張麗杰，劉 娟，鄭春生*，王娓辰，姜 濤，魏亞?wèn)|

1中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100026；2天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津 300461

隨著世界貿(mào)易的不斷發(fā)展，我國(guó)深度參與到頻繁的國(guó)際農(nóng)業(yè)貿(mào)易中，如種苗、花卉、水果、蔬菜等植物及其產(chǎn)品的貿(mào)易往來(lái)和世界園藝博覽會(huì)等園藝展覽活動(dòng)。上述農(nóng)業(yè)貿(mào)易的發(fā)展，在帶動(dòng)國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的同時(shí)，也極大地提升了包括植物病毒在內(nèi)的有害生物的傳入風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫信息資源共享服務(wù)平臺(tái)(http:∥info.apqchina.org/)查詢，近年來(lái)我國(guó)多次在進(jìn)境植物及其產(chǎn)品中檢出檢疫性病毒，例如：2017年2月，天津口岸首次在澳大利亞進(jìn)境的燕麥AvenasativaL.干草中檢出小麥線條花葉病毒(Wheatstreakmosaicvirus, WSMV)；2017年5月，福州口岸首次從荷蘭進(jìn)境花卉種球中檢出虎眼萬(wàn)年青花葉病毒(Ornithogalummosaicvirus, OrMV)；同年12月，廈門(mén)口岸首次從旅客進(jìn)境攜帶的行李中截獲了攜帶朱頂紅花葉病毒(Hippeastrummosaicvirus, HiMV)和尼潤(rùn)潛隱病毒(Nerinelatentvirus, NeLV)的花卉種子。僅2017、2018年，我國(guó)進(jìn)境植物及其產(chǎn)品檢出檢疫性病毒近600余批次，植物病毒疫情高發(fā)嚴(yán)重威脅我國(guó)生物安全。

目前，由于缺乏有效的病毒脫除技術(shù)，口岸對(duì)截獲的攜帶檢疫性病毒的貨物一般做退運(yùn)或銷毀處理。但是，實(shí)際工作中，對(duì)于價(jià)值較高的貨物或從國(guó)外引進(jìn)的一些稀有種質(zhì)資源、優(yōu)質(zhì)種苗在發(fā)現(xiàn)攜帶病毒后直接銷毀處理，不管從經(jīng)濟(jì)價(jià)值還是科研應(yīng)用價(jià)值考慮都不夠理想，不能滿足行業(yè)發(fā)展的需要。因此，研究植物檢疫脫毒處理技術(shù)，在保證我國(guó)生物安全的前提下，將更多的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源和植物及其產(chǎn)品引入國(guó)內(nèi)，對(duì)于促進(jìn)我國(guó)經(jīng)濟(jì)貿(mào)易和種業(yè)生態(tài)多樣化發(fā)展具有重要意義。本文對(duì)現(xiàn)有的植物病毒脫毒技術(shù)進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹，重點(diǎn)對(duì)不同種類貨物可采用的檢疫脫毒處理技術(shù)進(jìn)行總結(jié)，以期為植物檢疫脫毒處理技術(shù)的研究與應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)。

1 植物脫毒處理技術(shù)概述

植物脫毒處理是指應(yīng)用物理、化學(xué)、生物學(xué)等方法，去除植物所感染的病毒，使之無(wú)害化的過(guò)程(國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)，2010)。目前，常用的植物脫毒處理的方法包括莖尖培養(yǎng)脫毒、熱處理脫毒、化學(xué)處理脫毒、低溫療法脫毒、其他脫毒處理和組合技術(shù)應(yīng)用。

1.1 莖尖培養(yǎng)脫毒

植物莖尖脫毒是利用病毒在植物莖尖或生長(zhǎng)點(diǎn)分布含量最低或者幾乎無(wú)病毒的現(xiàn)象，通過(guò)切取莖尖組織進(jìn)行培養(yǎng)得到無(wú)病毒苗的方法。其原理是：病毒的復(fù)制和傳播需借助維管束和胞間連絲，然而維管束一般存在于植物莖、葉等器官中，莖尖中只有胞間連絲，病毒被復(fù)制的速度遠(yuǎn)低于細(xì)胞生長(zhǎng)速度，且大多數(shù)病毒還需要借助運(yùn)動(dòng)蛋白來(lái)對(duì)細(xì)胞之間連絲進(jìn)行修飾，才可能使病毒核酸順利通過(guò)，因此該區(qū)域不可能帶有病毒(朱新生和朱玉賢，1997)，可利用這種方法進(jìn)行莖尖培養(yǎng)脫毒。

1.2 熱處理脫毒

熱處理脫毒是利用病毒對(duì)高溫的忍耐性和敏感性差異，通過(guò)一段時(shí)間的高溫處理，達(dá)到殺滅病毒的方法。熱處理脫毒技術(shù)的原理是：高溫可以斷裂病毒的RNA，使病毒顆粒鈍化；病毒內(nèi)部酶的裂解造成病毒顆粒破壞；一些輔助酶，如特定的RNA聚合酶的鈍化導(dǎo)致病毒RNA停止合成；在高溫下，病毒外殼蛋白構(gòu)型發(fā)生變化，病毒包裝受阻(詹康英，2018)。

1.3 化學(xué)處理脫毒

化學(xué)處理脫毒法是指將相應(yīng)的抗病毒藥劑添加于培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中為莖尖外植體離體培養(yǎng)環(huán)境)中，得到無(wú)病毒苗的方法。其原理是：抗病毒藥劑在三磷酸狀態(tài)下會(huì)阻止病毒RNA 帽子結(jié)構(gòu)形成，同時(shí)抑制病毒核酸合成，從而抑制病毒復(fù)制，達(dá)到除去病毒的目的(王超，2014)。許多化學(xué)藥品(包括嘌呤、嘧啶類似物、氨基酸和抗菌素等)對(duì)離體組織和原生質(zhì)體具有脫毒效果，如三氮唑核苷(病毒唑)、5-二氫尿嘧啶(DHT)、雙乙酰-氫-5-氮尿嘧啶(DA-DHT)、8-氮鳥(niǎo)嘌呤、2-硫脲嘧啶、放線菌素、慶大霉素、堿性孔雀綠及環(huán)乙酰鞍等。

1.4 低溫療法脫毒

低溫療法脫毒技術(shù)是指將植物的細(xì)胞、組織或器官置于極低溫度條件下(通常用液氮，-196 ℃)的保存技術(shù)(Bustametal., 2016)。其原理是：基于超低溫保存對(duì)細(xì)胞的選擇性破壞，將組織培養(yǎng)和病毒檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合以達(dá)到脫毒的目的。從理論上來(lái)說(shuō)，超低溫處理?xiàng)l件下，易感染病毒的大細(xì)胞內(nèi)含水量較大，處理過(guò)程中易受冷凍危害死亡，而頂部分生組織水分較少，細(xì)胞質(zhì)地濃，小莖尖容易成活，分化成小芽，長(zhǎng)成脫毒苗(趙習(xí)武等，2013)，這樣處理后可得到無(wú)毒的植物苗。

1.5 其他脫毒處理方法

除上述幾種脫毒處理方法外，目前的植物脫毒處理方法還包括離體微型嫁接、霧化脫毒、基因抗病毒方法等。離體微型嫁接是在超凈工作臺(tái)上將植物的莖尖切取下來(lái)嫁接到組培砧木上，以達(dá)到脫除病毒的方法(張卉等，2003)。霧化脫毒是將植物根系組織放置在避光的容器里，通過(guò)霧化營(yíng)養(yǎng)液對(duì)其定期噴灑，植物根系可以借此獲得營(yíng)養(yǎng)，滿足生長(zhǎng)過(guò)程中所需的營(yíng)養(yǎng)和水分，脫去病毒?；蚩共《臼菍?duì)病毒進(jìn)行基因介導(dǎo)抗性。Liuetal.(2007)將6個(gè)侵染核果類病毒李痘病毒(Plumpoxvirus, PPV)、李矮縮病毒(Prunedwarfvirus, PDV)、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus, PNRSV)、番茄環(huán)斑病毒(Tomatoringspotvirus, ToRSV)、美國(guó)李線紋病毒(Americanplumlinepatternvirus, APLPV)、桃花葉病毒(Peachmosaicvirus, PMV)的部分片段融合為400～500 bp大小的嵌合基因，構(gòu)建 RNAi載體，接種轉(zhuǎn)基因本生煙Nicotianabenthamiana植株后獲得PDV、PPV和ToRSV 抗性轉(zhuǎn)基因株系。

1.6 組合技術(shù)脫毒

根據(jù)植物感染病毒種、寄主耐受性以及病毒濃度等，使用多種脫毒技術(shù)組合的方法進(jìn)行植物脫毒。組合技術(shù)脫毒主要采用莖尖培養(yǎng)與其他脫毒技術(shù)組合的方式，如熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒，熱處理脫毒周期長(zhǎng)，脫毒率較低，而莖尖培養(yǎng)脫毒效果好，但植株或繁殖材料存活率較低，將2種脫毒方法相結(jié)合以達(dá)到更好的脫毒效果。此外，化學(xué)藥劑結(jié)合莖尖培養(yǎng)、熱處理脫毒技術(shù)，不但可以降低莖尖培養(yǎng)的難度，還可以降低化學(xué)藥劑的濃度或減少化學(xué)藥劑的使用。

2 進(jìn)境植物及產(chǎn)品的檢疫脫毒主要技術(shù)應(yīng)用

根據(jù)我國(guó)進(jìn)境的植物及其產(chǎn)品主要種類及其可能傳帶的檢疫性病毒，本文歸納總結(jié)了不同種類貨物檢疫性病毒的脫毒處理技術(shù)，旨在為口岸植物病毒的脫毒處理提供參考。

2.1 種球及苗木

我國(guó)為花卉種球進(jìn)口大國(guó)，主要進(jìn)口的花卉種球有郁金香TulipagesnerianaL.、百合Liliumbrowniivar.viridulumBaker、水仙Narcissusspp.、風(fēng)信子HyacinthusorientalisL.等。此外，還進(jìn)口蘋(píng)果MaluspumilaMill.、葡萄VitisviniferaL.樹(shù)苗等多種苗木。種球和苗木可傳帶多種檢疫性病毒，如果沒(méi)有有效的檢疫脫毒處理技術(shù)，將嚴(yán)重影響種苗的擴(kuò)繁和相關(guān)種植業(yè)的發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)種球和苗木中傳帶的檢疫性病毒，主要采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)組合處理方法，該方法可有效脫除此類貨物中傳帶的檢疫性病毒，得到無(wú)病毒種苗，用于擴(kuò)繁和種植。

高慧卿等(2010)將攜帶百合無(wú)癥病毒(Lilysymptomlessvirus, LSV)的百合切去0.2～0.5 mm莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)進(jìn)行莖尖培養(yǎng)與30 min熱處理后進(jìn)行莖尖培養(yǎng)比較，脫毒率由63.89%提高到74.65%。劉博(2009)采用剝莖尖(約2 mm)結(jié)合高溫變溫(白天38 ℃、10 h，夜間32 ℃、14 h)對(duì)東方百合″Tiber″攜帶LSV商品球進(jìn)行全暗培養(yǎng)，持續(xù)處理一個(gè)月后，脫毒率達(dá)100%。鄭荔丹等(2018)研究證明，對(duì)蝴蝶蘭PhalaenopsisaphroditeRchb.F.中的齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossumringspotvirus, ORSV)，采用熱處理和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方法進(jìn)行無(wú)病毒苗木的培育，所取莖尖大小一般為0.5～2.0 mm，熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)可將脫毒率提高30%～40%。

Zhaoetal.(2018)使用莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)對(duì)蘋(píng)果莖溝病毒(Applestemgroovingvirus, ASGV)進(jìn)行脫毒，發(fā)現(xiàn)在1.5 mm的莖尖內(nèi)，含有4～5個(gè)葉原基的莖尖成活率能達(dá)到100%。研究表明，將離體的蘋(píng)果試管苗在恒溫39 ℃熱處理6 d后，切取一定大小的莖尖培養(yǎng)，可完全脫出″Idared″蘋(píng)果中的病毒(Paprsteinetal.,2008)。將“金冠”“紅星”和“國(guó)光”3個(gè)蘋(píng)果品種在(37±1)℃ 條件下恒溫?zé)崽幚恚?5～28 d后進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，蘋(píng)果莖痘病毒(Applestempittingvirus, ASPV)、ASGV和蘋(píng)果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus, ACLSV)脫除率達(dá)100%(Paprsteinetal.,2009; Paunovic & Jevremovic,2006)。

2.2 植物種子

我國(guó)每年大量進(jìn)口各類植物種子，包括如黃瓜CucumissativusL.、甜菜BetavulgarisL.、菠菜SpinaciaoleraceaL.、辣椒CapsicumannuumL.、苦瓜MomordicacharantiaL.、蘿卜RaphanussativusL.、芫荽CoriandrumsativumL.、胡蘿卜DaucuscarotaL.var.sativaHoffm.、番茄LycopersiconesculentumMill.、生菜LactucasativaL.var.ramosaHort.等蔬菜種子以及草種、花種，部分種子中也檢出多種病毒，如從印度尼西亞辣椒種子種截獲ToRSV，從俄羅斯進(jìn)境的黃瓜種子截獲黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus, CGMMV)，從意大利和丹麥進(jìn)境的菠菜種子中截獲藜草花葉病毒(SowbanemosaicSobemovirus, SoMV)。目前，蔬菜種子中含有的檢疫性病毒可采用化學(xué)藥劑處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)方式進(jìn)行脫毒處理，得到無(wú)毒種子。該方法在口岸種子脫毒中的應(yīng)用目前還未見(jiàn)報(bào)道。

早在20世紀(jì)20年代Duggar & Armstrong(1925)就從商陸PhytolaccaacinosaRoxb中得到了具有抗煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)的活性物質(zhì)。Schusteretal.(1990)從化學(xué)合成的物質(zhì)中篩選出DHT(2,4-二氧六氫-1，3，5-三嗪)能夠?qū)︸R鈴薯X病毒(PotatovirusX, PVX)、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)、馬鈴薯A病毒(PotatovirusA, PVA)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)、番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus, ToMV)和煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus, TRV)有一定的抑制作用。曲岐凡等(1999)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，合成的1，3，5-三(氯乙酸)-三乙基DHT的酯類化合物，對(duì)TMV的抑制率可達(dá)90%。謝嘉華和袁建軍(2002)證明，三氮唑核苷對(duì)CMV、PVX、TMV等多種病毒生長(zhǎng)具有抑制作用，用添加三氮唑核苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)帶毒植株一段時(shí)間后，取萌發(fā)的頂芽移植到不含三氮唑核苷的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，可增加產(chǎn)生無(wú)病毒后代植株的百分率。目前，應(yīng)用于植物病毒病的新藥劑還包括植病靈乳劑，其對(duì)小麥TriticumaestivumL.、蔬菜及煙草的花葉病ChrysanthemumvirusB、蕨菜病有良好的抑制效果，對(duì)番茄花葉病和矮縮病的抑制率在85%以上。83增抗劑能降低病毒在植物體內(nèi)的擴(kuò)散速度。弱毒疫苗N14和衛(wèi)星核糖核酸S52能夠抑制花葉病毒。此外，結(jié)合口岸實(shí)際處理情況，應(yīng)用干熱處理方式脫除種子病毒的研究較多，效果更為理想。

2.3 糧谷等大宗散貨

糧谷、飼草等大宗散貨是植物病毒傳帶的主要載體，在進(jìn)境飼草中檢出小麥線條花葉病毒(Wheatstreakmosaicvirus, WSMV)，我國(guó)口岸在進(jìn)境大豆中檢出菜豆莢斑駁病毒(Beanpodmottlevirus, BPMV)等。

除借助接穗、種子或塊莖間摩擦傳染外，植物病毒主要通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物、線蟲(chóng)、真菌在寄主表皮形成傷口的方式進(jìn)行傳播。數(shù)據(jù)表明，在700多種植物病毒中，76%的病毒被證明或懷疑是由節(jié)肢動(dòng)物、線蟲(chóng)或真菌傳播，這些植物病毒有1/4侵染植物并可造成生物學(xué)上的病害(Franckietal.,1991)。由于傳毒介體具有自主移動(dòng)性，因此，它比寄主植物具有更強(qiáng)的傳毒能力。

在口岸植物檢驗(yàn)檢疫中，應(yīng)考慮來(lái)自檢疫性病毒高發(fā)地區(qū)的進(jìn)境寄主植物。進(jìn)境檢疫時(shí)未檢出病毒，但是檢出了易傳播病毒的介體生物，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行檢疫處理，以防止檢疫性病毒在我國(guó)境內(nèi)傳播、擴(kuò)散。我國(guó)32種進(jìn)境植物檢疫性病毒中，能夠傳毒的介體類群主要包括昆蟲(chóng)(23種病毒)、螨(2種病毒)、線蟲(chóng)(8種病毒)和真菌(3種病毒)，其中以昆蟲(chóng)(蚜蟲(chóng)、粉虱、粉蚧、葉甲和薊馬等)傳播的病毒種類數(shù)最多(馬駿等，2015)。昆蟲(chóng)是傳播植物病毒的主要介體，以同翅目類昆蟲(chóng)傳毒最多，其中242種蚜蟲(chóng)傳染病毒，約占介體傳播病毒種類的50%；其次是薊馬類、甲蟲(chóng)類、潛葉蠅、螨類等。

對(duì)糧谷、飼草等大宗散貨可能傳帶檢疫性病毒的處理，口岸一般采用定點(diǎn)加工和加強(qiáng)后續(xù)監(jiān)管等管理措施進(jìn)行控制，確保植物病毒疫情無(wú)擴(kuò)散。目前對(duì)于此類貨物的植物病毒檢疫應(yīng)用最為成熟的是化學(xué)處理方法?；瘜W(xué)藥劑能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)病毒的抑制，同時(shí)起到殺滅傳毒介體昆蟲(chóng)的效果。為防止加工或后續(xù)監(jiān)管過(guò)程中的植物病毒隨介體昆蟲(chóng)或媒介生物進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，對(duì)于蚜蟲(chóng)等，可采用化學(xué)殺蟲(chóng)劑進(jìn)行噴殺，對(duì)于貨物中可能發(fā)生的昆蟲(chóng)、螨類等節(jié)肢動(dòng)物可采用化學(xué)熏蒸進(jìn)行處理，防止植物病毒疫情通過(guò)傳毒介體生物擴(kuò)散。

3 小結(jié)與展望

植物病毒的多樣性和傳染性對(duì)農(nóng)業(yè)、林業(yè)及花卉養(yǎng)殖的危害巨大。在我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄中(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2007)，對(duì)于病毒和類病毒的規(guī)定已達(dá)39種(截至2017年6月)，口岸檢驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)⒅参锊《具M(jìn)行攔截，防止病毒進(jìn)入我國(guó)國(guó)境。運(yùn)用適宜的植物脫毒技術(shù)對(duì)這些病毒進(jìn)行無(wú)害化處理是目前研究的重要方向。

植物脫毒技術(shù)的運(yùn)用，對(duì)于減少經(jīng)濟(jì)損失，避免帶毒植物對(duì)我國(guó)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生危害都具有重要意義。研究植物脫毒方法時(shí)應(yīng)結(jié)合實(shí)際考慮：一是考慮不同病毒的脫毒方法差異，二是考慮對(duì)植物本身是否有影響。在目前已應(yīng)用的脫毒處理方法中，具體選擇使用熱處理脫毒，還是化學(xué)藥劑處理脫毒或者其他的脫毒方式，需根據(jù)待處理的貨物屬性來(lái)確定。對(duì)花卉種苗、水果進(jìn)行處理時(shí)一般采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的脫毒方法，效果較好且操作方便；化學(xué)藥劑、低溫療法與莖尖培養(yǎng)處理相結(jié)合也能有效地對(duì)一些病毒進(jìn)行脫除。蔬菜種子的脫毒，可以利用隔離溫室培育種苗，然后切取外植體或莖尖添加化學(xué)藥劑進(jìn)行脫毒處理。糧谷、飼草類貨物的脫毒，考慮到此類貨物病毒或者潛在病毒傳毒介體的影響，可以采用化學(xué)熏蒸和殺蟲(chóng)劑噴殺的方式進(jìn)行脫毒處理。這些都需要在處理前考慮病毒植株及繁殖材料的抗性及耐受性。現(xiàn)行檢疫處理標(biāo)準(zhǔn)中植物脫毒主要是低溫法操作，對(duì)其他綜合高效脫毒方法的規(guī)定較少。

本文通過(guò)對(duì)不同寄主植物攜帶的不同病毒進(jìn)行脫毒技術(shù)分析與比較，特別是檢疫性病毒高發(fā)地引進(jìn)的寄主植物的病毒脫毒技術(shù)，為口岸植物病毒的無(wú)害化處理工作提供了一些基本參考。筆者認(rèn)為，即使未檢測(cè)出病毒，也需對(duì)傳毒介體進(jìn)行處理，以保證不攜帶病毒進(jìn)入我國(guó)境內(nèi)。隨著技術(shù)的發(fā)展與研究的深入，口岸植物檢疫脫毒技術(shù)的方法和應(yīng)用也會(huì)進(jìn)一步創(chuàng)新和完善。