陳思羽

（中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙 410000）

酶是一類(lèi)具有生物催化活性的生物大分子物質(zhì)，可以分為蛋白質(zhì)酶和RNA 酶兩大類(lèi)。酶可以在特定條件下催化生化反應(yīng)，與無(wú)酶催化的化學(xué)反應(yīng)相比，具有反應(yīng)效率高、條件溫和等特點(diǎn)，而且酶通常具有很強(qiáng)的專(zhuān)一性，可以催化所需的特定反應(yīng)，避免副反應(yīng)發(fā)生，大大提高了原料的利用率。因此，酶在許多領(lǐng)域如化工、輕工、紡織、醫(yī)藥、食品等都有廣泛的應(yīng)用。酶工程就是酶的生產(chǎn)、改性和應(yīng)用的技術(shù)過(guò)程。

工業(yè)中應(yīng)用的酶主要來(lái)源于微生物發(fā)酵生產(chǎn)。與動(dòng)植物源相比，微生物源酶具有來(lái)源廣泛、易分離、易大規(guī)模生產(chǎn)、不受季節(jié)、環(huán)境、倫理問(wèn)題影響等諸多優(yōu)勢(shì)，微生物發(fā)酵產(chǎn)酶是酶工程的基礎(chǔ)[1]。在應(yīng)用酶的工業(yè)領(lǐng)域中，蛋白酶的應(yīng)用最為廣泛，蛋白酶商業(yè)銷(xiāo)售額約占全球酶銷(xiāo)售總額的60%。因此，以蛋白酶為例，從菌種選育、酶學(xué)性質(zhì)、產(chǎn)酶條件3 個(gè)方面初步分析提高酶產(chǎn)量和質(zhì)量的方法，為生物酶制劑更廣泛的工業(yè)化提供思路[2-3]。

1 菌種選育

微生物類(lèi)群所具有的生物多樣性是開(kāi)發(fā)新蛋白酶和新產(chǎn)酶菌株的基礎(chǔ)。產(chǎn)酶菌種本身所具有的生理生化性質(zhì)是影響酶產(chǎn)量和質(zhì)量的最重要的因素之一?，F(xiàn)有常用產(chǎn)蛋白酶菌株包括細(xì)菌中的芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、變形桿菌屬，霉菌中的曲霉、毛霉，放線菌中的諾卡氏菌和高溫放線菌等[4]。其中最主要的是芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等[5]。

自然界中的野生型產(chǎn)酶菌株往往不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)及商品化的要求，為了提高工業(yè)產(chǎn)酶的產(chǎn)量和質(zhì)量，通常會(huì)利用誘變育種、基因重組、原生質(zhì)體融合等遺傳學(xué)技術(shù)原理對(duì)野生型菌株進(jìn)行適應(yīng)性改造。

1.1 誘變育種

按誘變手段可將誘變育種分為物理誘變、化學(xué)誘變和生物誘變?nèi)箢?lèi)。常用的物理誘變因素包括紫外線、快中子、X 射線、γ 射線等，化學(xué)誘變因素包括堿基類(lèi)似物如5-BU 和烷化劑等。王金才等[6]通過(guò)紫外誘變育得比出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌HL-3酶活提高34.26%的菌株A2；王茜[7]以枯草芽孢桿菌AS1.398 為出發(fā)菌株，以等離子體和鈷60 伽馬射線處理誘變得到一株高產(chǎn)lCo16 號(hào)誘變菌株；馬宏宇等[8]以枯草芽孢桿菌Z5 為出發(fā)菌株，通過(guò)硫酸二乙酯誘變得到一株產(chǎn)新型蛋白酶的突變株Z5-14。

為了得到較好的誘變效果、提高誘變效率，育種工作中也常常采用復(fù)合誘變的方法。陳蘢[9]以野生型解淀粉芽孢桿菌CL-10 為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外和硫酸二乙酯復(fù)合誘變育得一株較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高14.03%的突變株CL-10-1；黃子凌等[10]以枯草芽孢桿菌WT 為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外和氯化鋰復(fù)合誘變得到一株產(chǎn)量提升44.2%的突變菌株UL-191；胡悅等[11]以地衣芽孢桿菌E-417 為出發(fā)菌株經(jīng)氯化鋰和等離子體復(fù)合誘變育得一株高產(chǎn)突變菌株F-3，產(chǎn)量提高75%。

1.2 基因重組育種

基因重組育種是指利用基因重組相關(guān)的原理和技術(shù)對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行改造。廣義上的基因重組分為3 個(gè)層面：個(gè)體水平，如生物個(gè)體間的雜交；細(xì)胞水平，如細(xì)胞融合和原生質(zhì)體融合；分子水平，如DNA雜交。對(duì)于微生物的雜交育種，由于其條件苛刻，要求進(jìn)行雜交的兩親本菌必須具有有性生殖循環(huán)或準(zhǔn)性生殖循環(huán)，且重組頻率極低，僅能達(dá)到10-7左右，因此應(yīng)用較為困難，相關(guān)報(bào)道較少。

1976 年，F(xiàn)odor 等人[12]和Schaeffer 等人[13]最先發(fā)表了關(guān)于微生物原生質(zhì)體融合育種的報(bào)道，成功進(jìn)行了巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的種內(nèi)原生質(zhì)體融合。該技術(shù)打破了遺傳物質(zhì)交流的最大障礙——細(xì)胞壁，有望實(shí)現(xiàn)跨種、屬等的遠(yuǎn)緣雜交，因而倍受關(guān)注，并于20世紀(jì)70年代以來(lái)發(fā)展迅速。韓志雙等[14]以產(chǎn)酸性蛋白酶的米曲霉菌株Y-9 和F-5 為出發(fā)菌株，通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行基因改組，育得產(chǎn)量較雙親本株分別提高253.37%和276.25%的重組米曲霉G11；朱振華[15]以黑曲霉UV-11 和枯草芽孢桿菌MC7 為雙親本經(jīng)原生質(zhì)體融合育得一株能產(chǎn)糖化酶和蛋白酶的融合子4-5#，蛋白酶產(chǎn)量較親本MC7提高7.8%。

分子層面的基因工程育種理論上是最易控制、成功率最高、真正能突破物種間障礙的實(shí)現(xiàn)幾乎所有生物間遠(yuǎn)緣雜交的方法?；蚬こ痰闹饕襟E是：獲得目的基因；制備基因載體；連接目的基因與載體；將連接后的載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)，完成重組。感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是最常見(jiàn)的將載體轉(zhuǎn)入的方法，周桂旭等[16]用Spizizen 低鹽環(huán)境感受態(tài)轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pBE2R-AP轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600 中育得可穩(wěn)定表達(dá)堿性蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌工程菌；彭文堅(jiān)等[17]將轉(zhuǎn)錄因子Aft1 轉(zhuǎn)入畢赤酵母Pichiapastoris GS115 中，得到SGT 胰蛋白酶較對(duì)照菌酶活提升19.71%的重組菌株P(guān)P-SGTm/Aft1；李怡欣等[18]將地衣芽孢桿菌subCopt基因與信號(hào)肽AmyE 連接，轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌MA08 中，育得可分泌大量胞外酶且酶活提高73.4%的重組工程菌。

2 酶學(xué)性質(zhì)

在實(shí)際應(yīng)用中，天然酶的特性往往也是限制其規(guī)?；褂玫囊蛩?，大多數(shù)天然酶的抗氧化能力較差，熱穩(wěn)定性、耐酸堿能力也往往不能達(dá)到工業(yè)要求。因此，為了適應(yīng)工業(yè)化的大規(guī)模使用，天然結(jié)構(gòu)的酶通常需要用蛋白質(zhì)工程相關(guān)的原理和技術(shù)進(jìn)行改造，通過(guò)替換基團(tuán)、增減殘基、連接鍵等方式提高其抗氧化性、熱穩(wěn)定性、活性等。

Bassem 等[19]鑒定了對(duì)短小芽孢桿菌CBS 所產(chǎn)絲氨酸蛋白酶活性具有重要作用的5 個(gè)氨基酸殘基Leu31、Thr33、Asn99、Phe159 和Gly182，構(gòu) 建 了12 個(gè)突變體，其中突變體N99Y 熱半衰期在50 ℃和60 ℃分別提高了440 min 和215 min，最適溫度從65 ℃上升到75 ℃。周桂旭[20]對(duì)蛋白酶BAPB92 第188、239 和262 位氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建的4 個(gè)突變體熱穩(wěn)定性相比天然酶均得到提高，其中單一突變188 位和239 位氨基酸和組合突變A188P/V262I 的耐堿性也得到提高。湯恒[21]通過(guò)對(duì)蛋白酶SES7 進(jìn)行理性設(shè)計(jì)得到了底物選擇性和熱穩(wěn)定性均有所提高的突變體L2-5。

3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

微生物在自然條件下可產(chǎn)多種胞內(nèi)及胞外酶，但工業(yè)生產(chǎn)中其他雜酶往往會(huì)增加目標(biāo)產(chǎn)物的分離難度。不同種類(lèi)的微生物合成目標(biāo)酶的代謝模式不同，最適條件也不同，有些酶的合成還受不同物質(zhì)的誘導(dǎo)或阻遏。而且合成酶的最適條件通常不是該微生物的最適生長(zhǎng)條件，因此需要平衡產(chǎn)酶條件與生長(zhǎng)條件，使產(chǎn)出最大化。工業(yè)生產(chǎn)中通過(guò)控制發(fā)酵產(chǎn)酶過(guò)程的工藝參數(shù)可以控制產(chǎn)酶微生物的代謝通路和合成模式，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，從而達(dá)到提高酶產(chǎn)量和質(zhì)量的目的。

耿靜等[22]從海水中篩得一株產(chǎn)蛋白酶的中度嗜鹽菌Salinivibrio sp. MK070915，以Gibbons 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)條件后，所產(chǎn)蛋白酶活性明顯提高。張秀江等[23]對(duì)菌株Bacillus subtilis YKM05 進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)其最適產(chǎn)酶誘導(dǎo)物為羽毛粉，Ca2+和Fe3+對(duì)產(chǎn)酶具有促進(jìn)效果。優(yōu)化產(chǎn)酶條件后，酶產(chǎn)量最高達(dá)到650 U/mL。朱泓等[24]以枯草芽孢桿菌BY25 為材料，經(jīng)Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析得到該菌最佳的產(chǎn)酶誘導(dǎo)物為豆制品廢渣，優(yōu)化培養(yǎng)條件后產(chǎn)酶活力從304 U/mL 提高至18 000 U/mL。喬傳麗等[25]從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中分離得到6 株產(chǎn)蛋白酶菌株，其中初始酶產(chǎn)量最高的庫(kù)德畢赤酵母D1-3經(jīng)優(yōu)化產(chǎn)酶條件后酶產(chǎn)量提高了37.98%。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的蛋白酶來(lái)源較為單一，因海洋微生物具有更強(qiáng)的抗逆性，所產(chǎn)蛋白酶具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、耐酸堿性等，開(kāi)發(fā)海洋來(lái)源的新蛋白酶具有較好的前景?？刂莆⑸锱囵B(yǎng)條件可以改變胞內(nèi)酶與胞外酶的分泌比例，極大地簡(jiǎn)化后續(xù)的處理步驟。隨著對(duì)微生物源蛋白酶的更深入研究，酶工程將會(huì)在更多領(lǐng)域得到重視和應(yīng)用。