表2 不同時期人源樣本病原菌監(jiān)測結(jié)果Table 2 The results of pathogenic bacteria in human samples in different periods

2.2 動物源樣本病原菌的監(jiān)測 544份動物源樣本中有259份為羊群肛拭樣本，分離到3株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽性率為1.16%，285份雞群肛拭樣本分離到病原菌52株，陽性率為18.25%。雞群樣本中病雞樣本59份，分離到病原菌20株，包括5株沙門菌、14株空腸彎曲菌和1株結(jié)腸彎曲菌，陽性率為33.90%；健康種雞樣本33份未分離到病原菌；健康雛雞樣本67份分離到病原菌9株，包括2株沙門菌和7株空腸彎曲菌，陽性率為13.43%；健康成年雞樣本126份分離到病原菌23株，包括5株沙門菌、17株空腸彎曲菌和1株結(jié)腸彎曲菌，陽性率為18.25%(見表3)。

表3 雞群樣本病原菌監(jiān)測結(jié)果Table 3 The results of pathogenic bacteria in chicken samples

2.3 食源樣本病原菌的監(jiān)測 503份食源樣本共分離到病原菌46株，包括15株沙門菌、8株空腸彎曲菌、3株結(jié)腸彎曲菌和20株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽性率為9.15%。其中市場雞肉樣本75份，分離到病原菌15株，包括6株沙門菌、7株空腸彎曲菌、1株結(jié)腸彎曲菌和1株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽性率為20%；市場雞肉樣本67份，分離到病原菌6株，包括4株沙門菌、1株空腸彎曲菌和1株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽性率為8.96%；市場豬肉樣本87份，分離到病原菌14株，包括4株沙門菌、1株結(jié)腸彎曲菌和9株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽性率為16.09%；超市豬肉樣本64份，分離到病原菌6株，包括1株沙門菌和5株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽性率為9.38%；市場蔬菜樣本63份，分離到1株結(jié)腸彎曲菌，陽性率為1.59%；市場淡水魚蝦樣本76份，分離到2株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽性率為2.63%；熟肉樣本71份，分離到2株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽性率為2.82%(見表4)。

表4 食源樣本病原菌監(jiān)測結(jié)果Table 4 The results of pathogenic bacteria in food samples

3 討論

2018 年泰州市食源性致病菌的監(jiān)測結(jié)果表明:沙門菌、彎曲菌和單核細(xì)胞增生性李斯特菌在自然界中廣泛存在，人群、動物群和食品中均存在一定程度的感染或污染。沙門菌寄生于宿主腸道內(nèi)，可引起家禽出現(xiàn)傷寒、副傷寒、雞白痢等疾病，還可通過污染的肉類、禽蛋類、蔬菜等食物引起人沙門菌感染，沙門菌進(jìn)入腸道后大量繁殖，引起腸黏膜發(fā)炎，大量活菌釋放的內(nèi)毒素可引起機體中毒。全球每年有超過 1億人感染沙門菌，其中超過 15 萬人會死亡[4]。作為人類感染性腹瀉最為常見的腸道致病菌之一，至今已有2 500多種血清型被發(fā)現(xiàn)[5]。本試驗在腹瀉人群樣本中分離到4株沙門菌，陽性率為1.56%。不同類型的雞群樣本中分離到12株沙門菌，陽性率為4.21%，病雞樣本的分離率最高為8.47%，其次健康成年雞的分離率為3.97%，健康雛雞的分離率為2.99%，健康種雞由于長期凈化的結(jié)果或者樣品采集量不夠大未分離到沙門菌。本次食品樣本中共檢出15株沙門菌，污染率為2.98%，沙門菌是引起當(dāng)今全球食物中毒病例最多的致病菌[6]，食品污染不可忽視。本次監(jiān)測到的沙門菌污染主要集中在肉制品，市場雞肉污染率最高達(dá)8.00%，其次超市雞肉為5.97%、市場豬肉為4.60%、超市豬肉為1.56%。從健康成年雞為3.97%的分離率到市場雞肉8.00%的污染率，提示了進(jìn)一步加強運輸管理和市場衛(wèi)生檢疫的必要性。

彎曲菌廣泛分布于自然界，是許多畜禽的寄生菌，可引起動物腹瀉、牛羊流產(chǎn)、雛雞壞死性肝炎，此外，可通過動物、食物、水等傳播并引起人的感染，導(dǎo)致人出現(xiàn)發(fā)熱、急性腸炎、格林巴利綜合征等疾病。彎曲菌是重要的腹瀉病原菌之一，尤其引起嬰幼兒腹瀉[7]。本試驗調(diào)查結(jié)果顯示，5歲以下嬰幼兒患者樣本中空腸彎曲菌的陽性率達(dá)到5.65%，而6歲以上腹瀉患者的陽性率為2.26%，有顯著差異，這就進(jìn)一步提示了5歲以下兒童是彎曲菌(尤其是空腸彎曲菌)的主要感染者或者是帶菌者。不同時期人源樣本致病菌的監(jiān)測結(jié)果提示，夏季、秋季的感染率高于其他時期。人類彎曲菌主要來源于家禽，尤其是雞群。雞群285份樣本監(jiān)測結(jié)果顯示，病雞的陽性率最高，空腸彎曲菌陽性率達(dá)到23.73%、結(jié)腸彎曲菌陽性率為1.69%，健康雛雞空腸彎曲菌的陽性率為10.45%，成年雞空腸彎曲菌的陽性率為13.49%。雞群中彎曲菌的來源及影響菌體定殖的因素主要包括其他動物(家畜、蒼蠅、寵物等)、飼養(yǎng)人員、環(huán)境、設(shè)備、飲用水等，做好雞場的環(huán)境管控、做好夏季的滅蠅工作、遵守生物安全程序、定期消毒運輸包裝箱等對于降低養(yǎng)殖環(huán)節(jié)彎曲菌的感染很有必要。503份食源樣本空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌的陽性率分別為1.59%、0.60%，市場雞肉樣本中空腸彎曲菌的污染率最高，達(dá)到9.33%，顯著高于其他樣本，顯示雞肉是食源性彎曲菌風(fēng)險來源的主要食品品種和項目，加強禽類及禽肉產(chǎn)品的食品安全管理是控制彎曲菌感染的重要環(huán)節(jié)。超市冷凍雞肉彎曲菌的污染率為1.49%，顯著低于市場雞肉的污染率，主要是因為彎曲菌對低溫較為敏感，低于30 ℃便不再生長，因此冷凍處理是降低禽肉表面彎曲菌污染水平的一種實用且有效的方法，可通過低溫儲存、運輸降低肉品表面彎曲菌數(shù)量。

單核細(xì)胞增生性李斯特菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，動物的感染主要與食用污染的飼料有關(guān)，癥狀以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染為主，病初精神沉郁、食欲不振、發(fā)熱，幾天后會出現(xiàn)腦膜炎癥狀。病原菌可經(jīng)過污染農(nóng)場、食品加工、銷售傳染給人，引起免疫力低下人群如新生兒、老年人、孕婦等出現(xiàn)腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)及多器官功能障礙等，雖然發(fā)病率較低，但致死率可達(dá)20%～30%。在國內(nèi)，單增李斯特菌暴發(fā)次數(shù)不多，多為零星散發(fā)，然而這一病原菌經(jīng)常在各省市的市售食品中得到分離[8]。本試驗從動物源259份羊群樣本分離到3株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，陽性率為1.16%。259份羊群樣本中有68份采自小養(yǎng)殖戶，而3份陽性樣本均來自小養(yǎng)殖戶，采樣過程中發(fā)現(xiàn)小養(yǎng)殖戶環(huán)境管理粗放，糞污處理不及時，場地沒有定期消毒，存在羊與家禽混合飼養(yǎng)的情況；其余的191份羊群樣品采自江蘇某生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，該公司養(yǎng)殖場區(qū)污道、凈道、排污、排水分離清晰，糞污處理設(shè)施、消毒設(shè)施齊全，飼料質(zhì)量過關(guān)，未分離到單核細(xì)胞增生性李斯特菌。由此可見，養(yǎng)殖場環(huán)境的精細(xì)化管理、定期消毒是保證動物群健康的有效措施。食源503份樣本中共分離到20株單核細(xì)胞增生性李斯特菌，污染率為3.98%。市場豬肉的污染率最高達(dá)10.34%，其次超市豬肉為7.81%、熟肉制品為2.82%、市場淡水魚蝦為2.63%、超市雞肉為1.49%、市場雞肉為1.33%。單核細(xì)胞增生性李斯特菌可通過食品引起人的感染，尤其是免疫力低下人群往往表現(xiàn)為中樞感染。與其他食源性人獸共患病原菌不同，單核細(xì)胞增生性李斯特菌在 4 ℃的條件下仍可生長繁殖,因此它是冷藏類食品中威脅人類健康的主要病原菌，其潛在的危害性應(yīng)引起人們的足夠重視[9]。