李 俊，韋艷娜，劉蓓蓓，熊祺琰，邵國青，肖海君，譚 濤，馮志新*

[1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014；2.禮藍(lán)(上海)動(dòng)物保健有限公司，上海 200003]

支原體病是目前造成國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的重要疾病之一，所產(chǎn)生的影響可分為直接影響(導(dǎo)致豬死亡和淘汰)和間接影響(提高料肉比和降低日增重)[1]。至今為止已發(fā)現(xiàn)能引起豬發(fā)生支原體病的病原有6種，其中會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重危害的支原體主要為豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)和豬滑液支原體(Mycoplasma hyosynoviae)[2]。豬肺炎支原體引發(fā)的豬喘氣病危害最廣，又稱為豬地方性流行性肺炎，是一種接觸性、慢性呼吸道傳染病，患病豬主要表現(xiàn)為咳嗽、氣喘、生長(zhǎng)遲緩和飼料轉(zhuǎn)化率不佳，病理解剖可見肺葉呈胰樣或肉樣病變[3]。豬鼻支原體主要引起10周齡以下的仔豬發(fā)生散發(fā)性、急性、多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和肺炎[4]。豬滑液支原體是誘發(fā)生長(zhǎng)豬和育肥豬關(guān)節(jié)炎的重要病原體之一[5]。

雖然接種疫苗可以有效減少感染，但抗菌藥物仍是臨床防治豬支原體病的重要手段[6]。目前獸醫(yī)臨床常用的抗支原體藥物主要有四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、截短側(cè)耳素類、酰胺醇類、氨基糖苷類以及氟喹諾酮類[7]，但抗菌藥物的選擇性壓力可能會(huì)導(dǎo)致支原體產(chǎn)生耐藥性[8]。支原體生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)條件苛刻，臨床分離培養(yǎng)非常困難。相對(duì)于細(xì)菌，近年來國內(nèi)外有關(guān)畜禽支原體對(duì)抗菌藥物敏感性及耐藥性的研究資料較少[9]。目前，美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)和歐盟抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)尚 未建立動(dòng)物支原體對(duì)抗菌藥物敏感性檢測(cè)和結(jié)果判定的國際標(biāo)準(zhǔn)[10]。

本研究以臨床上危害嚴(yán)重的豬肺炎支原體、豬鼻支原體和豬滑液支原體作為豬支原體的代表，測(cè)定其田間分離株對(duì)臨床常用抗豬支原體藥物(枝原凈和泰農(nóng))的敏感性，以期了解豬支原體的耐藥情況，為豬支原體病的臨床合理用藥及防控提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

豬肺炎支原體、豬鼻支原體和豬滑液支原體均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所豬病防控研究室保存。豬肺炎支原體10株，2010—2017年分離自江蘇的南京和無錫以及安徽等地區(qū)的患病豬。豬鼻支原體10株，2010—2018年分離自江蘇的南京、泰興等地區(qū)的患病豬。豬滑液支原體標(biāo)準(zhǔn)株，編號(hào)為ATCC27095，購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

KM2液體培養(yǎng)基由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所豬病防控研究室提供。

1.1.3 抗菌藥物

枝原凈(有效成分為延胡索酸泰妙菌素，純度為80%)和泰農(nóng)(有效成分為磷酸泰樂菌素，純度為8.8%)均由禮藍(lán)(上海)動(dòng)物保健有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 豬支原體菌液儲(chǔ)存液的制備

分別取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的豬肺炎支原體、豬鼻支原體和豬滑液支原體各0.5 mL，轉(zhuǎn)接到4.5 mL KM2培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)豬肺炎支原體與豬鼻支原體的培養(yǎng)基顏色變黃、培養(yǎng)豬滑液支原體的培養(yǎng)基顏色變紅后，分裝各菌，每管1 mL，作為菌液儲(chǔ)存液于－80 ℃下凍存。

1.2.2 豬支原體的滴度測(cè)定與接種懸液制備

將在－80 ℃下保存的豬肺炎支原體、豬鼻支原體和豬滑液支原體解凍后，采用新鮮配制的KM2培養(yǎng)基復(fù)蘇和傳代，測(cè)定它們的滴度，即顏色變化單位(Color Change Unit，CCU)，根據(jù)各支原體不同分離株的滴度(CCU/mL)，采用KM2培養(yǎng)基調(diào)整菌液量至1×104CCU/mL～1×105CCU/mL，作為接種懸液備用。

1.2.3 抗菌藥物的配制與工作液制備

根據(jù)待試藥物的有效成分含量計(jì)算所需藥物量，準(zhǔn)確稱取后無菌操作溶解于相應(yīng)的溶劑中，配制母液濃度為1 280 μg/mL，置于－40 ℃下保存。將各藥物母液用KM2液體培養(yǎng)基按二倍稀釋法稀釋至15個(gè)工作液濃度。枝原凈與泰農(nóng)的最終測(cè)定濃度梯度范圍為0.015 μg/mL～256 μg/mL。

1.2.4 豬支原體對(duì)抗菌藥物敏感性測(cè)定

參考Hannan的方法[11]，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定抗菌藥物對(duì)三種豬支原體的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)。在96孔細(xì)胞微孔板中進(jìn)行MIC測(cè)定。首先依次加入0.1 mL各濃度梯度的抗菌藥物工作液，再接種等量的豬支原體懸液(1×104CCU/mL～1×105CCU/mL)，此時(shí)藥物濃度稀釋兩倍，同時(shí)設(shè)置菌株培養(yǎng)液作為陽性對(duì)照，KM2液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，各MIC試驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行。將96孔細(xì)胞微孔板密封后置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，逐日觀察顏色變化，記錄初始MIC與終末MIC。以陰性對(duì)照孔不變色，陽性對(duì)照孔變色，試驗(yàn)孔不發(fā)生肉眼可見顏色變化的最低藥物濃度為該藥物對(duì)該菌的MIC。

2 結(jié)果

2.1 豬肺炎支原體對(duì)枝原凈和泰農(nóng)的敏感性結(jié)果

由表1和圖1可見，枝原凈(延胡索酸泰妙菌素)對(duì)10株受試豬肺炎支原體的MIC范圍為0.015 μg/mL～0.25 μg/mL，經(jīng)計(jì)算，其 MIC50為 0.06 μg/mL，MIC90為0.12 μg/mL。泰農(nóng)(磷酸泰樂菌素)對(duì)豬肺炎支原體的MIC范圍為0.03 μg/mL～0.06 μg/mL，各菌株的MIC分布相對(duì)集中，其MIC50和MIC90均為0.06 μg/mL。

2.2 豬鼻支原體對(duì)枝原凈和泰農(nóng)的敏感性結(jié)果

豬鼻支原體對(duì)枝原凈和泰農(nóng)的藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果見表2和圖2。

分析可知，枝原凈對(duì)豬鼻支原體的MIC范圍為0.03 μg/mL～0.5 μg/mL，MIC50為 0.125 μg/mL，MIC90為 0.25 μg/mL。泰農(nóng)對(duì)豬鼻支原體的MIC范圍為0.06 μg/mL～ 128 μg/mL，MIC50為0.5 μg/mL，MIC90為 4 μg/mL， 其 中11071603菌株的MIC高達(dá)128 μg/mL，可能為高水平耐藥菌株。

2.3 豬滑液支原體對(duì)枝原凈和泰農(nóng)的敏感性結(jié)果

本研究所測(cè)豬滑液支原體為標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27095，其對(duì)兩種藥物均敏感。枝原凈對(duì)豬滑液支原體的MIC為0.03 μg/mL，泰農(nóng)對(duì)其MIC為0.25 μg/mL。

3 討論

支原體缺乏細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，作用于細(xì)胞壁的β-內(nèi)酰胺類藥物對(duì)其無效，而作用于蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制環(huán)節(jié)的大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物具有較強(qiáng)的抗支原體效果[12]。本研究結(jié)果顯示豬肺炎支原體分離株對(duì)臨床常用的抗支原體藥物(枝原凈和泰農(nóng))均較為敏感。

目前國內(nèi)有關(guān)豬肺炎支原體對(duì)抗菌藥物敏感性的文獻(xiàn)報(bào)道較少，2013年張純萍等采用宏量肉湯稀釋法測(cè)定了4株豬肺炎支原體對(duì)多種藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體對(duì)泰妙菌素和氟喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星)最敏感，其次是四環(huán)素類、林可霉素和泰樂菌素，對(duì)氟苯尼考的敏感性較差[13]。國外早在1991年測(cè)定了10株豬肺炎支原體田間分離株對(duì)18種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果是泰妙菌素對(duì)豬肺炎支原體的MIC范圍為0.03 μg/mL～0.06 μg/mL，MIC50為 ≤ 0.03 μg/mL，MIC90為0.06 μg/mL；對(duì)泰樂菌素的MIC范圍為≤0.03 μg/mL～0.12 μg/mL，MIC50為≤ 0.06 μg/mL，MIC90為 0.06 μg/mL[14]；上述結(jié)果與本研究的測(cè)定結(jié)果較一致。2018年，Anne V Gautier-Bouchardon綜述了近年豬肺炎支原體對(duì)多種抗菌藥物的敏感性變化，發(fā)現(xiàn)2000年之前豬肺炎支原體的臨床分離株對(duì)泰妙菌素的敏感性范圍在≤0.006 μg/mL～0.3 μg/mL，對(duì)泰樂菌素的MIC范圍為≤0.006 μg/mL～6.25 μg/mL；而2000年后分離株對(duì)泰妙菌素的MIC范圍上升至≤0.01 μg/mL～0.125 μg/mL，對(duì)泰樂菌素的敏感性上升至0.008 μg/mL～16 μg/mL[9]。

在本研究中，受試豬鼻支原體對(duì)枝原凈較為敏感。目前，豬鼻支原體的臨床流行病學(xué)調(diào)查研究較為少見，我國尚未有相關(guān)報(bào)道。國外的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示2000年以前豬鼻支原體分離株對(duì)泰妙菌素的敏感性介 于 0.025 μg/mL～ 0.78 μg/mL， 對(duì)泰樂菌素的MIC范圍為≤0.03 μg/mL～25 μg/mL，2000年后分離株對(duì)泰妙菌素的MIC上升至0.2 μg/mL～1.56 μg/mL，對(duì)泰樂菌素的MIC上升至0.4 μg/mL～100 μg/mL，顯示豬鼻支原體臨床分離株對(duì)這兩種藥物的敏感性呈下降趨勢(shì)[9]。Katinka Beko 等 測(cè) 定 了 2014—2017年從匈牙利不同地區(qū)分離到的38株豬鼻支原體對(duì)15種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體對(duì)泰妙菌 素 的MIC范 圍 為0.156 μg/mL～0.625 μg/mL，MIC50為 0.156 μg/mL，MIC90為0.312 μg/mL； 豬 滑 液 支 原體對(duì)泰樂菌素的MIC范圍較寬，為≤0.25 μg/mL～＞64 μg/mL，MIC50為0.5 μg/mL，MIC90高達(dá)＞ 64 μg/mL[15]，與本研究結(jié)果一致。目前尚無臨床上對(duì)泰樂菌素高度耐藥的豬鼻支原體耐藥機(jī)制的報(bào)道，因此值得進(jìn)一步研究。

本研究測(cè)定了豬滑液支原體標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27095對(duì)枝原凈(MIC=0.03 μg/mL)和泰農(nóng)(MIC=0.25 μg/mL)的敏感性。國內(nèi)目前尚無豬滑液支原體流行病學(xué)的報(bào)道。國外相關(guān)研究報(bào)道了2000年前豬滑液支原體分離株對(duì)泰妙菌素的敏感性范圍為0.002 5 μg/mL～0.100 0 μg/mL，對(duì)泰樂菌素的MIC介于0.025 μg/mL～＞10 μg/mL；2000年后豬滑液支原體分離株對(duì)泰妙菌素的MIC上升至≤0.25 μg/mL，對(duì)泰樂菌素的敏感性范圍為≤0.25 μg/mL[9]～1.00 μg/mL[9]。K K Schultz等檢 測(cè)了1997—2011年分離到的24株豬滑液支原體田間分離株對(duì)18種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果為豬滑液支原體對(duì)泰妙菌素的MIC50為0.12 μg/mL，對(duì)泰樂菌素的MIC50為0.25 μg/mL[16]。

4 結(jié)語

豬支原體病是造成國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的重要疾病之一，抗菌藥物仍是臨床治療豬支原體感染的快速有效的手段。本研究結(jié)果表明豬肺炎支原體、豬鼻支原體和豬滑液支原體對(duì)枝原凈均較為敏感，枝原凈可以作為臨床治療豬支原體感染的有效藥物。泰農(nóng)對(duì)豬肺炎支原體和豬滑液支原體的抑制效果較好。在獸醫(yī)臨床工作中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)支原體的分子流行病學(xué)與抗菌藥物敏感性的監(jiān)測(cè)，從而制定科學(xué)合理的用藥方案，為防控疾病的發(fā)生和蔓延提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。