李穎暢，李雙燕，曹娜娜，劉雪飛，蔡友瓊

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

魷魚具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的氨基酸、還原糖等，屬于低脂肪高蛋白水產(chǎn)品，魷魚體內(nèi)含有大量的氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO），TMAO具有保持魚體內(nèi)氮的平衡及調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓的作用[1]。同時(shí)TMAO是水產(chǎn)品鮮味的主要成分[2]。魷魚在加熱過程中TMAO熱分解產(chǎn)生甲醛（formaldehyde，F(xiàn)A）、二甲胺（dimethylamine，DMA）和三甲胺（trimethylamine，TMA）[3-4]，魷魚中高含量FA給魷魚產(chǎn)品品質(zhì)和食用安全帶來了負(fù)面的影響[1]，同時(shí)對(duì)魷魚制品的出口也造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，魷魚在加工和運(yùn)輸過程中的FA超標(biāo)問題越來越受到人們的重視[5]。

美拉德反應(yīng)是一種普遍的非酶褐變現(xiàn)象，被廣泛應(yīng)用于食品加工、煙草加香等多個(gè)領(lǐng)域[6-7]。魷魚在加工和貯藏過程發(fā)生的褐變反應(yīng)主要由美拉德反應(yīng)引起[8]。魷魚體內(nèi)含有高含量的蛋白質(zhì)和水解氨基酸，再加上魷魚本身含有的半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖，以及調(diào)味料中乳糖、蔗糖等水解產(chǎn)生的還原糖為美拉德反應(yīng)提供了必須的反應(yīng)物[9]。魷魚在加工過程中，特別是蒸煮、烘烤的環(huán)境中，美拉德反應(yīng)難免發(fā)生。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)魷魚制品中美拉德反應(yīng)與TMAO分解的研究較少，Vaisey[10]報(bào)道了半胱氨酸（Cys）和Fe2+或Cys和血紅蛋白能催化TMAO分解產(chǎn)生TMA、少量DMA和FA。李豐[11]研究發(fā)現(xiàn)乳糖促進(jìn)TMAO熱分解形成FA，認(rèn)為魷魚絲貯藏過程中FA的產(chǎn)生與美拉德反應(yīng)有關(guān)。同時(shí)，李薇霞[12]研究奶糖中FA產(chǎn)生機(jī)理時(shí)，認(rèn)為FA的產(chǎn)生與美拉德反應(yīng)密不可分；因?yàn)轸滛~在加工過程中存在美拉德反應(yīng)，推測(cè)FA產(chǎn)生可能與氨基酸和還原糖有關(guān)[13]。目前大多數(shù)研究均通過外源添加氨基酸或者還原糖探究對(duì)魷魚中TMAO熱分解的影響，但關(guān)于美拉德反應(yīng)對(duì)TMAO分解反應(yīng)的影響及機(jī)制研究卻鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行體外模擬實(shí)驗(yàn)之前對(duì)魷魚中氨基酸和還原糖的成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)魷魚所含的氨基酸中賴氨酸（Lys）、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量較多；還原糖中Gal含量最多。又因?yàn)長(zhǎng)ys最易與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，因此以TMAO-Fe（II）模擬體系為研究對(duì)象，將Lys、Gal以及Lys-Gal的混合溶液分別加入到模擬體系當(dāng)中進(jìn)行反應(yīng)，研究在不同的濃度比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度下對(duì)模擬體系中TMAO降解的變化規(guī)律。并采用DSC技術(shù)探討Lys、Gal、Lys-Gal對(duì)TMAO降解的作用機(jī)制，為下一步研究蒸煮和煎烤魷魚中TMAO的熱分解機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TMAO標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%） 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所；D-Gal、L-Lys（純度＞98%）生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇（色譜純） 北京DIKMA公司；無水硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對(duì)甲苯磺酰氯 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；甲苯 上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鉀、鐵氰化鉀、氯化鐵 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上無特殊說明均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外-可見分光光度儀 日本島津儀器有限公司；冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司； GC7890氣相色譜儀、液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；DSCQ2000差示熱量掃描儀 美國(guó)TA公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；雷磁PHS-C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

TMAO-Fe（II）體系的制備：20 mmol/L TMAO+0.2 mmol/L Fe（II）+20 mmol/L Tris-乙酸（pH 7）。

試劑配制：用蒸餾水將Lys、Gal配成0.1 mol/L的母液備用。

1.3.1 還原力和褐變程度的測(cè)定

取一定量的Lys和Gal的母液將兩者混合定容至100 mL，使溶液中Lys和Gal濃度均為0.08 mol/L。再分別取一定量的Lys、Gal母液各加入蒸餾水定容到100 mL，使?jié)舛葹?.08 mol/L。取配好的各溶液10 mL于25 mL具塞試管中，在100 ℃水浴鍋中反應(yīng)90 min后，冷卻備用，進(jìn)行還原力和褐變程度的測(cè)定。

還原力的測(cè)定參考Yen等[14]建立的方法。

褐變程度測(cè)定參考Ajandouz等[15]的方法。將反應(yīng)后的溶液稀釋100 倍，分別在294 nm和420 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，用吸光度表示褐變程度。

1.3.2 溫度對(duì)模擬體系中TMAO熱分解的影響

分別取2 mL Lys溶液、Gal溶液、Lys-Gal溶液與2 mL TMAO-Fe（II）溶液（濃度比為4∶1）組成反應(yīng)體系，分別于60、70、80、90、100 ℃條件下反應(yīng)30 min后，迅速冷卻，加入1 mL 7.5%的三氯乙酸終止反應(yīng)，5 000 r/min離心15 min，測(cè)定TMAO、FA、DMA、TMA含量。

1.3.3 時(shí)間對(duì)模擬體系中TMAO熱分解的影響

分別取2 mL Lys溶液、Gal溶液、Lys-Gal溶液與2 mL TMAO-Fe（II）溶液（濃度比為4∶1）組成反應(yīng)體系，于100 ℃反應(yīng)條件下分別反應(yīng)0、15、30、45、60、75 min后，迅速冷卻，加入1 mL 7.5%的三氯乙酸終止反應(yīng)，5 000 r/min離心15 min后，測(cè)定TMAO、FA、DMA、TMA含量。

1.3.4 反應(yīng)物量比對(duì)模擬體系中TMAO熱分解的影響

分別取2 mL Lys溶液、Gal溶液、Lys-Gal溶液與2 mL TMAO-Fe（II）溶液組成反應(yīng)體系，使溶液中的Lys、Gal、Lys-Gal與TMAO-Fe（II）的濃度比分別為1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1于100 ℃條件下反應(yīng)30 min后，迅速冷卻，加入1 mL 7.5%的三氯乙酸終止反應(yīng)，5 000 r/min離心15 min后，測(cè)定TMAO、FA、DMA、TMA含量。

1.3.5 體系中TMAO、TMA、FA、DMA的測(cè)定方法

TMA測(cè)定參考朱軍莉等[16]的方法。TMAO含量測(cè)定：先將TMAO還原為TMA后進(jìn)行測(cè)定，取2 mL的反應(yīng)液加入1%的三氯化鈦溶液0.25 mL，80 ℃水浴90 s，冷卻后同TMA測(cè)定方法。

DMA測(cè)定參考賈佳[17]的方法。FA測(cè)定參考Li Jianrong等[18]建立的高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中FA含量。1.3.6 DSC分析用專用坩堝稱取5～10 mg的樣品。測(cè)試條件：溫度20～200 ℃，氮?dú)鈿夥眨?5 ℃/min條件進(jìn)行升溫。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Origin 9.1軟件作圖，SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lys、Gal、Lys-Gal的還原力和褐變程度

表1 Lys、Gal、Lys-Gal的還原力和褐變程度Table 1 Reducing powers and browning degrees of Lys, Gal and Lys-Gal

吳帥帥等[19]研究發(fā)現(xiàn)DMA、FA的生成與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）的抗氧化性有相關(guān)性。此外有研究表明一些具有還原性的物質(zhì)使TMAO發(fā)生非酶降解[10]，且TMAO非酶途徑與水產(chǎn)品的貯藏溫度和還原條件有關(guān)。因此研究Lys、Gal、Lys-Gal溶液的褐變程度和還原力，并探究其抗氧化性，為研究Lys、Gal、Lys-Gal對(duì)TMAO降解的影響奠定基礎(chǔ)。由表1可以看出，Lys、Gal和Lys-Gal都發(fā)生了不同程度的褐變，但是Lys-Gal在高溫條件下反應(yīng)生成MRPs的紫外吸光度和褐變程度顯著（P＜0.05）增加，高于單獨(dú)的Lys和Gal。這是因?yàn)殡S著Lys-Gal美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，促進(jìn)了褐色素物質(zhì)的生成，從而加深了反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度[20]。Hwang等[21]報(bào)道了MRPs的還原力與紫外吸光度和褐變程度有關(guān)。Yilmaz等[22]報(bào)道了MRPs水溶液在100 ℃和200 ℃條件下分別加熱10、20、30 min均具有抗氧化活性。還原力是反應(yīng)物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)，通常樣品的還原力與抗氧化能力呈正相關(guān)[23]。從表1可以看出，Lys-Gal反應(yīng)產(chǎn)生的MRPs在還原力方面明顯高于單獨(dú)的糖和氨基酸，這是因?yàn)樵诜磻?yīng)過程中MRPs可以提供電子，使Fe3+還原為Fe2+，起到還原作用[24]。

2.2 溫度對(duì)模擬體系中TMAO降解的影響

圖1 加熱溫度對(duì)各體系中TMAO、FA、DMA和TMA含量變化的影響Fig. 1 Effects of heating temperature on the contents of TMAO, FA,DMA and TMA in each model system

通過上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lys-Gal產(chǎn)生的MRPs產(chǎn)物在還原力和褐變程度方面比Gal、Lys強(qiáng)，因此進(jìn)一步研究了在60～100 ℃加熱后Lys-Gal、Gal、Lys對(duì)TMAO熱分解的變化規(guī)律，由圖1可見，隨著反應(yīng)溫度的升高，對(duì)照組和處理組的TMAO含量均降低表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，逐漸熱分解為FA、DMA、TMA。相對(duì)于對(duì)照組、Gal-TMAO-Fe（II）和Lys-TMAO-Fe（II）而言，溫度越高Lys-Gal-TMAO-Fe（II）體系中TMAO降解程度越顯著（P＜0.05），相應(yīng)FA、DMA、TMA的含量也最高，但在90～100 ℃之間Lys-Gal處理組的FA含量有下降的趨勢(shì)，分析可能是隨溫度的升高，體系中其他反應(yīng)產(chǎn)物濃度越來越大，影響了FA的溶解度，因此FA含量有下降的趨勢(shì)[25]。但整個(gè)過程FA含量仍是增加的，朱軍莉等[26]研究發(fā)現(xiàn)加熱可能會(huì)使FA揮發(fā)，使FA含量略有下降，但是FA含量總體增加。本實(shí)驗(yàn)中Gal、Lys在較高溫度下可以促進(jìn)TMAO分解，這一結(jié)果與陳帥等[27]研究結(jié)果一致。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也表明了Lys-Gal的混合物在較高的溫度下對(duì)TMAO降解的促進(jìn)作用最強(qiáng)，其次是Gal、Lys。

2.3 時(shí)間對(duì)模擬體系中TMAO降解的影響

圖2 加熱時(shí)間對(duì)各體系中TMAO、FA、DMA和TMA含量變化的影響Fig. 2 Effects of heating time on the contents of TMAO, FA, DMA and TMA in each model system

由圖2可知，隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組和3 個(gè)處理組的TMAO熱分解程度增加，其中Lys-Gal-TMAO-Fe（II）中的TMAO含量減少最顯著（P＜0.05），從最初的2 644.4 mg/L下降至800.83 mg/L，降解率為69.71%，分別是對(duì)照組、Gal-TMAO-Fe（II）、Lys-TMAO-Fe（II）組的1.7、1.3 倍和1.4 倍，相應(yīng)的分解產(chǎn)物FA、DMA、TMA也明顯高于另外3 組。這是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Lys-Gal反應(yīng)生成MRPs的抗氧化性更高[28]，還原力更大，促進(jìn)了TMAO非酶途徑的降解[19]。從而使TMAO降解率更大，F(xiàn)A、DMA、TMA生成量最多。

2.4 反應(yīng)物量比對(duì)模擬體系中TMAO降解的影響

圖3 反應(yīng)物量比對(duì)各體系中TMAO、FA、DMA和TMA含量變化的影響Fig. 3 Effects of reactant ratio on changes in TMAO, FA, DMA and TMA contents in each model system

由圖3可知，加入Gal、Lys、Lys-Gal后TMAO含量下降，F(xiàn)A、DMA、TMA含量有所升高均高于對(duì)照組，說明Gal、Lys、Lys-Gal能促進(jìn)TMAO的降解，隨著Gal、Lys、Lys-Gal濃度的增大，TMAO降解速度和FA、DMA、TMA的生成速度逐漸增快，Lys-Gal-TMAOFe（II）中的各指標(biāo)變化大于Lys-TMAO-Fe（II）和Gal-TMAO-Fe（II）兩組，并且各指標(biāo)隨著濃度的增加呈顯著變化（P＜0.05）。當(dāng)Lys-Gal與TMAO的比值為4∶1時(shí)TMAO質(zhì)量濃度降為1 217.81 mg/L，相應(yīng)的分解產(chǎn)物FA、DMA、TMA的生成量最多。這是因?yàn)殡S著反應(yīng)濃度的增加，Lys-Gal生成的MRPs可以阻止Fe2+被氧化從而促進(jìn)TMAO分解，使FA、DMA、TMA生成量高于其他組。

2.5 Lys、Gal、Lys-Gal對(duì)模擬體系中TMAO熱分解的影響

通過分析DSC曲線形狀的變化可反映樣品的穩(wěn)定性[29]。圖4A顯示了隨著溫度的升高，TMAO標(biāo)準(zhǔn)品逐漸出現(xiàn)了均勻失重的現(xiàn)象，可以看出從55 ℃開始TMAO標(biāo)準(zhǔn)品的DSC曲線圖向下呈吸熱狀態(tài)，在98.75 ℃時(shí)出現(xiàn)最小值，這是因?yàn)門MAO為標(biāo)準(zhǔn)品純度為98%，其所含雜質(zhì)揮發(fā)所致；整個(gè)過程無明顯的吸熱和放熱峰，表明TMAO標(biāo)準(zhǔn)品在整個(gè)揮發(fā)過程中只需要吸收熱量。這一結(jié)果與朱軍莉等[30]研究的TMAO熱分解結(jié)果一致。

圖4 TMAO（A）、TMAO-Fe（II）（B）、Lys-TMAO-Fe（II）（C）、Gal-TMAO-Fe（II）（D）、Lys-Gal-TMAO-Fe(II)（E）熱分解的DSC圖Fig. 4 DSC curves for thermal decomposition of TMAO (A), TMAOFe (II) (B), Lys-TMAO-Fe (II) (C), Gal-TMAO-Fe (II) (D), and Lys-Gal-TMAO-Fe (II) (E)

圖4 B顯示了TMAO-Fe（II）的熱分解情況，可以明顯看出DSC曲線產(chǎn)生了吸熱和放熱峰，在93.41 ℃時(shí)出現(xiàn)第一階段的吸熱峰，可能是樣品從固體向熔融狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過渡態(tài)[31]，此時(shí)TMAO開始熔化發(fā)生固態(tài)相變；第2階段的吸熱峰出現(xiàn)在162.28 ℃，此階段TMAO開始分解。說明加入Fe2+后促進(jìn)了TMAO高溫分解，使主要的分解反應(yīng)在較低的溫度下發(fā)生。可以看出在126.18 ℃出現(xiàn)了放熱峰，可能是由于Fe2+在高溫的條件下容易被氧化為Fe3+所致[30]。

圖4C、D分別顯示了Gal-TMAO-Fe（II）、Lys-TMAO-Fe（II）的分解過程，Gal-TMAO-Fe（II）中吸熱階段分別在68.35 ℃和137.04 ℃的時(shí)候出現(xiàn)吸熱峰，在100.03 ℃出現(xiàn)放熱峰；Lys-TMAO-Fe（II）中的2 個(gè)吸熱階段在83.6 ℃和130.95 ℃時(shí)出現(xiàn)吸熱峰，在111.01 ℃出現(xiàn)放熱峰，與TMAO-Fe（II）體系的DSC曲線圖相比，加入Gal、Lys后吸熱和放熱峰的位置都出現(xiàn)了前移，TMAO熔融和分解溫度提前，又因?yàn)檎麄€(gè)實(shí)驗(yàn)過程的處理?xiàng)l件相同，所以Gal、Lys對(duì)TMAO降解的促進(jìn)作用大于Fe2+，更容易使TMAO進(jìn)行分解。

圖4E顯示了Lys-Gal-TMAO-Fe（II）的DSC曲線圖，出現(xiàn)了3 個(gè)吸熱峰，第1階段吸熱峰溫度為65.28 ℃，與之前4 個(gè)樣品的DSC圖相比較，TMAO分解溫度明顯變低，并且Lys-Gal使TMAO分解階段由2 個(gè)吸熱階段變?yōu)榱? 個(gè)吸熱階段，分析可能的原因是因?yàn)長(zhǎng)ys-Gal的還原力較高，使TMAO的分解反應(yīng)在更低的溫度下進(jìn)行，從而加速了TMAO的分解。從整個(gè)DSC圖可以看出Lys-Gal相較于單個(gè)的糖和氨基酸更能降低TMAO的分解溫度。

3 結(jié) 論

相對(duì)Lys和Gal，Lys-Gal混合物反應(yīng)形成的MRPs表現(xiàn)出更高程度的褐變和更好的還原能力，其抗氧化能力更強(qiáng)。

Gla、Lys、Lys-Gal這3 種添加物均可以促進(jìn)TMAO降解生成FA、DMA和TMA，相同條件下Lys-Gal-TMAO-Fe（II）體系反應(yīng)程度更高一些，TMAO降解程度更大，這可能是因?yàn)長(zhǎng)ys-Gal在高溫條件下生成MRPs的還原性較強(qiáng)，從而更容易促進(jìn)TMAO降解。

從DSC圖可以看出Lys、Gal、Lys-Gal可以使TMAOFe（II）體系熱反應(yīng)的熱分解溫度明顯降低，表明3 種物質(zhì)參與并加快了TMAO-Fe（II）的熱分解反應(yīng)，使TMAO-Fe（II）中TMAO分解需要較少的能量，加速TMAO的熱分解，產(chǎn)生更多的FA、DMA和TMA。