楊 穎，王愛(ài)娜

(渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714026)

通過(guò)導(dǎo)入Bt基因獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植株，已在棉花、番茄、油菜、玉米等作物上獲得成功,并且有的通過(guò)商業(yè)化釋放，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。目前，從微生物、植物和動(dòng)物來(lái)源的抗性基因已被成功用于轉(zhuǎn)基因研究的候選基因，在轉(zhuǎn)基因作物抗蟲(chóng)研究應(yīng)用方面，不同類(lèi)型的蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素編碼基因Cry已被廣泛用于不同作物對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目或者膜翅目的昆蟲(chóng)的抗性[1]。然而，昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)毒素迅速進(jìn)化產(chǎn)生的抗性，使毒素對(duì)害蟲(chóng)的無(wú)效性，對(duì)非靶向生物和微環(huán)境的影響是現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)方法的主要缺陷[2]。考慮到目前作物保護(hù)現(xiàn)狀，有必要探索出一種更加經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好型的害蟲(chóng)防治方法，因此利用植物介導(dǎo)的RNAi方法來(lái)抵抗褐飛虱有著潛在的價(jià)值[3]。

為利用RNAi技術(shù)培育抗褐飛虱水稻，我們先前采用重組PCR將已克隆獲得的褐飛虱V-ATPase D亞基基因片段和V-ATPase H亞基基因片段進(jìn)行融合，融合基因V-ATPase D-H (VAD-H)以反向重復(fù)的方式連入改造后的pUCm-T，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄dsRNA飼喂褐飛虱若蟲(chóng)致其死亡率增加[4]，為進(jìn)一步驗(yàn)證體外穩(wěn)定表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植株在抗飛虱方面的作用，本研究通過(guò)將hp(VAD-H)定向插入到攜帶有篩選標(biāo)記抗草丁膦bar基因的雙元表達(dá)載體pCAMBIA-1300上，從而產(chǎn)生發(fā)夾樣pcambia1300-Ubi-hp(VAD-H)-RNAi植物表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植物，飛虱取食轉(zhuǎn)基因植株后對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 試驗(yàn)所用褐飛虱由本校植物抗逆研究中心提供，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)(溫度25±2℃，相對(duì)濕度60%～70%，15 h光照/9 h黑暗)利用水稻幼苗進(jìn)行飼養(yǎng)繁育。

1.1.2 主要試劑 本試驗(yàn)所用大腸桿菌(E.coli)菌株，已構(gòu)建載體pUCm-hp(VAD-H)來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。引物由擎科生物合成，植物RNA提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)，PrimeSTAR HS DNA Polymerase、內(nèi)切酶和T4 ligase購(gòu)自Takara公司，cDNA合成和qPCR試劑盒均購(gòu)自全式金公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物雙元載體pCAMBIA1300-hp(VAD-H)的構(gòu)建及水稻轉(zhuǎn)化 已獲取的含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的重組載體pUCm-hp(VAD-H)，利用pUCm-T載體上帶有的酶切位點(diǎn)HindⅢ和Sac I雙酶切pUCm-hp(VAD-H)，將發(fā)夾結(jié)構(gòu)插入經(jīng)改造攜帶有篩選標(biāo)記抗草丁膦bar基因的雙元表達(dá)載體pCAMBIA-1300，從而產(chǎn)生發(fā)夾樣pcambia1300-Ubi-hp(VAD-H)-RNAi植物表達(dá)載體，該載體中目的干擾基因由Ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，選擇標(biāo)記bar基因由組成型35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化TN1水稻植株。轉(zhuǎn)化植株采用草丁膦進(jìn)行篩選，篩選植株在溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因水稻飼喂褐飛虱 通過(guò)噴施除草劑篩選抗性植株到T3代水稻幼苗進(jìn)行生測(cè)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的4葉期陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株及非轉(zhuǎn)化植株(對(duì)照)轉(zhuǎn)移到生測(cè)裝置內(nèi)，每個(gè)水培杯內(nèi)種一株，植株根上部用塑料圓盤(pán)固定，并罩有一端扎有密孔尼龍網(wǎng)的透明塑料圓柱體，每個(gè)植株上放置10只12h內(nèi)孵化的初孵1齡若蟲(chóng)，每天記錄飛虱的數(shù)量和齡期，持續(xù)12 d，該試驗(yàn)重復(fù)10次，試驗(yàn)結(jié)束后收集飛虱，放置-80℃再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。生測(cè)實(shí)驗(yàn)在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行，溫度25±2℃，相對(duì)濕度60%～70%，15 h光照/9 h黑暗。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè) 用康為世紀(jì)的植物RNA提取試劑盒(DNase I)提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。cDNA稀釋后作為模板，進(jìn)行qRT-PCR，所用引物如表1所示。反應(yīng)體系為20μL：2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，cDNA模板(20 ng·μL-1)1μL，ddH2O 8.2 μL。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 30 s；94℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。ABI Prism 7300為實(shí)時(shí)定量?jī)x器，飛虱β-actin基因(GenBank：EUl79846)作為內(nèi)參，基因相對(duì)表迖量計(jì)算采用Livak和Schmittgen[5]的方法。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 dsRNA轉(zhuǎn)基因水稻獲取及鑒定

將構(gòu)建的含有篩選標(biāo)記抗草丁膦bar基因的dsRNA干擾表達(dá)載體1300-Ubi-hp(VAD-H)-RNAi，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化TN1水稻愈傷組織，采用草丁膦進(jìn)行篩選，進(jìn)而獲取轉(zhuǎn)基因水稻植株。在溫室內(nèi)培養(yǎng)，T0代轉(zhuǎn)化植株收獲的種子(T1)播種待幼苗長(zhǎng)至三葉期時(shí)噴施草丁膦，選取除草劑抗性植株(T1)收獲種子(T2)，繼續(xù)種植篩選抗性植株到T3代，單株種植選取抗性不分離株系即為純合體，從抗草丁膦的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株和對(duì)照TN1植株中分別提取基因組DNA，用特異引物GTF1和GTR1擴(kuò)增除草劑基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖2a中可見(jiàn)所選取植株均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，隨后對(duì)植株進(jìn)行除草劑基因的表達(dá)量檢測(cè)，如圖2b我們選取A3和A6兩個(gè)植株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 體外喂食轉(zhuǎn)基因水稻后對(duì)飛虱影響

2.2.1 取食轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)飛虱生長(zhǎng)發(fā)育影響 為探究體外穩(wěn)定表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)飛虱發(fā)育水平的影響，我們選取T3代植株A3和A6，待其長(zhǎng)到四葉期幼苗用以喂食褐飛虱。體外飼喂試驗(yàn)所用褐飛虱為T(mén)N1水稻上的初孵幼蟲(chóng)，隨后將飛虱接種到轉(zhuǎn)基因水稻A3和A6 植株上，褐飛虱取食VAD-H轉(zhuǎn)基因水稻后，如圖3所示該轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)褐飛虱1齡若蟲(chóng)的發(fā)育歷期影響明顯，差異顯著外，對(duì)其他齡期若蟲(chóng)發(fā)育歷期影響無(wú)明顯變化(圖3)。同時(shí)褐飛虱若蟲(chóng)總發(fā)育歷期，相比對(duì)照明顯延長(zhǎng)。

我們對(duì)飛虱成蟲(chóng)存活壽命，世代周期同時(shí)進(jìn)行了測(cè)定。取食轉(zhuǎn)基因水稻后，短翅型雌蟲(chóng)壽命受到影響，與對(duì)照組相比較差異顯著，而對(duì)于短翅和長(zhǎng)翅型雄性成蟲(chóng)的壽命無(wú)顯著影響，此外，飛虱的世代周期相較于對(duì)照也明顯延長(zhǎng)(圖4)。

圖2 轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)

(a)T3代轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR檢測(cè)。M，DL2000 marker；1，ck；2-7，不同轉(zhuǎn)化植株；

(b)T3代轉(zhuǎn)化植株的qRT-PCR。A1-A6，不同轉(zhuǎn)化植株。

2.2.2 取食轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)飛虱靶基因影響 為檢測(cè)飛虱取食轉(zhuǎn)基因植株后對(duì)其體內(nèi)靶標(biāo)mRNA的影響，利用熒光定量PCR對(duì)靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)所用的3齡褐飛虱起初在TN1水稻上進(jìn)行飼喂，隨后轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)基因水稻A3及A6上持續(xù)飼喂4～8 d。對(duì)飼喂非轉(zhuǎn)基因TN1和轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的褐飛虱分別抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄后檢測(cè)褐飛虱體內(nèi)靶基因的相對(duì)表達(dá)量。

褐飛虱取食VAD-H轉(zhuǎn)基因水稻，靶基因VATPase H的轉(zhuǎn)錄水平開(kāi)始降低，A3和A6植株飼喂的飛虱其靶基因轉(zhuǎn)錄水平在第八天分別降低20.4%和28.6%(圖5A)。

同時(shí)靶基因V-ATPase D的轉(zhuǎn)錄水平也顯著降低，A3和A6植株上飛虱該基因轉(zhuǎn)錄水平在第八天分別降低了40.3%和43.5%(圖5B)。

3 討論

獲得在植物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)昆蟲(chóng)基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物，成功介導(dǎo)昆蟲(chóng)體內(nèi)RNAi效應(yīng)，使其靶基因被沉默甚至正常生理活動(dòng)受到一定影響，對(duì)于減輕農(nóng)作物蟲(chóng)害具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Baum等利用表達(dá)玉米根葉甲VATPase基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米，飼喂玉米根葉甲幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)出現(xiàn)發(fā)育受阻或死亡現(xiàn)象[6]。作為影響水稻生產(chǎn)的主要害蟲(chóng)褐飛虱，其通過(guò)刺吸式口器，吸食植株維管束韌皮部汁液內(nèi)的自由氨基酸和氨基類(lèi)化合物，對(duì)水稻造成嚴(yán)重的生理?yè)p害。Zha等[7]選取了在褐飛虱中腸內(nèi)高表達(dá)并且參與糖轉(zhuǎn)運(yùn)的三個(gè)基因即NlHT1、Nlcar和Nltry，構(gòu)建并轉(zhuǎn)化獲得表達(dá)上述基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因植株，褐飛虱取食轉(zhuǎn)基因水稻后其體內(nèi)對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量下降了40%～70%。

我們先前克隆了飛虱V-ATPase D和V-ATPase H亞基基因片段，利用重組PCR獲得融合基因VAD-H，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄dsRNA飼喂褐飛虱并引起飛虱死亡率增加，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了針對(duì)該融合基因的RNAi植物表達(dá)載體，獲取體外穩(wěn)定表達(dá)dsRNA的純合株系，進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)飛虱生理水平的影響。當(dāng)褐飛虱的初孵幼蟲(chóng)接種到轉(zhuǎn)基因植株上，取食VAD-H轉(zhuǎn)基因水稻后，其1齡若蟲(chóng)的發(fā)育歷期有所延長(zhǎng)，而且飛虱若蟲(chóng)總發(fā)育歷期，相比對(duì)照也明顯延長(zhǎng)(圖3)。此外我們對(duì)取食dsRNA的褐飛虱靶基因轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果表明飛虱體內(nèi)靶基因表達(dá)水平均發(fā)生不同程度降低，并且降低水平隨飼喂時(shí)間延長(zhǎng)顯著性下降(圖5)。表明攝入表達(dá)融合基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物，能夠引發(fā)褐飛虱體內(nèi)RNAi效應(yīng)。

Li等研究在轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)產(chǎn)生高濃度dsRNA時(shí)才能引發(fā)高效率的環(huán)境性RNAi，并且可以阻礙褐飛虱的生長(zhǎng)發(fā)育甚至能夠?qū)е潞诛w虱死亡[8]，因此當(dāng)外界不能持續(xù)提供dsRNA時(shí)，干擾效果會(huì)受到限制。筆者研究中飛虱取食轉(zhuǎn)基因水稻后盡管生長(zhǎng)發(fā)育相比對(duì)照受到一定的影響，但沒(méi)有出現(xiàn)明顯的致死表型，出現(xiàn)上述問(wèn)題可能由于飛虱攝取dsRNA的量不足，或?qū)嶒?yàn)體系不能引發(fā)RNAi強(qiáng)穿透能力，使得飛虱未出現(xiàn)死亡。因此在利用RNAi技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物時(shí)，需注意包括基因類(lèi)型，基因片段大小，表達(dá)載體選擇等影響干擾效率的因素，從而充分發(fā)揮其干擾效應(yīng)在害蟲(chóng)防治方面的作用[7]。