□ 李 濤 楊 偉 李 蓉 趙海云 劉澤弘 大理州食品檢驗(yàn)檢測(cè)院

乳扇是云南大理白族人民的一種傳統(tǒng)民族食品，屬于拉伸型干酪[1]，是將鮮牛乳加入煮沸的酸漿中經(jīng)凝乳、熱燙、拉伸等制成的食品[2]，酸漿是將未煮過(guò)的牛奶置于太陽(yáng)下使其自然發(fā)酵變酸而得，也可以利用酸木瓜或梅子加水煮沸、靜置而得[3]。乳扇富含多種礦物元素和維生素，其中蛋白質(zhì)含量達(dá)到30.4%，脂肪含量達(dá)到50%，鐵含量較其他乳制品高，可以達(dá)到5.5 mg/100 g[4]。乳糖不耐癥患者和糖尿病患者也可食用乳扇[5]，但由于乳扇中的蛋白質(zhì)以大分子酪蛋白為主，且脂肪含量過(guò)高，不易被嬰幼兒消化吸收，故不宜作為嬰幼兒食品[6]。目前乳扇大部分是以家庭作坊的形式生產(chǎn)，制作乳扇的原料乳大多來(lái)自家庭散養(yǎng)的奶牛，產(chǎn)品質(zhì)量難免會(huì)參差不齊。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，目前對(duì)乳扇的研究主要集中于加工工藝[2,3,7]、營(yíng)養(yǎng)成分[1,4,6]和金屬元素含量檢測(cè)[8—10]方面，對(duì)乳扇中食品添加劑檢測(cè)的研究報(bào)道較少。因此，本工作擬建立一種高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定乳扇中的安賽蜜、檸檬黃、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和日落黃，旨在為乳扇的質(zhì)量控制提供方法參考。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

UItimate 3000 高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB—C18色譜柱（安捷倫科技有限公司）；JY5002 電子天平（上海舜宇恒平儀器有限公司）；TDL—40B 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AS1709325 超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；VORTEX2 渦旋混勻器（DAIHAN Scientific Co.）；UPH—IV—20T 超純水機(jī)（云南優(yōu)普科技有限公司）；THB—B 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（常州市國(guó)立試驗(yàn)設(shè)備研究所）。

安賽蜜、檸檬黃、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度均為1 000 μg/mL，均購(gòu)自壇墨質(zhì)檢—標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）。

乙腈（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；海砂（含量≥99.8%，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；石油醚、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、無(wú)水乙醇、氨水、冰乙酸（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

乳扇樣品購(gòu)自大理當(dāng)?shù)靥禺a(chǎn)店，切碎后置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

李老鬼認(rèn)定，他侄兒落到這一步，全是付玉害的。這天，他決定給付玉聯(lián)系一下，打了幾個(gè)號(hào)，終于有一個(gè)是通的。他說(shuō)，我是李叔和的叔，有個(gè)大人物想見你。另外，我有一包東西要送你。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別吸取1.0 mL 濃度為1 000 μg/mL的安賽蜜、檸檬黃、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成濃度為100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2 樣品前處理方法

稱取2 g（精確到0.01 g）樣品置于研缽中，加入10 g海砂和2 mL超純水，研磨混勻，吹冷風(fēng)使試樣干燥，加入50 mL 石油醚，混勻，靜置片刻，棄去石油醚，重復(fù)處理3 次，吹干后轉(zhuǎn)入50 mL 聚丙烯離心管中，加入10 mL無(wú)水乙醇+氨水+水（體積比，7+2+1）溶液，超聲提取10 min 后依次加入2.5 mL 亞鐵氰化鉀（106 g/L）溶液和2.5 mL 乙酸鋅（219 g/L）溶液，渦旋混勻1 min，4 000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL 燒杯中，于殘?jiān)屑尤?0 mL 無(wú)水乙醇+氨水+水（體積比，7+2+1）溶液，渦旋混勻1 min后超聲提取5 min，4 000 r/min 離心5 min 后合并上清液至同一100 mL燒杯中，重復(fù)操作3 ～5 次，直至殘?jiān)袩o(wú)色素殘留。將上清液用冰乙酸調(diào)節(jié)pH 至7.0，于80 ℃水浴蒸發(fā)至近干后，用超純水定容至10 mL，過(guò)0.22 μm 聚醚砜微孔濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 高效液相色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB—C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），5—Micron；流動(dòng)相：甲醇—0.02 mol/L乙酸銨，梯度洗脫，洗脫程序見表1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的處理

乳扇中含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，故本試驗(yàn)未直接加提取液提取，而是先在樣品中加入適量海砂和水，充分研磨使其均勻分散開，加入石油醚除去脂肪后再加提取液提取，由于蛋白質(zhì)是一種膠體，亞鐵氰化鉀和乙酸鋅反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅沉淀能夠挾走或吸附干擾物質(zhì)，且這兩種高濃度的鹽離子水化能力很強(qiáng)，能夠奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，能有效沉淀樣品中的蛋白質(zhì)[11]，故本試驗(yàn)選擇106 g/L 亞鐵氰化鉀溶液和219 g/L 乙酸鋅溶液來(lái)去除樣品中的蛋白質(zhì)。

2.2 樣品的提取

亞鐵氰化鉀和乙酸鋅反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅沉淀會(huì)吸附檸檬黃和日落黃，用超純水提取很難將其洗脫下來(lái)。安賽蜜、檸檬黃和日落黃是水溶性化合物，易溶于水和極性溶液，苯甲酸、山梨酸和糖精鈉在堿性條件下以鹽的形式存在，可溶于強(qiáng)極性溶劑。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[12—15]，通常用氨化乙醇和氨化甲醇來(lái)洗脫合成著色劑，考慮到高濃度的乙醇可使蛋白質(zhì)脫水，促進(jìn)蛋白質(zhì)的凝聚，同時(shí)乙醇可起到破壞沉淀膠體減少干擾的作用[16]，本試驗(yàn)選擇無(wú)水乙醇+氨 水+ 水（體 積 比，7+2+1）作 為 提取劑。

為防止堵塞、污染色譜柱和管路系統(tǒng)，在上機(jī)檢測(cè)前應(yīng)使用微孔濾膜過(guò)濾。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尼龍濾膜對(duì)檸檬黃和日落黃有較強(qiáng)的吸附作用，而聚醚砜濾膜幾乎不吸附這6 種組分，因此，在上機(jī)前先用0.22 μm 聚醚砜微孔濾膜過(guò)濾。6 種食品添加劑的色譜圖見圖1。

圖1 樣品加標(biāo)（25 mg/kg）色譜圖

2.3 線性和檢出限

分別吸取0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 、2.00 mL 與5.00 mL濃度為100 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成濃度為0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL和50.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6 種組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖2。在樣品中添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，按2.1 中的方法處理后上高效液相色譜儀檢測(cè)，稱樣量按2 g 計(jì)，以3 倍信噪比（S/N）所對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算檢出限；以10 倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算定量限，6 種組分的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限列于表2。從表2 可以看出，各組分在0.0 ～50 μg/mL 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999 9，檢出限為0.15 ～1.40 mg/kg，定量限為0.5 ～4.7 mg/kg，滿足待測(cè)組分的檢測(cè)要求。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg/mL）色譜圖

表2 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.01 g）樣品于研缽中，分別加入0.1、0.2、0.50 mL 濃 度 為100 μg/mL 的 混 合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，混勻，分別制成6 種食品添加劑含量均為5、10、25 mg/kg 3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度水平做6 個(gè)平行測(cè)定，按照2.1 項(xiàng)下方法處理樣品后測(cè)量，測(cè)量結(jié)果列于表3。從表3 中可以看出，樣品的加標(biāo)回收率在85.5%～112.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.14%～3.55%。表明方法的準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論

本研究建立了一種高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定乳扇中安賽蜜、檸檬黃、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和日落黃的方法。在最佳條件下，樣品的加標(biāo)回 收 率 為85.5% ～112.6%， 相 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.14%～3.55%，檢出限在0.15 ～1.40 mg/kg，定量限在0.5 ～4.7 mg/kg。本方法線性關(guān)系良好，回收率高，精密度好，能夠?yàn)槿樯鹊馁|(zhì)量控制提供一定的數(shù)據(jù)支持和方法參考。

表3 樣品的加標(biāo)回收率（n=6）