李丹，許妍，姜軍華

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心，南昌 330029

健胃止疼五味膠囊的質量標準現(xiàn)行標準為國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標準ZZ-9378-1［1］，由干姜、訶子、紫硵砂、光明鹽、蓽茇五味藥組成，具有祛寒健胃，止疼的功效。用于胃腸痙攣，脘腹冷疼，食欲不振，寒性嘔吐，腹瀉?，F(xiàn)行標準項下有化學鑒別，兩個薄層色譜分別以胡椒堿為對照鑒別蓽茇、以沒食子酸為對照鑒別訶子，兩個含量測定分別以胡椒堿為對照品測定蓽茇含量和以沒食子酸為對照品測定的訶子含量，但現(xiàn)行標準存在以下問題：一是蓽茇的薄層鑒別中，原方法提取效率低，再加上含有有毒性試劑苯；二是訶子的薄層鑒別中僅以沒食子酸為對照品，不能全面反映訶子的內(nèi)在質量；三是訶子含量測定中，僅能測到游離的沒食子酸。本研究不僅針對上述問題進行修訂，還增加了君藥干姜的薄層鑒別，旨為提升健胃止疼五味膠囊的質量標準提供參考。

1 實驗材料

儀器與試劑：LC-20AD 高效液相色譜儀（島津液相工作站，PDA 檢測器）；TLC Visualizer 薄層成像系統(tǒng)（瑞士Camag 公司）；色譜柱：Waters Sunfire C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Waters Symmetry C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），GRACE Alltima C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；BT25S 型十萬分之一電子天平（賽多利斯）；ML204T 型萬分之一電子天平（梅特勒特里多）。沒食子酸對照品（批號：110831-201204，含量89.9%），干姜對照藥材（批號：120942-200907），胡椒堿對照品（批號：110775-201405），均購于中國食品藥品檢定研究院。健胃止疼五味膠囊三批（烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號分別為：150902，160421，160433）；陰性樣品：取缺訶子的其余各藥材，按處方量及工藝自制；取缺干姜的原輔料，按處方量及工藝自制；陰性取缺蓽茇的原輔料，按處方量及工藝自制。硅膠G 薄層板（10 cm×20 cm,青島海洋化工有限公司）。試劑：Milli-Q 超純水，甲醇、乙腈均為色譜級，其他均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 干姜的薄層鑒別 取本品膠囊內(nèi)容物1 g，加乙酸乙酯20 mL，回流提取30 min，濾過，蒸干，殘渣加甲醇2 mL 復溶，作為樣品溶液。取干姜對照藥材0.15 g，加70%乙醇20 mL，加熱回流30 min，濾過，蒸干，加水10 mL，用乙酸乙酯20 mL 振搖提取，分取上層，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 復溶，作為干姜對照藥材溶液。取陰性樣品，同法制成缺干姜陰性對照溶液。照中國藥典2015 年版四部通則0502 薄層色譜法試驗，吸取樣品溶液、對照藥材溶液、陰性溶液各10 μL，分別點于10 cm×20 cm 的硅膠G 薄層預制板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸（20∶3∶1∶0.4 ）為展開劑進行展開，展開兩次，在365 nm紫外光燈下進行檢視。結果顯示，陰性樣品無干擾，三批樣品與干姜對照藥材色譜行為一致，且斑點清晰見圖1a。

2.1.2 蓽茇的薄層鑒別 取本品膠囊內(nèi)容物1 g，加無水乙醇10 mL，超聲30 min，取上清夜作為樣品溶液。另取胡椒堿對照品2 mg，置2 mL 棕色容量瓶中，加無水乙醇使溶解并定容至刻度，作為對照品溶液。取陰性樣品，同法制成缺蓽茇陰性對照溶液。照中國藥典2015 年版四部通則 0502 薄層色譜法試驗，吸取樣品溶液、對照品溶液、陰性溶液各2 μL，分別點于10 cm×20 cm 的硅膠G 薄層預制板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-無水乙醇（8∶2∶1）為展開劑進行展開，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，在日光下進行檢視。結果顯示缺蓽茇陰性對照無干擾，三批樣品色譜在與胡椒堿對照品色譜相應的位置上，顯相同的斑點，見圖1b。

2.1.3 訶子的薄層鑒別 取本品膠囊內(nèi)容物1 g，加無水乙醇10 mL，超聲30 min，取上清夜作為樣品溶液。取訶子對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。取陰性樣品，同法制成缺訶子陰性對照藥材溶液。吸取樣品溶液、對照藥材溶液、陰性溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254 薄層預制板上，以環(huán)己烷-醋酸乙酯-甲酸（12∶8∶1）為展開劑，進行展開，在254 nm 紫外光燈下檢視。結果表明陰性樣品無干擾，三批樣品與訶子對照藥材色譜行為一致，且斑點清晰，見圖1c。

2.2 訶子的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Sunfire C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；洗脫梯度：0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）；流速：1.00 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：273 nm。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品10 粒，精密稱定內(nèi)容物，混勻，研細，取約0.1 g，精密稱定，置150 mL 具塞錐形瓶中，精密加入4 mol/L 鹽酸溶液25 mL，水浴中加熱水解2 h，冷卻至室溫，轉移至50 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品12.80 mg（含量為89.9%），置50 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成的沒食子酸對照儲備液；再精密移取3 mL 上述儲備液至50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為沒食子酸對照品溶液。

2.2.4 線性關系的考察 精密吸取“2.2.3”中沒食子酸對照品溶液1、5、10、15、20、25μL，液相色譜儀進樣分析，按“2.2.1”項下色譜條件測定沒食子酸的峰面積，以進樣量（C）為橫坐標，以峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程 為Y=3 231 713.844 1X-1 393.342 8，r=1.000 0。表明沒食子酸在0.013 8～0.345 2 μg 之間呈良好的線性。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.3”中沒食子酸對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6 次，結果沒食子酸峰面積分別為448 956、449 374、449 025、448 937、450 803、447 194，其RSD 為0.3%，表明精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 平行稱取樣品（批號為160433）6 份，照“2.2.1”項下方法，依法測定，其結果分別為6.572 7、6.386 3、6.413 2、6.581 5、6.382 1、6.386 4 mg/g，RSD 為1.5%，表明重復性好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取樣品溶液（批號160433）10 μL，每隔一定時間進樣一次，結果供試品溶液中沒食子酸在12 h 內(nèi)峰面積無明顯變化，其RSD為1.5%，結果表明樣品溶液12 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.2.8 準確度試驗 采用樣品加標回收試驗，取樣品（批號160433），適量，研勻，取約0.05 g，精密稱定，平行稱取6 份，分別置150 mL 錐形瓶中，精密加入含適量沒食子酸對照品的4 mol/L 鹽酸溶液25 mL，水浴中加熱水解2 h，放冷，轉移至50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，濾過，取續(xù)濾液，照“2.2.1”項下方法試驗，計算回收率，結果回收率良好，適合本品的含量測定。結果見表1。

表1 回收率試驗結果

2.2.9 耐用性試驗 精密吸取“2.2.3”項下同一樣品溶液，照“2.2.1”項下方法進樣分析，再分別用三種不同型號的C18 柱（Waters Sunfire C18 柱、Waters Symmetry C18 柱、GRACE Alltima C18 柱）進行測定，結果沒食子酸峰在各種色譜柱均分離良好，測得含量無顯著差異，見表2。

表2 色譜柱考察測定結果

2.2.10 樣品測定 取本品3 批，照“2.2.1”項下方法進行測定，測定結果見表13。此外再將此結果與原標準國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標準ZZ-9378-1 含量測定項下訶子的結果進行比較，結果修訂后方法所測沒食子酸為總沒食子酸的量，比原方法所測的量有10%左右的增加，見表3。

表3 標準修訂前后沒食子酸的結果比較

3 討論

3.1 薄層色譜

本研究對蓽茇、訶子的薄層色譜方法進行修訂，同時增加了干姜的薄層色譜方法。將蓽茇的提取式由冷浸改成了超聲，提高了提取效率，考慮到苯已經(jīng)被《中國藥典》2020 年版［2］禁用，故重新考察了展開條件，最終確定為環(huán)己烷-乙酸乙酯-無水乙醇（8∶2∶1）；為全面反映訶子的內(nèi)在質量，將訶子的TLC 色譜中沒食子酸換成訶子對照藥材；干姜屬君藥，含有揮發(fā)油，二苯基庚烷，姜辣素等多種化學成分［4-6］，干姜味辛性熱，有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的功效［7,8］，故增加干姜的薄層鑒別，更好地控制產(chǎn)品質量。

三個薄層色譜條件均考察了不同溫度（8.0 ℃，25 ℃，35 ℃）、濕度（32%，50%，72%）、不同廠家和型號的薄層板（自制的硅膠G 板與GF254板，上海東方G 板與GF254 板，青島海洋G 板與GF254 薄層板），結果顯示不同溫度、濕度，不同薄層板對分離效果無影響。

3.2 訶子的含量測定

關于沒食子酸的含量有較多報道［9-11］，本文中通過對沒食子酸在200～400 nm 波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，結果在217 nm 波長處有最大吸收，但為末端吸收，樣品中峰雜質大，參照《中國藥典》2015 年版一部［3］五倍子的沒食子酸含量測定項，故確定273 nm 為測定波長。參考中國藥典2015 年版一部“五倍子”標準，采用4 mol/L 鹽酸水解測總沒食子酸的方法。此外，還考察了提取溶劑體積（10、25、50 mL）、提取時間（1、2、4 h），結果表明提取溶劑體積為25 mL 和50 mL 時相差不大，提取時間 2 h 基本水解完全。最終確定了測定條件采用4 mol/L 鹽酸作為提取溶劑，提取體積為25 mL、提取時間為2 h，檢測波長為273 nm。