趙雪峰，譚明，趙一杰，檀碧波

在我國，胃癌發(fā)病率及病死率均居惡性腫瘤的前列［1］，對健康危害極大，其主要原因在于約80%的患者就診時已經(jīng)存在腫瘤的進展轉(zhuǎn)移［2］，因此很難達到根治，這是胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后差的主要原因之一。胃癌進展迅速的主要原因在于胃癌細胞具有較強的侵襲遷移能力，這種能力使胃癌細胞易于突破基底膜向機體的其他部位進行遷移，這是導(dǎo)致胃癌轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)［3］。胃癌轉(zhuǎn)移是一個多基因、多步驟的過程，由于其過程復(fù)雜。目前，其具體機制尚不明確。HILPDA 基因也被稱為C7orf68、HIG-2、HIG2 基因，在胰腺癌、肝細胞肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達明顯增高［4-6］，促進了腫瘤的進展侵襲，但HILPDA 基因在胃癌中表達情況及意義尚無報道。為了解HILPDA 基因在胃癌進展中的作用機制，本研究應(yīng)用生物信息學技術(shù)檢測了HILPDA 基因在胃癌及癌旁組織中的表達情況，進行了預(yù)后分析，探討了HILPDA基因檢測的臨床價值。進一步驗證HILPDA 基因在胃癌細胞中的作用，為確定新的胃癌預(yù)后因子及治療新靶點提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 HILPDA 基因在胃癌及癌旁組織中表達的生物信息學分析 從TCGA〔GDC（cancer.gov）〕數(shù)據(jù)庫中下載胃癌項目的高通量RNA 測序（RNA-seq）患者和臨床數(shù)據(jù)。TCGA 收錄胃癌樣本407 例，其中包含腫瘤樣本375 例和癌旁樣本32 例。根據(jù)要求篩選符合條件的樣本：（1）基因表達量不為0；（2）臨床信息完整。篩選后符合要求的樣本數(shù)為402 例。使用perl 語言對下載篩選后的TCGA 數(shù)據(jù)進行初步整理，整理為R 語言可讀取的矩陣文件，利用R 軟件的“l(fā)imma”包對提取的HILPDA 基因表達量在癌旁組織和腫瘤樣本的表達進行差異表達分析。使用箱線圖顯示HILPDA 基因在癌旁組織和腫瘤樣本中的不同表達水平。

1.2 HILPDA 基因與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載胃癌臨床數(shù)據(jù)集。使用R 包“survival”和“survminer”進行生存分析。根據(jù)HILPDA 基因的表達水平中位數(shù)值將胃癌樣本分為兩個子集，并采用Kaplan-Meier 生存曲線比較相應(yīng)兩子集之間的生存差異。

1.3 HILPDA 在胃癌中GSEA 富集分析結(jié)果 選擇c2.cp.HALLMARK.V7.4.symbols.gmt 作為參考基因集進行GSEA 分析。通過分析，發(fā)現(xiàn)了HILPDA 高表達組和低表達組之間存在生存差異。將每次分析的隨機排列次數(shù)設(shè)定為1 000 次。以HILPDA 表達量作為表型標記。通過P值和歸一化富集評分對每個表型中富集的相關(guān)信號通路進行排序。在本研究中，基因集合使用了通路富集分析，篩選標準設(shè)置為FDR＜0.25 且P＜0.05，分析結(jié)果使用R 軟件進行可視化。

1.4 一般資料 選取2019—2020 年于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院行外科手術(shù)的胃癌患者的腫瘤組織及癌旁組織。腫瘤組織取材時去除標本表面壞死潰瘍部分，癌旁組織取材時遠離腫瘤上下緣＞3 cm。于標本離體后在30 min 內(nèi)盡快取材，標本均一式兩份，一份用于實時定量PCR（qRT-PCR）檢測，一份用于蛋白印跡（Western blotting）檢測。取材后先置于液氮中，然后轉(zhuǎn)存于-80 ℃超低溫冰箱中。35 例患者中男25 例，女10 例。患者年齡35～71 歲，平均（54.4±8.9）歲。按國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第8 版胃癌分期［7］，Ⅰ～Ⅱ期者17 例，Ⅲ期者18 例（由于Ⅳ期患者無并發(fā)癥時不建議手術(shù)，本研究未納入IV 期胃癌患者）。

1.5 主要試劑 HILPDA、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、增殖細胞核抗原（PCNA）、周期素依賴性激酶2（CDK2）、高遷移率族盒蛋白2（HMGB2）及內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的引物序列由上海吉凱生物公司合成。聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）試劑及逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）試劑盒購自美國Invirtogen 公司。TaqMan Real-Time PCR 試劑盒為美國Applied Biosystems 公司產(chǎn)品。實時定量PCR 儀（AB-7900 型）購自美國Thermo Fisher 公司。

1.6 qRT-PCR 技術(shù)檢測HILPDA、VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 基因的表達 按說明用TRIzol 從組織中提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green I qPCR試劑盒按操作手冊說明進行定量PCR 反應(yīng)。GAPDH 作為內(nèi)參基因，各基因的表達強度與GAPDH 進行對比。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，63 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共進行45 個循環(huán)。實驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 HILPDA 在胃癌及癌旁組織中表達差異 對TCGA最新胃癌數(shù)據(jù)進行差異表達分析，發(fā)現(xiàn)HILPDA 在胃癌組織中呈現(xiàn)出明顯高表達（2.535±0.903），高于癌旁組織表達（2.225±1.451），差異有統(tǒng)計學意義（Z=11.563，P＜0.001），見圖1。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫的胃癌組織及癌旁組織HILPDA 的表達情況

2.2 HILPDA 表達與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 HILPDA 低表達組預(yù)后好于高表達組（χ2=33.268，P＜0.001），見圖2。從TCGA 官網(wǎng)獲得胃癌數(shù)據(jù)集對HILPDA 進行生存分析，并構(gòu)建了COX 比例風險模型。單因素COX分析顯示，年齡、腫瘤分級、遠外轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、stage 分期和HILPDA 高表達是胃癌的潛在危險因素。此外，多變量COX 分析證實，腫瘤分級、stage 分期和HILPDA 在總生存期中可以獨立于其他因素預(yù)測腫瘤預(yù)后（P=0.031）。見圖3。

圖2 HILPDA 表達與胃癌患者預(yù)后關(guān)系的Kaplan-Meier 結(jié)果

圖3 HILPDA 與胃癌患者預(yù)后關(guān)系的COX 生存分析結(jié)果

2.3 HILPDA 在胃癌中GSEA 富集分析結(jié)果 GSEA 結(jié)果顯示，HILPDA 高表達組中存在乏氧、DNA 修復(fù)、凋亡、P53 等通路的基因富集。其中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 等基因與HILPDA 存在共表達，可能在HILPDA 的調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用。見圖4。

圖4 HILPDA 高表達組GSEA 富集分析結(jié)果

2.4 臨床組織中HILPDA mRNA 的表達水平 胃癌組織中HILPDA 表達水平為（0.331 4±0.066 0），在癌旁組織中表達水平為（0.243 0±0.098 2），胃癌組織中HILPDA 表達比癌旁組織增高（t=-4.420，P＜0.001）。胃癌組織中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 的mRNA表達水平為（0.423 6±0.170 2）（1.013 9±0.305 8）（0.901 9±0.330 5）（1.325 6±0.319 4），在癌旁組織中表達水平為（0.196 0±0.101 5）（0.342 0±0.138 7）（0.576 8±0.181 9）（0.473 2±0.179 1），胃癌組織中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 的mRNA 表達均比癌旁組織增強（t=6.795，P＜0.001；t=11.838，P＜0.001；t=5.098，P＜0.001；t=13.771，P＜0.001）。

2.5 胃癌組織中HILPDA 表達與臨床病理特征之間的關(guān)系 HILPDA 表達水平與胃癌組織的患者臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（均P＜0.05）。在臨床分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中HILPDA 表達更高。結(jié)果還顯示，HILPDA 表達與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、分化程度等無關(guān)（均P＞0.05）。見表1。

表1 胃癌組織中HILPDA 表達水平與臨床病理特征的關(guān)系（）

2.6 胃癌組織中HILPDA 與VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 的mRNA 表達的相關(guān)性 Spearman 相關(guān)分析顯示，HILPDA 與VEGFA、PCNA、CDK2 均存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.396，P=0.019；r=0.462，P=0.005；r=0.548，P＜0.001），HILPDA 與HMGB2 未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性（r=0.220，P=0.205）。

3 討論

胃癌易于進展轉(zhuǎn)移，臨床大部分胃癌患者就診時處于進展期，這是胃癌患者治療效果差、預(yù)后差的重要原因［8］。隨著近年來靶向治療的進展，胃癌也有了針對人表皮生長因子受體2（HER-2）陽性腫瘤的靶向藥物曲妥珠單抗，并取得了較好的治療效果［9］。但HER-2在胃癌中的陽性率僅有10%～15%［10］，因此大部分胃癌患者還不能從靶向治療中獲益。因此，需找新的與胃癌進展相關(guān)的基因具有重要價值。隨著近年來生物信息學技術(shù)在醫(yī)學研究中的廣泛應(yīng)用，研究者可以通過軟件對數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行分析，從而探討目的基因的臨床意義和相關(guān)機制［11］。HILPDA 是一種與乏氧狀態(tài)下脂代謝調(diào)控有關(guān)的基因，其作用機制尚不完全明確，但該基因在胰腺癌、肝細胞肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中表達增強［4-6］，具有原癌基因特征。HILPDA 基因在胃癌中表達及意義報道還很少見。本研究首先對TCGA數(shù)據(jù)庫的胃癌相關(guān)數(shù)據(jù)及差異基因表達情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)HILPDA 在胃癌腫瘤中表達明顯比癌旁組織增強，且HILPDA 高表達是胃癌患者預(yù)后差的標志。其后筆者又收集了于本研究中心手術(shù)的35 例胃癌及癌旁組織，檢測了組織中HILPDA 的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中HILPDA 表達水平比癌旁組織增高，與生物信息學結(jié)果符合。由于組織收集時間較短，無法確定HILPDA 的預(yù)后價值，故分析了HILPDA 表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HILPDA 在臨床分期晚、有淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)移的組織中表達水平更高，這也提示HILPDA在胃癌進展中發(fā)揮了重要作用。

為初步了解HILPDA 基因在胃癌細胞中的作用機制，本研究應(yīng)用GSEA 基因富集分析探討了HILPDA 高表達組相關(guān)的通路和基因。GSEA 是一種針對全基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)的分析方法，將目的基因與預(yù)定義的基因集進行比較［12］，從而發(fā)現(xiàn)可能與目的基因有關(guān)的通路和基因。本研究應(yīng)用R 軟件對胃癌HILPDA 基因的調(diào)控進行了GSEA 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HILPDA 高表達組中存在乏氧、DNA 修復(fù)、凋亡、P53 等通路的基因富集，通路中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 等基因與HILPDA 存在共表達。VEGFA 是調(diào)控血管生成的重要基因，在惡性腫瘤的血管生成中發(fā)揮了重要作用［13］。PCNA 主要反映腫瘤的增殖狀態(tài)，在腫瘤中高表達［14］。CDK2 基因是細胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的催化亞基，可以促進細胞由靜止期向分裂期的轉(zhuǎn)變［15］。HMGB2 基因是高遷移族蛋白家族成員之一，具有促進細胞遷移的能力［16］。這4 種基因均為原癌基因，出現(xiàn)在HILPDA 高表達組提示HILPDA 基因在促進胃癌細胞的增殖和侵襲方面可能發(fā)揮了作用。筆者收集的胃癌標本中HILPDA 與VEGFA、PCNA、CDK2 存在正相關(guān)，驗證了生物信息學的研究結(jié)果。但本研究發(fā)現(xiàn)HILPDA與HMGB2 基因無明顯相關(guān)性，這可能與數(shù)據(jù)來源、數(shù)據(jù)樣本量不同有關(guān)，具體情況還需要進一步深入分析。