李春鴻 林養(yǎng) 鄧麗花 梁汝忠

大腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤的一種，據(jù)報(bào)道全世界新診斷的大腸癌病例數(shù)接近每年100萬(wàn)，已躍居消化系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位，僅次于胃癌、食管癌[1]。大腸癌起病隱匿，早期多無(wú)癥狀，多數(shù)患者出現(xiàn)明顯癥狀就診時(shí)已屬中晚期，5年生存率約為12%[2]。早發(fā)現(xiàn)、早治療為改善大腸癌患者臨床預(yù)后的關(guān)鍵因素[3]。目前臨床采用的檢測(cè)技術(shù)如大便潛血試驗(yàn)、氣鋇灌腸、電子結(jié)腸鏡等，但存在精確性低、費(fèi)用高、侵襲性大等缺陷，甚至還可能引起如腸出血、穿孔等并發(fā)癥，極大降低了患者的依從性[4]。人體消化道定居著各種腸道菌群，其在物質(zhì)代謝、營(yíng)養(yǎng)合成、免疫功能等方面起著重要作用。腸道菌群也是引起消化系統(tǒng)炎癥的主要因素之一，腸道菌群的改變及其代謝產(chǎn)物對(duì)大腸癌的發(fā)生發(fā)展有一定影響[5-6]。本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）測(cè)定大腸癌患者體內(nèi)的大腸埃希菌、雙歧桿菌水平，并分析大腸埃希菌、雙歧桿菌與大腸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究篩選2018年12月-2019年12月本院就診的60例大腸癌患者作為大腸癌組，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合文獻(xiàn)[7]《現(xiàn)代腫瘤學(xué)》大腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，且通過腸鏡和術(shù)后病理檢查確診；大腸癌的臨床分期、分化程度、淋巴浸潤(rùn)符合文獻(xiàn)[8]2002年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡20～75歲的初診者；（3）生存期預(yù)期超過3個(gè)月；（4）無(wú)結(jié)直腸手術(shù)史；（5）入院前未經(jīng)抗腫瘤相關(guān)治療；（6）無(wú)特殊飲食習(xí)慣及近2周內(nèi)未曾服用影響腸道菌群藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在其他原發(fā)性腫瘤；（2）糞便樣本污染；（3）合并心、肝、腎、血液系統(tǒng)等疾??；（4）伴潰瘍性結(jié)腸炎、腸系膜炎癥及克羅恩病等消化性疾??；（5）長(zhǎng)期腹瀉。選取同期在本院體檢中心體檢且結(jié)果均為健康者50例作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡40～75歲；（2）無(wú)消化道疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病歷資料不完整；（2）近2周內(nèi)反復(fù)腹瀉。大腸癌組男37例，女23例；年齡40～71歲，平均（62.56±9.14）歲；TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期28例，Ⅲ期16例，Ⅳ期6例；腫瘤位置：結(jié)腸31例，直腸29例；分化程度：高分化21例，中低分化39例。對(duì)照組男35例，女15例；年齡43～70歲，平均（61.98±9.93）歲。兩組性別、年齡方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 大腸埃希菌、雙歧桿菌的檢測(cè)

收集兩組病例的新鮮大便，以天平稱取中段大便，每份5 g，存放于無(wú)菌離心管中，置于-80 ℃冰備用。設(shè)計(jì)大腸埃希菌、雙歧桿菌的引物，并以局部序列比對(duì)基本檢索工具在線核實(shí)其特異性，在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。取0.5 g糞便樣本加入緩沖液，充分混勻，置于離心管中，3 000 r/min離心5 min取上清液，收集沉淀，使用酚/氯仿抽提純化法提取DNA，以核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)DNA濃度，瓊脂糖凝膠行電泳，觀察DNA片段的大小和完整性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR Master Mix（2×）10 μl，上游引物（10 μmol/L）1.0 μl，下游引物（10 μmol/L）1.0 μl，cDNA 模 板（300 ng/μl）2.0 μl， 加 焦碳酸二乙酯補(bǔ)足為20 μl。反應(yīng)后糞便標(biāo)本所含細(xì)菌拷貝數(shù)由PCR儀分析其循環(huán)閾值（Ct值），并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，獲得樣本菌群定量結(jié)果。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物與溴酚藍(lán)混勻，上樣，行瓊脂糖凝膠電泳，攝像、純化，核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)目標(biāo)基因濃度，計(jì)算基因拷貝數(shù)，并將其稀釋為（10～109）copies/ml，作為標(biāo)準(zhǔn)品；取純化產(chǎn)物20 μl及糞腸球菌上、下游引物進(jìn)行測(cè)序，對(duì)純化產(chǎn)物行熒光定量PCR，根讀取熒光數(shù)據(jù)，由系統(tǒng)軟件自動(dòng)分析Ct值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，直線相關(guān)用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大腸埃希菌、雙歧桿菌水平比較

大腸癌組大腸埃希菌水平明顯高于對(duì)照組，雙歧桿菌明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），見表1。

表1 兩組大腸埃希菌、雙歧桿菌水平比較 [copies/g，（±s）]

表1 兩組大腸埃希菌、雙歧桿菌水平比較 [copies/g，（±s）]

組別 大腸埃希菌 雙歧桿菌對(duì)照組（n=5 0） 4.3 7±0.6 5 9.3 0±1.4 7大腸癌組（n=6 0） 6.6 8±0.9 3 4.4 7±0.6 2 t值 1 3.9 3 8 1 3.0 9 9 P值 0.0 0 0 0.0 0 1

2.2 大腸埃希菌、雙歧桿菌與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

大腸癌患者年齡、性別、腫瘤位置因素的大腸埃希菌、雙歧桿菌水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），分化程度、TNM分期因素的大腸埃希菌、雙歧桿菌水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

2.3 大腸癌患者大腸埃希菌、雙歧桿菌與臨床病理特征的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，大腸癌患者大腸埃希菌、雙歧桿菌與分化程度和TNM分期呈明顯相關(guān)（P＜0.01），但與年齡、性別、腫瘤位置無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），見表3。

表2 大腸埃希菌、雙歧桿菌與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系 [copies/g，（±s）]

表2 大腸埃希菌、雙歧桿菌與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系 [copies/g，（±s）]

水平 t值 P值 水平 t值 P值年齡 ＜60歲（n=38） 6.51±0.99 0.103 ＞0.05 4.33±0.81 0.931 ＞0.05≥60歲（n=22） 6.85±1.25 4.63±0.77性別 男（n=37） 6.55±1.11 0.081 ＞0.05 4.29±0.89 0.962 ＞0.05女（n=23） 6.81±1.37 4.67±0.93分化程度 高（n=21） 3.93±0.55 14.401 ＜0.01 5.61±0.73 9.005 ＜0.01中低（n=39） 9.43±1.47 3.33±0.51腫瘤位置 結(jié)腸（n=31） 6.90±1.28 0.049 ＞0.05 4.21±0.68 0.994 ＞0.05直腸（n=29） 6.46±1.21 4.75±0.80 TNM分期 Ⅰ、Ⅱ期（n=38） 3.46±0.51 12.133 ＜0.01 5.77±0.81 9.215 ＜0.01Ⅲ、Ⅳ期（n=22） 9.19±1.78 3.15±0.53因素 大腸埃希菌 雙歧桿菌

表3 大腸癌患者大腸埃希菌、雙歧桿菌與臨床病理特征的相關(guān)性分析

3 討論

腸道菌群與大腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性已獲得醫(yī)學(xué)界的共識(shí)。生理狀態(tài)下腸道菌群保持著一種動(dòng)態(tài)平衡，有助于正常腸道屏障功能的維持，對(duì)病原體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[9]。腸道菌群的平衡一旦被打破，出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)，與許多疾病如肥胖、炎癥性腸病及大腸癌等相關(guān)[10]。特殊的腸道菌群可產(chǎn)生引起大腸癌風(fēng)險(xiǎn)的毒素，其能夠激活炎癥信號(hào)通路，導(dǎo)致DNA損害，最終引起腫瘤發(fā)生，如腸道菌群通過其代謝產(chǎn)物次級(jí)膽汁酸，在大腸癌的發(fā)生中起到重要作用[11]。

大腸埃希氏菌又被稱為大腸桿菌，主要為條件致病菌，可誘導(dǎo)腸道慢性炎癥、內(nèi)毒素產(chǎn)生，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[12]。目前已知致病性大腸桿菌能合成毒素cyclomodulins、細(xì)胞毒性壞死因子、循環(huán)抑制因子及大腸桿菌毒素[13]。cyclomodulins具有遺傳毒性和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和、凋亡[13]。大腸桿菌毒素具有由大腸桿菌多聚乙酰合成酶島所編碼多聚乙酰合成酶，此酶通過誘導(dǎo)人DNA雙鏈斷裂及染色體不穩(wěn)定，協(xié)同促進(jìn)大腸癌發(fā)生[13]。研究也表明具有多聚乙酰合成酶島的大腸桿菌在大腸癌患者中更常見，支持了致病性大腸桿菌在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的促進(jìn)作用[14]。本研究結(jié)果顯示，大腸癌組大腸埃希菌水平明顯高于對(duì)照組；大腸埃希菌與大腸癌患者的年齡、性別、腫瘤位置無(wú)關(guān)，而與分化程度、TNM分期有關(guān)；經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，大腸埃希菌與大腸癌分化程度和TNM分期呈正相關(guān)，但與年齡、性別、腫瘤位置無(wú)相關(guān)性。文獻(xiàn)[15]報(bào)道大腸癌組患者大腸桿菌水平均明顯高于健康人群，大腸桿菌與大腸癌的TNM分期呈顯著性正相關(guān)。說明大腸埃希菌狀況與大腸癌的發(fā)生發(fā)展存在一定的相關(guān)性。

雙歧桿菌為人體腸道的益生菌，可合成多種維生素，有助于腸道的蠕動(dòng)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[16]。臨床治療研究顯示雙歧桿菌可緩解晚期大腸癌患者使用伊立替康化療所引起的腹瀉發(fā)生，改善患者生活質(zhì)量[17]。本研究結(jié)果顯示，大腸癌組雙歧桿菌明顯低于對(duì)照組，雙歧桿菌與大腸癌患者的年齡、性別、腫瘤位置無(wú)關(guān)，而與分化程度、TNM分期有關(guān)；經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，雙歧桿菌與大腸癌的分化程度和TNM分期呈正呈明顯相關(guān)，但與年齡、性別、腫瘤位置無(wú)相關(guān)性。大量研究均證實(shí)了大腸癌組患者大腸桿菌水平均明顯高于健康人群，大腸桿菌與大腸癌的TNM分期呈顯著性正相關(guān)[15，18]。表明雙歧桿菌狀況與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，大腸癌患者體內(nèi)的大腸埃希菌明顯升高及雙歧桿菌顯著降低，且與大腸癌分化程度和臨床分期呈明顯相關(guān)性。但本研究所納入的樣本量較小，且未對(duì)腸道菌群失調(diào)對(duì)大腸癌發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制進(jìn)行探討，值得進(jìn)一步研究。