何秀峰，趙豐云，于 坤，楊 湘，王軍武，郁松林*

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003； 2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院林園研究所，新疆 石河子 832000）

新疆地處中國西北地區(qū)，氣候極端干旱，土壤鹽堿化逐年加重。鹽堿土結(jié)構(gòu)退化、有機(jī)質(zhì)含量、土壤酶和微生物活性低，養(yǎng)分釋放慢［1］，嚴(yán)重阻礙農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［2］。因此，對新疆鹽堿地進(jìn)行恢復(fù)和改良迫在眉睫、刻不容緩。生物炭（biochar）是生物質(zhì)在無氧或缺氧環(huán)境條件下緩慢高溫分解得到的富含碳的有機(jī)物質(zhì)［3］。不僅可以減少養(yǎng)分淋失［4］，改善土壤結(jié)構(gòu)［5］，也可以為土壤微生物提供營養(yǎng)元素和棲居場所［6］，減少微生物間的生存競爭，保護(hù)土壤有益微生物［7］，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，影響土壤細(xì)菌多樣性［8-10］，Grossman等［11］認(rèn)為富含生物炭的亞馬遜黑土與相鄰未改造土相比土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)差異顯著，Muhammad等［12］研究指出，豬糞炭和果皮炭可通過改變紅壤土的化學(xué)特性來改變微生物群落結(jié)構(gòu)，Sun等［13］研究發(fā)現(xiàn)在東北黑鈣土中施入生物炭粒后34個月分解過程中，細(xì)菌群落的物種豐富度增加，但多樣性降低。張宏等［14］報道連續(xù)施用2年生物炭后，灰漠土土壤容重降低，土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀含量增加。土壤理化性質(zhì)的改變可間接影響土壤酶活性［15］，土壤酶作為土壤中各種代謝反應(yīng)和能量轉(zhuǎn)化的參與者，與微生物間保持著緊密聯(lián)系［16］，其活性變化可反映土壤生物功能與肥力特性。

新疆是中國面積最大的葡萄種植地區(qū)，截至2019年種植面積達(dá)到13.3多萬hm2。但由于長期不合理的田間管理，致使土壤板結(jié)、次生鹽漬化等問題日益突出，亟需采取一些措施對土壤進(jìn)行改良。生物炭作為一種新型土壤改良劑，在土壤改良方面發(fā)揮重要作用［17-19］，近年來受到許多研究者的廣泛關(guān)注。以往研究主要側(cè)重于不同用量生物炭混施改良土壤。但由于果樹根區(qū)土壤體積龐大，土壤與生物炭混勻施入在生產(chǎn)中投入的成本較大，果樹根區(qū)穴施施肥是生產(chǎn)中較為常見的施肥方法，但通過穴施生物炭改良土壤進(jìn)而提高土壤肥力的研究還鮮見報道。故本研究采用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，研究生物炭不同施用方式及施用量對葡萄幼苗根際土壤養(yǎng)分、酶活性及微生物多樣性的影響，以期為新疆地區(qū)葡萄生產(chǎn)合理使用生物炭提高土壤肥力與維持土壤持續(xù)生產(chǎn)力提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年5月至9月在新疆石河子市石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站（44°26′N，85°95′E）日光溫室中進(jìn)行，試驗(yàn)過程中氣溫保持17～33℃，空氣相對濕度保持60%～80%。供試葡萄品種為一年生“弗雷”葡萄幼苗。供試土壤取自石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站葡萄園表層（0～20 cm），為灰漠土，過0.425 mm篩，其堿解氮為77.28 mg/kg，速效鉀261.91 mg/kg，有效磷42.64 mg/kg，有機(jī)質(zhì)13.61 g/kg。生物炭購自山東某生物公司，是蘋果木經(jīng)高溫裂解制成的，其pH 8.56，有效磷186.67 mg/kg，速效鉀376.98 mg/kg，全磷15.3 g/kg，全鉀6.6 g/kg，生物質(zhì)活性炭≥50%。

1.2 試驗(yàn)處理

采用盆栽試驗(yàn)，花盆上徑29 cm、下徑23 cm、高30 cm，定植前每盆裝土8 kg。根據(jù)生物炭施入方式與炭土質(zhì)量比設(shè)置5個處理：不施生物炭（對照，CK）；混施2.5%的生物炭（HA）；混施5%的生物炭（HB）；穴施2.5%的生物炭（JA）；穴施5%的生物炭（JB）。每處理3個區(qū)組，每區(qū)組6盆。于2018年5月28日選用長勢一致的具4～5片葉的一年生“弗雷”葡萄扦插苗栽植到花盆中，每桶1株，各處理水肥等管理措施均保持一致。

2018年9月18日取土樣，每處理從3個區(qū)組中各隨機(jī)選取5株，剪掉地上部分破壞性取出植株，去除根系周圍大塊土壤，輕輕抖下植株根系表面土壤，混合均勻，過2 mm篩后分為兩部分，一部分裝入無菌自封袋，置于?80℃冰箱冷藏保存待進(jìn)行微生物多樣性測定，另一部分自然風(fēng)干后裝袋用于測定土壤基本化學(xué)性質(zhì)與酶活性。

1.3 測定方法

土壤化學(xué)性質(zhì)測定參照Shen等［20］的方法。土壤pH按1∶5土水比測定；有機(jī)質(zhì)測定采用重鉻酸鉀外加熱法；堿解氮測定采用堿解擴(kuò)散法；有效磷測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀測定采用醋酸銨浸提-火焰光度法；土壤容重測定采用環(huán)刀法。

土壤過氧化氫酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶、脲酶活性分別采用高錳酸鉀滴定法、磷酸苯二鈉比色法、3，5-二硝基水楊酸比色法、苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定。測定參照關(guān)松蔭［21］的方法。

土壤微生物DNA的提取使用試劑盒Soil DNA Kit（D5625-01）。抽提完成的DNA，使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測質(zhì)量和濃度。隨后取適量樣品于離心管中，用無菌水稀釋。為確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性，使用520F（5’-AYTGGGYDTAAAGNG-3’）和802R（5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’）引物及NEB Q5 DNA高保真聚合酶進(jìn)行V3、V4區(qū)基因片段的PCR。PCR擴(kuò)增體系見表1。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性30 s；27個循環(huán)包括（98 ℃變性15 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min，4℃保存。之后進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收、定量和混樣，混樣后進(jìn)行文庫的構(gòu)建和質(zhì)檢，對合格文庫上機(jī)測序。

表1 PCR擴(kuò)增體系

1.4 生物信息分析及數(shù)據(jù)處理

下機(jī)數(shù)據(jù)中存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為使分析結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，對原始數(shù)據(jù)使用FLASH［22］和QIIME［23］進(jìn)行拼接和過濾，得到有效數(shù)據(jù)。然后將有效序列中相似度為97%的序列聚類獲得OTUs，隨后參考Greengene數(shù)據(jù)庫［24］進(jìn)行物種注釋，開展多樣性指數(shù)、物種分類及RDA冗余分析，并對Unweighted的Unifrac距離矩陣進(jìn)行NMDS分析和UPGMA聚類分析。

應(yīng)用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與計算，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢測，顯著性水平設(shè)定為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生物炭處理對土壤有機(jī)質(zhì)及養(yǎng)分的影響

由表2可以看出，生物炭混施（HA、HB）方式下，土壤有機(jī)質(zhì)、速效鉀含量隨生物炭施用量的增加而增加，其中HA處理土壤有機(jī)質(zhì)、速效鉀含量顯著高于CK（P<0.05），分別比CK高53.7%、19.0%。HB處理土壤有機(jī)質(zhì)、速效鉀含量亦顯著高于CK，分別比CK高73.7%、20.8%，但HA與HB處理間土壤有機(jī)質(zhì)、速效鉀含量差異不顯著（P>0.05）。土壤堿解氮、有效磷含量也隨生物炭施加量的增加而增加，其中HB處理土壤堿解氮、有效磷含量顯著高于CK（P<0.05），分別比CK高19.2%、42.3%，HA處理土壤堿解氮、有效磷含量與CK間無顯著差異。穴施（JA、JB）方式下，有機(jī)質(zhì)及各養(yǎng)分物質(zhì)含量均低于混施處理，除堿解氮外都高于CK，其中堿解氮、速效鉀含量表現(xiàn)出隨施炭量的增加而增加，有機(jī)質(zhì)、有效磷含量則表現(xiàn)出相反的趨勢。同一施用量下混施處理土壤有機(jī)質(zhì)、速效鉀、堿解氮、有效磷含量均高于穴施處理，生物炭對土壤pH和容重影響較小。

表2 不同生物炭處理對土壤有機(jī)質(zhì)及養(yǎng)分的影響

2.2 不同生物炭處理對土壤酶活性的影響

由表3可知，不同生物炭處理對土壤酶活性的影響不同，混施（HA、HB）方式下，土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性隨生物炭施用量的增加而增加，其中HA處理土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性顯著高于CK（P<0.05），分別比CK高8.2%、6.7%，HB處理土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性亦顯著高于CK，分別比CK高10.5%、8.6%；穴施（JA、JB）方式下，土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性也隨施炭量的增加而增加，與CK相比，JA處理土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性顯著增加6.6%、1.9%（P<0.05），JB處理土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性顯著增加7.0%、3.8%。同一施用量下，混施處理土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性高于穴施處理。各處理中脲酶活性變化表現(xiàn)為HB處理脲酶活性顯著低于CK 18.8%（P<0.05），HA、JA處理脲酶活性高于CK，但與CK間無顯著差異，而JB處理脲酶活性顯著高于CK 6.3%（P<0.05），生物炭對酸性磷酸酶影響較小。

表3 不同生物炭處理對土壤酶活性的影響

2.3 不同生物炭處理對土壤微生物多樣性的影響

2.3.1 細(xì)菌OTUs豐度

細(xì)菌OTUs豐度稀疏曲線表明隨著測序量的上升，稀疏曲線斜率逐漸降低，漸趨平坦但并未達(dá)到平臺期，說明測序量已足夠反映樣品的物種組成特征，但依然有小部分低豐度類群未被覆蓋（圖1）。

圖1 細(xì)菌OTUs豐度稀疏曲線

2.3.2 不同生物炭處理對土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)的影響

土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)Chao1、ACE分析表明，同一施炭量下Chao1和ACE均表現(xiàn)出HB>JB、HA>JA，其中HB處理Chao1和ACE指數(shù)高于CK，分別比CK高1.06%，1.02%，但差異不顯著（P>0.05），而HA、JA、JB處 理Chao1和ACE指數(shù)不同程度地低于CK；同一施用方式下，Chao1和ACE隨施炭量的增加而增加。多樣性指數(shù)Shannon分析表明，混施處理與穴施處理間土壤細(xì)菌群落多樣性無顯著差異（表4）。

表4 不同生物炭處理對土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)的影響

2.3.3 細(xì)菌群落組成的NMDS分析及UPGMA聚類分析

NMDS分析表明，CK與HA、HB、JA、JB間距離遠(yuǎn)近表現(xiàn)為HA>JA>HB>JB，其中JA與JB相接近，而HA與HB相接近（圖2）。UPGMA聚類分析表明，CK與JA、JB被聚為一個分支，而HA、HB被聚為一個分支（圖3）。說明CK與JA、JB間的物種組成相似性高于CK與HA、HB間的物種組成相似性。

圖2 土壤中細(xì)菌群落的NMDS分析

圖3 門水平上的細(xì)菌相對豐度聚類樹

2.3.4 氮磷鉀代謝相關(guān)菌屬對生物炭的響應(yīng)

穴施（JA、JB）方式下，與氮代謝相關(guān)菌屬硝化螺旋菌屬（Nitrospira）隨生物炭施用量的增加而增加，而混施（HA、HB）方式下與之相反，其中HB處理硝化螺旋菌屬不同程度地低于CK及其它處理，比CK低20.1%；HA、JA、JB處理硝化螺旋菌屬高于CK，但差異不顯著（P>0.05）。與磷代謝相關(guān)菌屬節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）在兩種施用方式下均表現(xiàn)出隨生物炭施用量的增加而增加；同一施用量下，混施處理節(jié)細(xì)菌屬高于穴施處理，其中HA、HB、JB處理節(jié)細(xì)菌屬高于CK，分別比CK高2.6%、10.8%、9.8%，各處理間及與CK間差異不顯著，JA處理節(jié)細(xì)菌屬顯著低于CK 32.6%（P<0.05）。與鉀代謝相關(guān)菌屬假單胞菌屬（Pseudomonas）在同一施用方式下大小排序?yàn)镠A>HB、JB>JA，同一施用量下，混施處理假單胞菌屬高于穴施處理，其中HA、HB、JB處理假單胞菌屬高于CK，分別比CK高160.2%、73.2%、16.8%，HA與JB、CK處理間差異顯著（P<0.05），但與HB處理間差異不顯著（P>0.05），JA處理假單胞菌屬比CK低34.7%，但差異不顯著。各處理間鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）均無顯著差異（表5）。

表5 氮磷鉀代謝相關(guān)菌屬對生物炭處理的響應(yīng)

2.3.5 RDA冗余分析

RDA冗余分析圖直觀地給出環(huán)境因子對研究對象的解釋程度，影響因素之間的夾角代表各因素之間的相關(guān)性大小，其中銳角表示兩個因素正相關(guān)，直角表示不相關(guān)，鈍角表示負(fù)相關(guān)，而射線的長短代表環(huán)境因子對研究對象的解釋度高低，射線越長，解釋度越高；反之越低。由圖4可知，土壤堿解氮（AN）、有機(jī)質(zhì)（OM）、速效鉀（AK）及pH是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵參數(shù)。

圖4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的RDA分析

3 討論

生物炭孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)、表面積大［25］，同時還有很強(qiáng)的吸附性和蓄集能力。唐光木等［26］研究得出，施用生物炭后新疆灰漠土土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著提高。本研究發(fā)現(xiàn)施入生物炭后土壤有機(jī)質(zhì)含量增加，一方面，生物炭本身是一種富含有機(jī)碳的物質(zhì)，另一方面，生物炭可以提高土壤對養(yǎng)分的吸持能力。本研究還發(fā)現(xiàn)，施用生物炭后土壤容重和pH呈下降趨勢，可能與生物炭疏松多孔及灰漠土鹽基飽和度較高有關(guān)。

磷、鉀元素作為植物生長必須的營養(yǎng)元素，在土壤中主要以難溶性和礦化態(tài)形式存在［27］，Vanek等［28］研究得出，施入土壤中的磷大部分以難溶態(tài)形式存在，植物難以吸收利用。21世紀(jì)初，余海英等［29］調(diào)查山東壽光設(shè)施蔬菜地養(yǎng)分用量時發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)每年隨化肥投入的磷、鉀養(yǎng)分各占養(yǎng)分總量的61%和66%，然而磷、鉀養(yǎng)分的利用率僅為8%和46%。本試驗(yàn)研究得出，施入生物炭后，與CK相比，HA、HB、JB處理不同程度的提高了與磷、鉀代謝相關(guān)菌屬節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的菌群數(shù)量，也提高了土壤有效磷、速效鉀的含量。說明解磷、解鉀菌數(shù)量上升可以將土壤固定態(tài)磷、鉀分解轉(zhuǎn)化為作物可直接吸收利用的有效磷、鉀。堿解氮含量表現(xiàn)為HB>HA>CK>JB>JA，混施處理優(yōu)于穴施處理，且生物炭含量越高效果越佳，這與王衛(wèi)民等［30］的研究結(jié)果不一致，可能是不同的原材料和制備條件產(chǎn)生了不同種類的生物炭［31］，也可能是生物炭施加濃度、土壤理化性質(zhì)及植物種類不同。

生物炭具有吸附性，既能夠吸附反應(yīng)底物促進(jìn)酶促反應(yīng)，提高酶活性；也能夠吸附保護(hù)酶促反應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)，抑制酶促反應(yīng)，降低酶活性［32］。本研究發(fā)現(xiàn)施加生物炭顯著提高了土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性，與本研究結(jié)果相似，顧美英等［33］研究表明沙土中施加生物炭后土壤蔗糖酶、過氧化氫酶活性顯著提高，可能是因?yàn)樯锾康奶砑犹岣吡送寥烙袡C(jī)質(zhì)，既為微生物活動提供了能源物質(zhì)，也為酶促反應(yīng)提供了豐富的底物，從而提高了土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性。脲酶活性變化與硝化螺旋菌屬變化相似，JB處理下脲酶活性和硝化螺旋菌屬數(shù)量最高，HB處理下兩者最低，土壤酶作為土壤微生物的代謝產(chǎn)物，隨土壤微生物的變化而變化，生物炭的施用方式影響了它在土層中的空間分布，混施處理下土壤保水性好，通氣性差，從而使硝化螺旋菌屬（Nitrospira）作為一類好養(yǎng)細(xì)菌在穴施處理下高于混施處理。

有研究表明生物炭的多孔性及對水肥的吸附性為微生物的生長與繁殖創(chuàng)造了良好的環(huán)境［34］。Shannon指數(shù)用來描述細(xì)菌群落的多樣性，而Chao1和ACE指數(shù)用來估計細(xì)菌群落中物種的豐富度。本研究得出，只有JA處理chao1和ACE指數(shù)顯著低于CK處理，其余處理chao1、ACE和shannon指數(shù)與CK相比均無顯著差異，但在同一施用方式下Chao1、ACE指數(shù)隨生物炭施用量的增加而增加，高量生物炭具有更多的表面功能基團(tuán)可以有效吸附易礦化有機(jī)碳和NH4+，為微生物提供充足的食物來源，促進(jìn)微生物豐度的增加［35］。韓光明［36］研究得出添加生物炭提高了灰漠土土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)多樣性。本研究進(jìn)行NMDS分析及UPGMA聚類分析得出，CK與JA、JB間的相似性高于CK與HA、HB間的相似性，說明生物炭混施可較大程度地改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，可能是由于混施條件下，土壤保水性好，影響了土壤的透氣性，使得一些厭氧微生物滋生，由于土壤細(xì)菌種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具體原因有待進(jìn)一步研究。

細(xì)菌作為土壤中數(shù)量最多的微生物類群，能夠及時感知土壤養(yǎng)分、pH等外界條件的變化，從而反映土壤質(zhì)量的變化［37］。施加生物炭可以引起土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并且細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤pH及養(yǎng)分顯著相關(guān)［9，38］。本研究發(fā)現(xiàn)土壤堿解氮、有機(jī)質(zhì)、速效鉀及pH與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)，是土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要控制因子。

4 結(jié)論

施加生物炭增加了土壤有機(jī)質(zhì)、有效磷、速效鉀含量及蔗糖酶、過氧化氫酶活性，降低了土壤容重和pH。綜合比較生物炭施用方式和施用量得出，HB（混施5%生物炭）處理土壤有機(jī)質(zhì)和速效養(yǎng)分（堿解氮、有效磷、速效鉀）含量及蔗糖酶、過氧化氫酶活性不同程度的高于其它處理。HB處理可以提高土壤細(xì)菌豐度，但對多樣性影響較小。硝化螺旋菌屬在穴施處理下菌群數(shù)量高于混施處理，而節(jié)細(xì)菌屬和假單胞菌屬菌群數(shù)量均表現(xiàn)出混施處理高于穴施處理。UPGMA聚類分析及RDA冗余分析表明混施生物炭后根際土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生較為明顯的變化，土壤堿解氮、有機(jī)質(zhì)、速效鉀及pH與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)。