王婧，李敏，高娉娉，趙美，楊婕

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730070)

冰葡萄酒屬于高檔甜型葡萄酒，因原料稀缺，酒體醇厚甘甜、香味濃郁而成為葡萄酒中的珍品[1]。近年來(lái)，由于全球氣候變暖，使釀酒葡萄果實(shí)出現(xiàn)成熟速度加快，糖分含量逐漸升高，酸度逐漸下降，風(fēng)味物質(zhì)含量降低等趨勢(shì)[2]，原料也不可避免的出現(xiàn)酸度缺乏、香氣復(fù)雜性欠缺等問(wèn)題。酵母菌在葡萄酒釀造過(guò)程中的代謝活動(dòng)會(huì)伴隨著甘油、酸類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)等物質(zhì)的生成而對(duì)葡萄酒質(zhì)量風(fēng)格產(chǎn)生重要影響[3]。近年來(lái)，隨著對(duì)葡萄酒相關(guān)酵母菌種的深入研究發(fā)現(xiàn)，一些具有潛在應(yīng)用價(jià)值的非釀酒酵母具有獨(dú)特的代謝通路和較強(qiáng)的酶活力，可以產(chǎn)生較低的酒精、增加甘油、調(diào)節(jié)酸度、釋放甘露糖蛋白或多糖，改善葡萄酒口感、增強(qiáng)顏色穩(wěn)定性以及香氣復(fù)雜性，且不同種屬的非釀酒酵母的貢獻(xiàn)也各不相同[4]。耐熱克魯維酵母(Lachanceathermotolerans)屬于Lachancea屬[5]，在酒精發(fā)酵過(guò)程中主要產(chǎn)生乳酸以增加溫帶葡萄種植區(qū)葡萄酒的酸度，有“生物酸化劑”之稱(chēng)[6]。此外，L.thermotolerans亦能夠改善葡萄酒的一些質(zhì)量參數(shù)[7-12]。戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)在非釀酒酵母中具有較強(qiáng)的酒精發(fā)酵能力[13]，與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)相比能夠耐受葡萄汁中較高的滲透壓[14]，產(chǎn)生低濃度的乙酸和高級(jí)醇類(lèi)，較高濃度的萜烯類(lèi)物質(zhì)[15]。在工業(yè)化水平上，T.delbrueckii也是最早進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用的非釀酒酵母菌株[16]。目前關(guān)于L.thermotolerans和T.delbrueckii在干型葡萄酒上的研究報(bào)道較多，而在冰葡萄酒中應(yīng)用研究報(bào)道較少，尤其冰葡萄汁的發(fā)酵條件與其他類(lèi)型的葡萄酒差異較大，其酒精發(fā)酵是在高滲透壓和高濃度SO2以及低溫條件下進(jìn)行，因此，針對(duì)非釀酒酵母菌株在冰葡萄酒生境下釀造特性的研究對(duì)于酵母資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有積極意義。

本試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的L.thermotolerans和T.delbrueckii菌株的嗜殺性、生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)、耐受性、在冰葡萄酒生境下的發(fā)酵特性以及主要揮發(fā)性香氣化合物種類(lèi)、含量等進(jìn)行分析，旨在評(píng)價(jià)兩菌株在冰葡萄酒釀造中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘貴人香’冰葡萄汁：2018年11月購(gòu)于甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限責(zé)任公司，含糖量為34.45 °Brix、可滴定酸(以酒石酸計(jì))6.75 g/L；當(dāng)天運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室，加入60 mg/L SO2于4 ℃冰箱貯藏備用。

供試菌株Lachanceathermotolerans:LT1保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC,保藏編號(hào)33099)；菌株LT2由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選于自然發(fā)酵的葡萄醪中，根據(jù)其在WLN(wallerstein laboratory nutrient)鑒別培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)測(cè)序，其序列在NCBI上blast比對(duì)與Lachanceathermotolerans的序列100%匹配(登錄號(hào)MH472648.1)；菌株LT3保藏于CICC(保藏編號(hào)2.4066)。Torulasporadelbrueckii：TD1菌株來(lái)源于上海工業(yè)試驗(yàn)所(保藏編號(hào)1004)；菌株TD2來(lái)源于山東扳倒井股份有限公司(保藏編號(hào)33295)；菌株TD3來(lái)源于甘肅省科學(xué)院生物研究所(保藏編號(hào)32851)。釀酒酵母活性干粉：CECA(編號(hào)SC)，安琪酵母公司提供；敏感菌株S.cerevisiae1 296：西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院贈(zèng)送。

1.2 儀器與試劑

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YEPD)培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉10.0、葡萄糖20.0、蛋白胨20.0、瓊脂20.0；YEPD-MB培養(yǎng)基：在YEPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，用0.1 mol/L的檸檬酸磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.6后，加入20.0 g/L瓊脂和0.3 g/L亞甲基藍(lán)指示劑。以上培養(yǎng)基均現(xiàn)用現(xiàn)配，并于121 ℃高壓滅菌20 min備用。

主要試劑：2-辛醇(色譜純)，SIGMA-ALDRICH(上海)貿(mào)易有限公司；L-蘋(píng)果酸和L-乳酸(色譜純)，上海源葉生物科技有限公司；NaOH、NaCl、Na2CO3、鹽酸、醋酸鈉、醋酸、無(wú)水葡萄糖等試劑(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器：SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；500051S立式高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；SPX-150-II生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Genesis 10 s紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、Ultimate 3 000高效液相色譜儀、TRA-CE1310-ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化和種子液制備

挑取供試菌株單菌落于YEPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，以2%的接種量分別接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行酵母菌接種試驗(yàn)(細(xì)胞生物量均達(dá)到108CFU/mL)。

1.3.2 菌株嗜殺性測(cè)定

參照ULLIVARRI等[17]的牛津杯抑菌法。將敏感菌株S.cerevisiae1296 以2%的接種量接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h后，稀釋菌懸液至107CFU/mL，取100 μL涂布于YEPD-MB培養(yǎng)基，再取200 μL供試菌株的菌懸液分別加入牛津杯中，28 ℃培養(yǎng)48 h后，觀(guān)察并測(cè)定酵母菌株周?chē){(lán)色的死菌帶，測(cè)定抑菌圈直徑與菌落直徑，其差值表示抑菌圈大小。

1.3.3 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

參照楊婕等[18]的方法并略作修改。分別挑取各供試菌株的單菌落于YEPD液體培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，再以2%的接種量分別接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，16 ℃條件下培養(yǎng)，每隔2 h取250 μL菌液于離心管中，以未接種的YEPD培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD630 nm的吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.4 菌株耐受性測(cè)定

參照楊婕等[18]和劉燦珍等[19]的方法并略作修改。以釀酒酵母SC為對(duì)照，分別測(cè)定3株L.thermotolerans(LT1、LT2、LT3)和3株T.delbrueckii(TD1、TD2、TD3)菌株的耐高糖、耐高酒精、耐高濃度SO2及耐低溫性能。將各菌株種子液以2%的接種量分別接種于葡萄糖質(zhì)量濃度分別為250、300、350、400、450、500 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為6%、9%、12%、15%；SO2質(zhì)量濃度分別為100、200、300、400 mg/L，溫度為10、13、16、19 ℃的YEPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同處理下的供試酵母菌株的OD630 nm的吸光值。

1.3.5 菌株發(fā)酵特性試驗(yàn)

將各菌株種子液以2%接種量分別接種于水浴殺菌處理的冰葡萄汁中進(jìn)行純種發(fā)酵(初始菌體數(shù)量均為107CFU/mL)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行。其中，水浴滅菌處理是將冰葡萄汁分裝于無(wú)菌棕色罐中，裝液量為70%，60 ℃水浴10 min[2]，水浴處理后取樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，其滅菌后菌落總數(shù)小于10 CFU/mL，具有可行性。

1.3.5.1 乳酸測(cè)定

參照BUGLASS等[20]和PEREZ等[21]方法，并略作修改，采用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：色譜柱BDS HYPERSILC18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器；流動(dòng)相為0.005 mol/L的硫酸水溶液；流速0.5 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

定性定量：將不同濃度的乳酸標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)樣，根據(jù)保留時(shí)間、出峰時(shí)間進(jìn)行定性；以不同標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，出峰面積進(jìn)行定量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到乳酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程(y=10.768x+0.035 5，R2=0.999 7)。

1.3.5.2 酒樣理化指標(biāo)測(cè)定

參照GB/T 15 038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]對(duì)殘?zhí)恰⒁掖俭w積分?jǐn)?shù)、揮發(fā)酸、總酸等基本理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 小容器發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.6.1 ‘貴人香’冰葡萄酒釀造工藝

冰葡萄酒釀造工藝參照李景明等[1]的方法；巴殺處理參照BENITO等[2]方法并略作修改:

冰葡萄汁→加SO2(60 mg/L)、果膠酶(20 mg/L)處理→巴氏殺菌處理(65 ℃，10 min)→接種試驗(yàn)→16 ℃(低溫發(fā)酵)→終止發(fā)酵→倒罐→陳釀→指標(biāo)測(cè)定

1.3.6.2 菌株單獨(dú)接種試驗(yàn)

將各菌株種子液分別以2%接種量接種于水浴殺菌處理的冰葡萄汁中進(jìn)行純種發(fā)酵(初始菌體數(shù)量均為107CFU/mL)，將接種酒樣置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%～11%時(shí)降溫至0 ℃左右，并添加SO2至120 mg/L，終止發(fā)酵，密封陳釀3個(gè)月后測(cè)定主要理化指標(biāo)及揮發(fā)性香氣化合物。

1.3.7 揮發(fā)性化合物測(cè)定

參照王玉華等[8]的方法，采用頂空固相微萃取-色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrum, HS-SPME-GC-MS)進(jìn)行測(cè)定。

HS-SPME處理：取8 mL酒樣于萃取瓶中，加入2.40 g NaCl及10 μL 8.82 mg/L 2-辛醇(內(nèi)標(biāo)物)，放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子密封后，置于磁力攪拌器上搖勻，于40 ℃下水浴平衡30 min，插入萃取頭磁力攪拌吸附富集30 min。

GC-MS條件：DB-WAX(60 m×2.5 mm，0.25 μm)色譜柱；柱升溫程序：40 ℃保持7 min，以4 ℃/min升至200 ℃，保持8 min；載氣：He，純度99.99%；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；不分流進(jìn)樣。電子轟擊離子源(EI)；離子源能量70 eV；傳輸線(xiàn)溫度：220 ℃；離子源溫度：240 ℃；質(zhì)譜掃描范圍50～350m/z。

定性分析：采用質(zhì)譜全離子掃描圖譜，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室在相同檢測(cè)條件下建立的各化合物的保留時(shí)間、保留指數(shù)和質(zhì)譜信息以及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索比對(duì)進(jìn)行定性分析。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，按公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

(1)

式中：ρ，香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度；ρ內(nèi)，內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度；A1，測(cè)得香氣物質(zhì)的峰面積；A，測(cè)得內(nèi)標(biāo)物的峰面積；f，內(nèi)標(biāo)物的校正因子，f=1。

氣味活性值(odor activity value, OAV)：香氣物質(zhì)的含量與嗅覺(jué)閾值的比值。

1.3.8 感官分析

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]。按表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)給酒樣打分[23-24]。

表1 冰葡萄酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of ice wine

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan’s多重比較在置信區(qū)間P<0.05下對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，對(duì)不同處理酒樣的香氣化合物進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株嗜殺性測(cè)定

嗜殺性是釀酒酵母生理特性的重要指標(biāo)之一，嗜殺性強(qiáng)的菌株能更好的保障葡萄酒正常的發(fā)酵過(guò)程，拮抗其他微生物的干擾。圖1為6株供試菌株對(duì)于敏感菌株S.cerevisiae1296的嗜殺性。由圖1可知，3株L.thermotolerans具有嗜殺性，抑菌圈的直徑分別為2.32、2.8和2.25 mm，其中LT2的嗜殺性最強(qiáng)。3株T.delbrueckii中只有TD2具有嗜殺性，抑菌圈的大小約為2.3 mm。

圖1 供試菌株嗜殺性結(jié)果Fig.1 Homicidal results of the tested strains

2.2 L.thermotolerans和T.delbrueckii供試菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

由圖2可知，在16 ℃低溫條件下，3株L.thermotolerans菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同(圖2-a)，均經(jīng)過(guò)了4～6 h的延滯期，然后需8～10 h的指數(shù)生長(zhǎng)期，在第18 小時(shí)以后菌體數(shù)量達(dá)到穩(wěn)定期。在指數(shù)生長(zhǎng)期，L.thermotolerans的生長(zhǎng)速率略低于對(duì)照SC，但達(dá)到穩(wěn)定期后菌體數(shù)量基本一致。3株T.delbrueckii在經(jīng)過(guò)6 h的延滯期后需10～14 h的指數(shù)生長(zhǎng)期，并于第20～22小時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期(圖2-b)。3株T.delbrueckii菌株在指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率明顯低于SC，達(dá)到穩(wěn)定期后菌體數(shù)量也均較低于SC。

a-L.thermotolerans菌株;b-T.delbrueckii菌株圖2 供試菌株在YEPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.2 Growth curve of tested strains in YEPD medium

2.3 菌株耐受性分析

2.3.1 高糖耐受性

冰葡萄酒是在低溫下高糖發(fā)酵的一種甜型葡萄酒，冰葡萄汁中的糖度通常大于350 g/L，是發(fā)酵液中高滲透壓的主要因素，對(duì)酵母的生長(zhǎng)繁殖具有一定脅迫抑制作用[25]。由圖3-a可知，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，釀酒酵母SC及供試的6株非釀酒酵母菌株的OD值均呈下降趨勢(shì)，但各菌株表現(xiàn)出的耐受性差異較大。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度在250～400 g/L時(shí)，所有菌株的OD值均大于1.2,但 LT1、LT3和TD1菌株的OD值顯著低于其他菌株；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到500 g/L時(shí)，供試的6株非釀酒酵母菌株的OD值顯著低于SC，其中，TD1菌株的OD值最低(約為0.6)，只能進(jìn)行微弱生長(zhǎng)，LT2菌株顯著高于其他幾株非釀酒酵母菌株。因此，本試驗(yàn)中3株L.thermotolerans菌株和TD2、TD3菌株對(duì)高糖環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)。

a-葡萄糖;b-SO2;c-乙醇;d-溫度圖3 供試菌株在不同條件下的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of tested strains under different conditions 注：不同字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3.2 高SO2的耐受性

在冰酒釀造中，當(dāng)達(dá)到所需酒度時(shí)需要終止發(fā)酵，通常采取的措施是添加高濃度SO2及降低溫度。如圖3-b所示，以釀酒酵母SC為對(duì)照，6株供試菌株的OD值均隨著SO2質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但LT1菌株與其他菌株相比對(duì)SO2的敏感性較強(qiáng)，當(dāng)SO2質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)其生長(zhǎng)受到明顯抑制；菌株LT2、LT3在SO2質(zhì)量濃度達(dá)到400 mg/L其耐受性與SC差異不顯著，但顯著高于3株T.delbrueckii菌株，由此可知，菌株LT2、LT3具有非常強(qiáng)的SO2耐受性，而3株T.delbrueckii菌株之間對(duì)SO2耐受性無(wú)顯著差異。

2.3.3 乙醇耐受性

大多數(shù)非釀酒酵母由于酒精耐受性不高而只能存在于葡萄酒酒精發(fā)酵的前期和中期。而本研究中6株非釀酒酵母均具有較強(qiáng)的乙醇耐受性，由圖3-c可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到15%時(shí)，耐受性最低的LT3菌株的OD值也達(dá)到了1.5，其次，除了LT3和TD3菌株，其他4株供試非釀酒酵母菌株的OD值與釀酒酵母SC的差異不大，表明供試的幾株非釀酒酵母均具有良好的乙醇耐受性，這一結(jié)果與已有報(bào)道結(jié)果基本一致[19，26]。

2.3.4 低溫耐受性

冰葡萄汁通常于初冬季節(jié)才能獲取，通常將冰酒釀造溫度控制在10～19 ℃的低溫條件下進(jìn)行。由圖3-d可知，當(dāng)溫度在10 ℃時(shí)，供試菌株中只有釀酒酵母SC和TD2菌株的OD值大于0.5，表現(xiàn)出微弱的生長(zhǎng)。隨著溫度升高，供試菌株的OD值均呈上升趨勢(shì)。當(dāng)溫度上升到16 ℃時(shí)，除LT1菌株外其他菌株的OD值均大于1.0，當(dāng)溫度達(dá)到19 ℃時(shí)，供試菌株的OD值均大于1.2，然而6株非釀酒酵母的OD值均顯著低于SC(OD值1.8)，其中TD1、TD2菌株的OD值均大于1.4，對(duì)低溫的適應(yīng)性較優(yōu)于TD3和LT2菌株，LT1和LT3菌株的低溫適應(yīng)性弱于其他菌株。

2.4 L.thermotolerans菌株乳酸生成量

對(duì)于冰葡萄酒來(lái)說(shuō)，適量的有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)可提高葡萄酒的風(fēng)味和口感，其甜酸協(xié)調(diào)的口感是冰葡萄酒的一個(gè)重要感官標(biāo)準(zhǔn)[8]，L.thermotolerans主要代謝特點(diǎn)是能夠產(chǎn)生乳酸。由圖4可知，在發(fā)酵溫度為16 ℃的條件下，3株L.thermotolerans菌株對(duì)冰葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中能夠代謝產(chǎn)生L-乳酸，LT1、LT2和LT3均在第6天時(shí)達(dá)到最大值，分別為1.970、2.195和1.705 g/L，可以看出，在冰葡萄汁低溫發(fā)酵的條件下，LT2菌株的L-乳酸含量顯著高于其他2株L.thermotolerans。

圖4 三株L.thermotolerans菌株的乳酸生成量Fig.4 Production of lactic acid of three L.thermomotolerans strains

2.5 酒樣理化指標(biāo)分析

由表2可知，供試菌株釀制的冰葡萄酒主要理化指標(biāo)均符合GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》[27]國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求。釀酒酵母SC釀制的冰酒乙醇體積分?jǐn)?shù)為14.0%，顯著高于其他6個(gè)非釀酒酵母處理組，其中3株L.thermotolerans處理組酒樣能夠達(dá)到的乙醇體積分為11.00%～11.43%，顯著低于3株T.delbrueckii酒樣(12.07%～12.83%)；從完成酒精發(fā)酵所需的時(shí)間來(lái)看，6株非釀酒酵母比釀酒酵母酒精發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)了10～25 d；3株L.thermotolerans酒樣中揮發(fā)酸含量顯著低于其他試驗(yàn)組，其中LT2酒樣揮發(fā)酸含量低于對(duì)照70.74%，減少了約1.38 g/L；3株T.delbrueckii菌株發(fā)酵的酒樣中，揮發(fā)酸含量比對(duì)照SC顯著降低了50%～55.31%，減少了約0.94～1.05 g/L。BELY等[14]研究也指出，與釀酒酵母相比，T.delbrueckii可使揮發(fā)酸減少0.5～0.8 g/L，減少的程度主要取決于不同的T.delbrueckii菌株。

表2 酒樣基本理化指標(biāo)Table 2 Basic physico-chemical indices of wine samples

綜上所述，通過(guò)對(duì)3株L.thermotolerans和3株T.delbrueckii的生長(zhǎng)曲線(xiàn)、耐受性及發(fā)酵性能分析，表明了L.thermotolerans和T.delbrueckii在高質(zhì)量濃度葡萄糖、高乙醇體積分?jǐn)?shù)、高SO2和低溫等條件下均具有較好的定殖能力，其中LT2和LT3、TD2和TD3等4株菌株耐受性良好。通過(guò)對(duì)供試的3株L.thermotolerans菌株的乳酸產(chǎn)生量及6株非釀酒酵母酒精發(fā)酵性能分析，最終以L(fǎng)T2和TD2菌株為優(yōu)選菌株，進(jìn)行單獨(dú)接種發(fā)酵以分析其在冰酒釀造中的應(yīng)用潛力。

2.6 LT2和TD2菌株單獨(dú)接種發(fā)酵的冰葡萄酒品質(zhì)分析

2.6.1 基本理化指標(biāo)分析

酒精發(fā)酵結(jié)束后，各試驗(yàn)酒樣中殘?zhí)?、乙醇、揮發(fā)酸、總酸的含量如表3所示，根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》中總糖 ≥ 125 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)為9.0%～14.0%及揮發(fā)酸 ≤ 2.1 g/L的要求，本次試驗(yàn)所得酒樣均達(dá)到國(guó)標(biāo)要求，其中處理組TD2和LT2酒樣中揮發(fā)酸含量比對(duì)照SC酒樣分別降低55.3%和73.4%，總酸含量分別高出SC酒樣的9.2%和23.0%；pH值比SC酒樣降低4.0%和7.4%。

表3 ‘貴人香’冰酒基本理化指標(biāo)Table 3 Physico-chemical indices of ‘Italian Riesling’ ice wines

2.6.2 主要揮發(fā)性香氣化合物的分析

采用SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)各酒樣中香氣物質(zhì)進(jìn)行分析，共檢測(cè)出50～63種香氣成分，包括16～19種高級(jí)醇類(lèi)、15～18種酯類(lèi)、8～9種脂肪酸類(lèi)、6～10種萜烯類(lèi)和5～7種其他類(lèi)化合物。由圖5可知，各酒樣中香氣物質(zhì)的種類(lèi)和含量差異較大。3個(gè)酒樣中高級(jí)醇含量最多，但2個(gè)處理酒樣與對(duì)照之間均無(wú)顯著差異(P< 0.05)；各酒樣中酯類(lèi)物質(zhì)含量差異較大(955.25～2 999.68 μg/L)，TD2和LT2的總酯含量比SC酒樣(2 999.68 μg/L)分別下降了40.99%和68.15%，說(shuō)明這2種非釀酒酵母在冰酒釀造中合成酯類(lèi)物質(zhì)的能力遠(yuǎn)低于釀酒酵母，但TD2和LT2酒樣中萜烯類(lèi)物質(zhì)含量顯著增加，高于SC酒樣的84.6%和89.70%；葡萄酒中大部分揮發(fā)性有機(jī)酸主要是發(fā)酵的副產(chǎn)物，低級(jí)飽和脂肪酸通常帶有不愉快的嗅感[28]，本試驗(yàn)中TD2和LT2菌株發(fā)酵的酒樣中有機(jī)酸含量顯著低于對(duì)照SC酒樣的83.69%和93.69%；其他類(lèi)化合物主要以醛酮類(lèi)為主，由于含量較低未進(jìn)行分析。

圖5 不同酒樣產(chǎn)香特性比較Fig.5 Comparison of aroma production characteristics of different wine samples 注：圖中柱形圖代表香氣物質(zhì)含量，折線(xiàn)圖代表香氣物質(zhì)數(shù)量

OAV是評(píng)價(jià)單一香氣化合物對(duì)葡萄酒整體香氣貢獻(xiàn)程度的指標(biāo)，為了直觀(guān)分析釀酒酵母SC與2種非釀酒酵母LT2和TD2純種發(fā)酵的冰葡萄酒樣的香氣特點(diǎn)，對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行了主成分分析(principal component analysis，PCA)，由圖6和圖7可知，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為70.33%和29.67%。其中，SC位于PC1和PC2的正向端，與正己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯、棕櫚酸乙酯、癸酸和9-癸烯酸相關(guān)性強(qiáng)，對(duì)SC酒樣的花香、果香和脂肪味等貢獻(xiàn)較大；TD2位于PC1的負(fù)向端和PC2的正向端，與苯乙醇和乙酸苯乙酯有較大的關(guān)聯(lián)，對(duì)TD2酒樣的花香味貢獻(xiàn)較大；LT2位于PC1和PC2的負(fù)向端，與正己醇、1-戊醇和芳樟醇等香氣物質(zhì)關(guān)聯(lián)緊密，對(duì)LT2酒樣的醇香、花香等貢獻(xiàn)較大。通過(guò)PCA發(fā)現(xiàn),3個(gè)不同供試酒樣之間有較大的香氣差異，SC主要體現(xiàn)了酯類(lèi)物質(zhì)的香氣，TD2主要體現(xiàn)了醇類(lèi)物質(zhì)的香氣，這與BELDA等[15]研究一致，LT2主要增加了萜烯類(lèi)香氣物質(zhì)帶來(lái)的花果香氣，BENITO等[6]研究也表明了這一點(diǎn)。

表4 供試酒樣中OAV>1的主要揮發(fā)性香氣成分及含量Table 5 Main volatile aroma components (OAV>1) in ice wine samples

圖6 香氣化合物(OAV>1)主成分分析的因子載荷圖Fig.6 Loadings plot from PCA of volatile aroma compounds (OAV>1)

圖7 香氣化合物主成分分析的供試酒樣的分布圖Fig.7 Score plot from PCA of the volatile aroma compounds

2.7 感官評(píng)價(jià)分析

試驗(yàn)得到的3種貴人香冰葡萄酒均為澄清的金黃色酒體，由圖8中可知，在色澤和澄清度方面各酒樣的分值無(wú)明顯差異；從香氣評(píng)分來(lái)看，處理組TD2酒樣的花香、果香以及香氣強(qiáng)度方面的得分較高于LT2和SC酒樣，這一特點(diǎn)與TD2酒樣中苯乙醇和乙酸苯乙酯檢出量最高的結(jié)果相符；各處理酒樣在異味方面的得分無(wú)明顯差異；就口感方面而言，LT2處理酒樣的酸味和甜酸平衡感明顯高于TD2和SC酒樣，說(shuō)明LT2酒樣中乳酸的產(chǎn)生對(duì)冰酒的酸甜協(xié)調(diào)性具有積極影響；從整體評(píng)分來(lái)看，2組處理酒樣的得分均明顯高于對(duì)照組?？偟膩?lái)看，TD2菌株純種發(fā)酵的貴人香冰葡萄酒在一定程度上增加了花果香氣，而LT2菌株發(fā)酵的酒樣增強(qiáng)了酸度，有助于平衡冰酒的甜膩感，使口感協(xié)調(diào)。

圖8 感官分析雷達(dá)圖Fig.8 Radar map of sensory analysis

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的3株L.thermotolerans和3株T.delbrueckii菌株的嗜殺性、生長(zhǎng)特性和發(fā)酵性能的分析，結(jié)果表明：3株L.thermotolerans和TD2菌株均具有較強(qiáng)的嗜殺性；6株供試的非釀酒酵母菌株在16 ℃的低溫條件下均經(jīng)歷4～6 h的延滯期后很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)量高，生長(zhǎng)良好；LT2、TD2菌株在葡萄糖質(zhì)量濃度為400～500 g/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%、SO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為400 mg/L、溫度為13～19 ℃等條件下耐受性良好。3株L.thermotolerans菌株中LT2菌株的乳酸產(chǎn)量最高(2.195 g/L)。LT2和TD2菌株純種發(fā)酵能夠使冰葡萄酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到11%～12%，并且與釀酒酵母純種發(fā)酵的酒樣相比，萜烯類(lèi)物質(zhì)總含量顯著增加，酯類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)總含量顯著降低；其中TD2菌株純種發(fā)酵能夠增加乙酸苯乙酯、丙酸苯乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯等乙醇酯以及萜烯類(lèi)物質(zhì)的含量；LT2菌株能夠增加芳樟醇含量，賦予葡萄酒花香。感官分析表明，TD2菌株純種發(fā)酵的冰葡萄酒有較明顯的花、果香氣；LT2菌株能夠增強(qiáng)冰葡萄酒的酸度，有助于平衡冰酒的甜膩感，使口感協(xié)調(diào)。綜上所述，L.thermotolerans和T.delbrueckii菌株純種發(fā)酵在一定程度對(duì)冰葡萄酒的感官品質(zhì)有一定的積極影響。在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步考察L.thermotolerans和T.delbrueckii分別與釀酒酵母混菌發(fā)酵的接種方式對(duì)冰葡萄酒品質(zhì)的影響，以期為利用非釀酒酵母提升冰葡萄酒的品質(zhì)提供理論參考。