張長(zhǎng)貴，伍自力，王興華，張耕

(1.宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；3.四川眉山李記食品有限公司，四川 眉山 620010；4.四川彭州廣樂(lè)食品有限公司，四川 彭州 611930)

大頭菜屬于根用型芥菜，該蔬菜產(chǎn)量大，易于栽種，在四川、云南、湖北、山東等地有種植。大頭菜肉質(zhì)堅(jiān)韌而厚實(shí)，不僅富含VC、糖類、礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]，還具有抗菌消腫、解毒清熱、暖胃溫脾等保健功效，深受百姓喜歡。新鮮大頭菜因具有濃烈的沖鼻味、辛辣味和苦澀味，需要通過(guò)加工將辛辣苦澀物質(zhì)去除后再食用[2]，而腌制加工是常見(jiàn)的方法。近年來(lái)，全國(guó)各地逐步形成了各具特色的腌制大頭菜地方品牌，有四川省的內(nèi)江大頭菜、四川省的宜賓冰糖大頭菜、湖北省的襄樊大頭菜、江蘇省的淮安龍須大頭菜和浙江省的慈溪大頭菜等[3]。加工腌制大頭菜時(shí)，一般挑選個(gè)頭大、菜體完整、表面光滑、無(wú)粗大側(cè)根的大頭菜作為加工原料，因此畸形大頭菜、個(gè)頭小的大頭菜、大頭菜側(cè)根、須根等一般不會(huì)被利用，常被直接廢棄，導(dǎo)致環(huán)境污染，但這些次等大頭菜原料仍具有食用價(jià)值，棄之可惜。因此，充分將大頭菜腌制加工后剩余的這些次等原料轉(zhuǎn)化為食用資源，對(duì)于增加經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益都非常必要。本研究的目的是本著節(jié)約資源和合理利用資源的原則，將其開(kāi)發(fā)成為一種發(fā)酵型大頭菜復(fù)合調(diào)味食品，希望能為企業(yè)對(duì)大頭菜殘次原料的利用提供一種思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大頭菜原料(主要是個(gè)頭小的大頭菜、加工其他產(chǎn)品后的大頭菜邊角余料、大頭菜側(cè)根、須根)：某企業(yè)提供；辣椒、姜、蒜、香辛料、白酒：超市購(gòu)買；乳酸菌粉：四川高福記有限公司。

對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氫氧化鈉、硼酸鈉、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、酚酞、乙酸鋅、鹽酸等試劑：均為AR試劑；亞硝酸鈉：基準(zhǔn)試劑。

1.2 儀器

SHP-250型恒溫培養(yǎng)箱；PHS-3C型酸度計(jì)；磁力攪拌器；分光光度計(jì)；組織搗碎機(jī)；電子分析天平；DZ-500-2SB型真空封口機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 基本工藝流程

1.3.2 主要操作要點(diǎn)

將新鮮的個(gè)頭小的大頭菜、加工腌制大頭菜產(chǎn)品后的邊角余料、大頭菜側(cè)根、須根用水清洗干凈，剔除黑斑等，然后切制成0.3～0.5 cm左右的小段或小顆粒，晾曬脫水至鮮重的70.0%為宜。新鮮的紅辣椒、蒜瓣和姜清洗干凈后，按照質(zhì)量比45∶3∶2絞碎成0.3 cm的混合辣椒碎。把預(yù)處理好的大頭菜顆粒與辣椒碎以3∶2的質(zhì)量比配料，按照試驗(yàn)比例加入食鹽、菌粉、適量白酒和少量香料粉混合均勻，裝入小玻璃發(fā)酵壇中，在一定溫度條件下發(fā)酵，每隔一定時(shí)間測(cè)定總酸度、亞硝酸鹽及感官評(píng)分。

1.3.3 腌制發(fā)酵工藝的單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 乳酸菌粉添加量對(duì)發(fā)酵的影響

按質(zhì)量分別接種0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的菌粉，在食鹽濃度為4.0%、發(fā)酵溫度為30 ℃的條件下發(fā)酵8 d，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行總酸含量測(cè)定及感官評(píng)價(jià)，研究菌粉添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評(píng)分的影響。

1.3.3.2 食鹽添加量對(duì)發(fā)酵的影響

按質(zhì)量分別添加2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%的食鹽，在菌粉添加量為0.3%、發(fā)酵溫度為30 ℃的條件下發(fā)酵8 d，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行總酸含量測(cè)定及感官評(píng)價(jià)，研究食鹽添加量對(duì)產(chǎn)品發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評(píng)分的影響。

1.3.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

按照發(fā)酵工藝的流程，在鹽濃度為4.0%、菌粉添加量為0.3%、發(fā)酵溫度為30 ℃的條件下，分別發(fā)酵2，4，6，8，10，12 d，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行總酸含量測(cè)定及感官評(píng)價(jià)，研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評(píng)分的影響。

1.3.3.4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響

按照發(fā)酵工藝的流程，在鹽濃度為4.0%，菌粉添加量為0.3%的條件下，分別在18，21，24，27，30，33 ℃的條件下發(fā)酵8 d，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行總酸含量測(cè)定及感官評(píng)價(jià)，研究發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評(píng)價(jià)的影響。

1.3.4 腌制發(fā)酵工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取菌粉添加量(A)、食鹽添加量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)和發(fā)酵溫度(D)在單因素試驗(yàn)中較優(yōu)的發(fā)酵條件作為設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)的因素水平，以總酸和產(chǎn)品感官評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用多指標(biāo)正交試驗(yàn)分析方法對(duì)總酸和感官評(píng)分兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算，得出最終的綜合評(píng)定值，以L9(34)正交試驗(yàn)來(lái)確定最佳的腌制發(fā)酵工藝條件，其正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 產(chǎn)品發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量的變化規(guī)律

在正交試驗(yàn)獲得的最優(yōu)發(fā)酵條件下，每2 d測(cè)定產(chǎn)品的亞硝酸鹽含量。

1.3.6 殺菌溫度和時(shí)間的確定

通過(guò)對(duì)150 g包裝的產(chǎn)品在90，95，100 ℃ 3種溫度條件下分別殺菌8，10，12 min，并進(jìn)行保溫檢驗(yàn)，結(jié)合殺菌后的感官品質(zhì)和保溫效果篩選最佳殺菌工藝條件。

1.3.7 相關(guān)理化指標(biāo)測(cè)定方法、感官評(píng)價(jià)及綜合評(píng)定值的方法

產(chǎn)品亞硝酸鹽的測(cè)定：參照GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》。

產(chǎn)品總酸的測(cè)定：參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》。

產(chǎn)品感官分析評(píng)價(jià)：將樣品放置于白瓷盤(pán)中，由經(jīng)過(guò)本試驗(yàn)小組培訓(xùn)過(guò)的感官品評(píng)員10人對(duì)產(chǎn)品的色澤(30分)、氣味(30分)、滋味(30分)、質(zhì)地(10分)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和打分，以100分為滿分，最后以品評(píng)員的評(píng)分結(jié)果(取其平均值)來(lái)確定產(chǎn)品質(zhì)量，具體的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2[4-6]。

表2 產(chǎn)品感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The sensory evaluation standard of product

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel和SPSS 19對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 菌粉添加量對(duì)產(chǎn)酸和感官評(píng)分的影響

菌粉添加量對(duì)產(chǎn)酸和感官評(píng)分影響的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 菌粉加量對(duì)產(chǎn)酸和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of bacterial powder additive amount on total acid and sensory score

由圖1可知，隨著菌粉添加量的增加，產(chǎn)品發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)酸量總體呈不斷上升的趨勢(shì)。當(dāng)菌粉添加量在0.4%～0.6%時(shí)，產(chǎn)酸量升高趨于平緩，由顯著性分析可知0.4%～0.6%菌粉添加量時(shí)產(chǎn)品的產(chǎn)酸量差異不顯著(P>0.05)。這可能是因?yàn)榫厶砑恿吭龆鄷r(shí)，產(chǎn)酸菌由于自身的生長(zhǎng)繁殖也要消耗糖類物質(zhì)，致使產(chǎn)酸增幅減弱[8]。由圖1可知，產(chǎn)品感官評(píng)分則隨菌粉添加量的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)，在菌粉添加量為0.3%時(shí)產(chǎn)品的感官評(píng)分最高。這是由于菌粉添加量太低，產(chǎn)品發(fā)酵弱、酸度偏低，致使滋味不佳，感官評(píng)分低；反之，菌粉添加量太大，產(chǎn)品酸度則偏高，同時(shí)產(chǎn)品還因發(fā)酵速度過(guò)快而不利于相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)的生成[9]，產(chǎn)品風(fēng)味單調(diào)，香氣與滋味均較差，從而影響整體感官品質(zhì)。此外，過(guò)大的菌粉添加量還會(huì)造成生產(chǎn)成本加大。因此，綜合考慮產(chǎn)品酸度、感官評(píng)分和成本，選擇0.3%菌粉添加量較合適。

2.1.2 食鹽添加量對(duì)產(chǎn)酸和感官評(píng)分的影響

食鹽不僅影響發(fā)酵過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)還有調(diào)節(jié)發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味(咸淡)的重要作用。當(dāng)發(fā)酵過(guò)程中食鹽添加量過(guò)低時(shí)，在發(fā)酵初期腐敗微生物容易滋生，會(huì)影響發(fā)酵的順利進(jìn)行，且影響產(chǎn)品品質(zhì)；反之，若加鹽量過(guò)高，則又會(huì)抑制有益微生物的生長(zhǎng)繁殖，造成發(fā)酵速度慢、發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)[10]。

圖2 食鹽添加量對(duì)產(chǎn)酸和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of salt additive amount on total acid and sensory score

由圖2可知，產(chǎn)品總酸隨鹽度增加呈逐步下降的趨勢(shì)。主要是因?yàn)殡S著產(chǎn)品鹽度的逐漸增大，產(chǎn)酸菌活力被大大抑制，故產(chǎn)酸量逐漸減少。由圖2的感官評(píng)價(jià)可知，感官評(píng)分隨鹽度增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，在鹽度為5.0%時(shí)感官評(píng)分最高。這是由于當(dāng)鹽度低于5.0%時(shí)，鹽度越低產(chǎn)酸量越大，酸度太大則產(chǎn)品酸感太強(qiáng)，感官評(píng)分低；當(dāng)鹽度高于5.0%時(shí)，鹽度越高咸味越大，難以被消費(fèi)者接受而影響感官評(píng)分。適宜的鹽度既可抑制腐敗菌生長(zhǎng)，又可使產(chǎn)品酸咸適口，因此綜合考慮產(chǎn)品的總酸和感官評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇食鹽濃度5.0%為最佳。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸和感官評(píng)分的影響

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total acid and sensory score

發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)影響較大。若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不僅生產(chǎn)效率低，還會(huì)使產(chǎn)品酸感過(guò)強(qiáng)，適口性變差；若發(fā)酵時(shí)間太短，則產(chǎn)酸量不足、風(fēng)味平淡，且產(chǎn)品的“生沖”味和“生辣”味比較重，滋味不協(xié)調(diào)[11]。由圖3可知，產(chǎn)品中總酸的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈不斷增加，10 d后總酸增長(zhǎng)緩慢并趨于平緩，而感官評(píng)分隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵的第6天時(shí)產(chǎn)品的感官評(píng)分最高，綜合考慮產(chǎn)品總酸和感官評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇發(fā)酵時(shí)間為6 d最佳。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸和感官評(píng)分的影響

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸和感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on total acid and sensory score

溫度也是影響發(fā)酵速度和產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素之一。當(dāng)發(fā)酵溫度低時(shí)，產(chǎn)酸微生物的生長(zhǎng)繁殖速度慢，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)品易遭受腐敗菌感染，不利于酸的生成和相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)的形成；隨著溫度的升高，產(chǎn)酸微生物生長(zhǎng)繁殖加快，成為優(yōu)勢(shì)菌，發(fā)酵速度加快，總酸逐步增加，但過(guò)快的發(fā)酵速度產(chǎn)香弱，過(guò)高酸度會(huì)讓產(chǎn)品酸感太強(qiáng)、適口性變差。由圖4可知，產(chǎn)品總酸的含量隨著發(fā)酵溫度的升高呈增加趨勢(shì)，而感官評(píng)分隨著發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵溫度為27 ℃時(shí)，產(chǎn)品的感官評(píng)分最高，且產(chǎn)品發(fā)酵溫度高于30 ℃時(shí)，產(chǎn)品有一定的異味，綜合考慮產(chǎn)品總酸和感官品質(zhì)，故發(fā)酵溫度為27 ℃最佳。

2.2 正交試驗(yàn)的結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以菌粉添加量、食鹽添加量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度為探討因素，監(jiān)測(cè)感官評(píng)分和總酸含量，以產(chǎn)品的綜合評(píng)定值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果和分析見(jiàn)表3。

表3 產(chǎn)品發(fā)酵的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment for product fermentation

由表3正交試驗(yàn)極差R可知，影響產(chǎn)品綜合評(píng)定值的各因素的主次順序?yàn)镈>C>A>B，各因素的最佳組合為A3B1C3D2。由于該組合在正交試驗(yàn)的7組試驗(yàn)中出現(xiàn)，且此組合條件下產(chǎn)品的綜合評(píng)定值最高，因此不需再做驗(yàn)證試驗(yàn)，故確定產(chǎn)品發(fā)酵的最佳工藝條件為菌粉添加量0.4%、食鹽添加量4.0%、發(fā)酵時(shí)間8 d和發(fā)酵溫度27 ℃。

在表3試驗(yàn)結(jié)果中，食鹽添加量(B)因素的極差R與其他3個(gè)因素比較，相差較大，且值最小，故此因素的影響較小。因此，采用將極差最小的一項(xiàng)(食鹽添加量)作為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，其分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Variance analysis of the orthogonal experiment results

結(jié)果表明，發(fā)酵溫度(D)對(duì)產(chǎn)品的綜合評(píng)定值有顯著性影響(P<0.05)，菌粉添加量(A)、發(fā)酵時(shí)間(C)對(duì)產(chǎn)品的綜合評(píng)定值影響不顯著。

2.3 產(chǎn)品發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽的變化

長(zhǎng)期以來(lái)，亞硝酸鹽是蔬菜在腌制發(fā)酵過(guò)程中的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)[12]。亞硝酸鹽作為亞硝胺類化合物(強(qiáng)致癌物質(zhì))的前體物質(zhì)，常常容易在腌制發(fā)酵食品，如泡菜、酸菜等中產(chǎn)生和積累[13]，從而影響食品的安全性，威脅人們的健康。在2.2正交試驗(yàn)中篩選出的最佳工藝條件下(即菌粉添加量0.4%、食鹽添加量4.0%、發(fā)酵溫度27 ℃)，產(chǎn)品在發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量隨時(shí)間變化的規(guī)律見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽的變化Fig.5 Effect of fermentation time on nitrite in the fermentation process

由圖5可知，產(chǎn)品亞硝酸鹽含量呈先增加后逐步減少的總體變化規(guī)律。產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量在前4 d呈上升趨勢(shì)，在第2天和第4天增加幅度較大，差異顯著(P<0.05)，第4天達(dá)到峰值(6.72 mg/kg)；之后總體呈下降趨勢(shì)，第6天亞硝酸鹽下降幅度最大，與第4天相比差異顯著(P<0.05)，第8天之后產(chǎn)品亞硝酸鹽含量總體趨于穩(wěn)定，且差異不顯著(P>0.05)。在產(chǎn)品腌制發(fā)酵初期，產(chǎn)品中產(chǎn)酸菌相對(duì)含量較少，而產(chǎn)硝酸還原酶的雜菌含量較多，故產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐步升高，并出現(xiàn)一個(gè)亞硝酸鹽峰值；之后隨著產(chǎn)酸菌含量的增加，硝酸鹽還原菌的生長(zhǎng)繁殖被抑制[14]，同時(shí)產(chǎn)酸菌的大量產(chǎn)酸會(huì)使產(chǎn)品中亞硝酸鹽在酸性環(huán)境中被部分降解，故亞硝酸鹽含量又隨著發(fā)酵的進(jìn)行而逐步降低，使產(chǎn)品安全性得到提高[15]。本試驗(yàn)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)品亞硝酸鹽含量都符合四川泡菜(DB51/T 975-2009)地方標(biāo)準(zhǔn)的亞硝酸鹽限量要求(≤10 mg/kg)，更是遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)腌漬蔬菜亞硝酸鹽的限量指標(biāo)(≤20 mg/kg)[16]，安全性可靠。

2.4 殺菌工藝條件

本試驗(yàn)產(chǎn)品屬于發(fā)酵類的酸性蔬菜制品，因此適宜采用常壓殺菌。由于熱殺菌對(duì)該產(chǎn)品的感官品質(zhì)(氣味、滋味、色澤、質(zhì)地)會(huì)產(chǎn)生一定影響，因此在保證產(chǎn)品商業(yè)無(wú)菌的前提下，應(yīng)盡量降低殺菌強(qiáng)度(降低殺菌溫度和縮短殺菌時(shí)間)，以確保產(chǎn)品有良好的感官。本研究在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了100，95，90 ℃ 3個(gè)殺菌溫度，每個(gè)殺菌溫度分別設(shè)計(jì)了8，10，12 min 3個(gè)殺菌時(shí)間，產(chǎn)品經(jīng)殺菌后進(jìn)行感官品質(zhì)評(píng)價(jià)，并存放于恒溫培養(yǎng)箱30 ℃保溫10 d后，對(duì)脹袋及腐敗情況進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 殺菌試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of bactericidal experiment

由表5可知，采用90 ℃的殺菌溫度時(shí)，產(chǎn)品保溫過(guò)程中有不同程度的產(chǎn)氣或酸敗現(xiàn)象；而采用95 ℃和100 ℃殺菌溫度時(shí)，殺菌時(shí)間都需要10 min以上才能達(dá)到商業(yè)無(wú)菌的殺菌要求。結(jié)合殺菌后產(chǎn)品質(zhì)地、色澤、風(fēng)味等感官品質(zhì)變化情況可知，采用95 ℃殺菌12 min及100 ℃殺菌10 min以上時(shí)，產(chǎn)品會(huì)有不同程度色澤變暗、質(zhì)地變軟的現(xiàn)象。因此，綜合考慮，采用95 ℃殺菌10 min的殺菌工藝既可達(dá)到商業(yè)無(wú)菌的殺菌要求，又可保證產(chǎn)品良好的感官品質(zhì)。

3 結(jié)論

利用單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得產(chǎn)品發(fā)酵的最佳工藝條件為菌粉添加量0.4%、食鹽添加量4.0%、發(fā)酵時(shí)間8 d和發(fā)酵溫度27 ℃，方差分析表明，發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品的綜合評(píng)定值有顯著性影響(P<0.05), 菌粉添加量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品的綜合評(píng)定值影響不顯著；在此最佳發(fā)酵工藝條件下，產(chǎn)品亞硝酸鹽含量在發(fā)酵的第4天達(dá)到最高值6.72 mg/kg，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量低于10 mg/kg，符合安全要求；采用95 ℃殺菌10 min的殺菌工藝，產(chǎn)品既有良好的感官品質(zhì)，又達(dá)到了商業(yè)無(wú)菌的要求。