武國(guó)平，馬光躍，陳紅玉，楊俊強(qiáng)，申仲妹

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太原030031）

棗樹(shù)是原產(chǎn)于我國(guó)的特有果樹(shù)，不僅是干、鮮兼用果樹(shù)樹(shù)種，更是重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)和藥用植物樹(shù)種。山西省是棗樹(shù)資源大省，栽培歷史悠久，全省93 個(gè)區(qū)、縣均有棗樹(shù)分布，品種資源豐富，地方品種達(dá)100 多個(gè)[1]，但主栽品種僅有10 多個(gè)，特別是產(chǎn)區(qū)品種存在單一、有同質(zhì)化的趨勢(shì)，給棗樹(shù)種質(zhì)資源的保存、改良及育種帶來(lái)極大不利，危害著山西棗樹(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。因此，利用分子生物學(xué)手段，從分子水平研究山西主要栽培棗樹(shù)品種（系）的遺傳多樣性及相對(duì)親緣關(guān)系非常必要，為栽培棗種質(zhì)創(chuàng)新及品種選育提供理論依據(jù)。

目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者先后采用 RAPD[4-6]、SSR[7]、ISSR[8-9]和AFLP[10-11]技術(shù)在棗樹(shù)品種（系）的遺傳關(guān)系方面進(jìn)行研究，初步報(bào)道了棗樹(shù)群體的遺傳多樣性，但是關(guān)于山西主要栽培棗樹(shù)品種親緣關(guān)系的分析鮮有報(bào)道。SSR 標(biāo)記具有多態(tài)性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單和共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，覆蓋整個(gè)基因組[12]，被廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究。

本研究利用20 對(duì)多態(tài)性高的SSR 引物分析了37 個(gè)山西主要栽培棗品種（系）的親緣關(guān)系，旨在明確其間的遺傳差異及親緣關(guān)系，以期為山西主要栽培棗樹(shù)品種（系）鑒定和育種改良提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的37 個(gè)棗樹(shù)品種（系）（表1），分別于2018 年9 月9 日至9 月13 日在山西省臨猗縣、稷山縣、萬(wàn)榮縣、永和縣、柳林縣及山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所國(guó)家棗種質(zhì)資源圃采集。采集供試品種新梢頂部嫩葉，隨即放入盛有干燥硅膠的自封塑料袋中，置于車載冰箱中，當(dāng)晚保存于-30 ℃冰箱待用。

表1 供試品種來(lái)源及編號(hào)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 棗基因組DNA 的提取與檢測(cè) 利用液氮將葉片樣進(jìn)行充分研磨后，使用TIANGEN 公司的植物基因組DNA 提取試劑盒對(duì)棗葉片樣進(jìn)行DNA的提取。棗樣品DNA 提取結(jié)束后，檢測(cè)其濃度及質(zhì)量：一是利用核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)棗DNA 濃度進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定其 A260、A280、A230、A260/A280和 A260/A230的數(shù)值；二是通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳，測(cè)定棗樹(shù)樣品DNA 的質(zhì)量。

1.2.2 棗SSR 引物篩選 通過(guò)閱讀相關(guān)文獻(xiàn)，并自行設(shè)計(jì)EST-SSR 引物，從中篩選出多態(tài)性較高、重復(fù)性好的棗SSR 引物，獲取其引物序列，并由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。先選取棗8 個(gè)樣品DNA 為材料（編號(hào) 1、2、3、5、8、10、12），對(duì)所有合成的50 對(duì)棗SSR 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增篩選，PCR 擴(kuò)增體系是在10 μL 反應(yīng)混合物中進(jìn)行，其中包括1 μL 10×buffer 緩沖液，0.2 mmol/L dNTPs，0.4 mmol/L 引物，10 U/μL Taq-DNA 聚合酶，1 μL 模板 DNA，加入雙蒸餾水6.7 μL，最終獲得10 μL 體積的混合物。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性40 s，53～58 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 40 s，擴(kuò)增循環(huán)35 次后72 ℃延長(zhǎng)8 min。然后，在4 ℃下對(duì)樣本進(jìn)行維護(hù)。得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物后，在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳下進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 毛細(xì)管電泳試驗(yàn) 對(duì)所選的樣品進(jìn)行SSRPCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用Fragment AnalyzerTM全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Flexibin 程序修正后轉(zhuǎn)化成0，1 格式，建立原始矩陣[13]。SSR 引物位點(diǎn)多態(tài)性信息量PIC（Polymorphism information content）按公式（1）計(jì)算。

式中，PIC 表示位點(diǎn) i 的 PIC 值，Pij表示位點(diǎn) i的第j 個(gè)等位位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率。

材料之間遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity，GS）按NEI 等[14]的方法計(jì)算。采用POPGENE 1.32 軟件對(duì)各遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，并用UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 的提取及電泳檢測(cè)結(jié)果

對(duì)1、2 號(hào)等11 個(gè)樣品所提取的棗基因組DNA通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)（圖1），DNA 條帶清晰、明亮，說(shuō)明DNA 完整性較好，對(duì)不符合要求的樣品進(jìn)行第2 次重提。提取后利用核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)提取的DNA 純度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，100%的棗DNA 的 A260/A280值在 1.7～2.0，DNA 純度較好。

2.2 SSR 引物篩選結(jié)果

選取棗 8 個(gè)樣品 DNA 為材料（編號(hào) 1、2、3、5、8、10、12），對(duì)所合成的 50 對(duì)棗 SSR 引物進(jìn)行篩選，引物篩選部分結(jié)果如圖2 所示。經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增，最優(yōu)選出20 對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富的引物（表2）用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2 20 對(duì)棗SSR 引物信息

2.3 SSR 標(biāo)記的多態(tài)性分析

利用20 對(duì)SSR 引物對(duì)37 個(gè)棗樹(shù)品種（系）進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示（表3），檢測(cè)到375 個(gè)等位基因變異，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到等位變異數(shù)為18.75 個(gè)，變化范圍為11～31 個(gè)，位點(diǎn)多態(tài)性信息含量PIC 變化范圍為0.719～0.967，平均為0.913。以上數(shù)據(jù)表明，取自山西的37 個(gè)栽培棗樹(shù)品種（系）遺傳多樣性豐富。

2.4 供試棗樹(shù)的UPGMA 聚類分析

37 個(gè)栽培棗樹(shù)品種（系）的遺傳相似系數(shù)（GS）變幅為 0.795～0.917，平均 GS 值為 0.852。10 號(hào)（普通贊皇）和38 號(hào)（北京白棗）的GS 值最小，均為0.795，19 號(hào)（晉園晚紅）和 21 號(hào)（晉抗裂 4 號(hào)）的GS 值最大，均為 0.917。

以37 個(gè)栽培棗樹(shù)品種（系）的遺傳相似度為基礎(chǔ)，利用NTsys2.0 軟件，采用UPG2.4 聚類結(jié)果MA方法對(duì)其進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示（圖3），供試品種（系）在0.82～0.95 范圍內(nèi)聚類，在0.83 處分為兩大類，其中，第Ⅰ類在相似系數(shù)0.86 處又可分成9 個(gè)亞類，第Ⅰ亞類含有15 個(gè)品種，分別為1 號(hào)（抗裂條棗）、7 號(hào)（蒲城晉棗）、8 號(hào)（保德油棗）、2 號(hào)（晉抗裂 5 號(hào)）、6 號(hào)（中陽(yáng)木棗）、15 號(hào)（臨黃 1 號(hào)）、19 號(hào)（晉園晚紅）、26 號(hào)（永和普通條棗）、21 號(hào)（晉抗裂4 號(hào)）、27 號(hào)（晉園紅棗瘋病）、29 號(hào)（永和大條棗）、28 號(hào)（晉園紅）、10 號(hào)（贊皇大棗）、12 號(hào)（相棗）、30 號(hào)（晉抗裂3 號(hào)），第Ⅱ亞類含有45 號(hào)（婆婆棗）1 個(gè)品種，第Ⅲ亞類含有3 個(gè)品種，分別為16 號(hào)（佳縣脆木棗）、18 號(hào)（屯屯棗）、22 號(hào)（柳林木棗），第Ⅳ亞類含有3 個(gè)品種，分別為3 號(hào)（抗裂贊皇）、9 號(hào)（雞心酸棗）、5 號(hào)（板棗（大果）），第 V 亞類含有4 號(hào)（抗裂板棗）和 11 號(hào)（狗頭棗）2 個(gè)品種，第 VI亞類含有 13 號(hào)（稷山板棗）、14 號(hào)（俊棗）2 個(gè)品種，第 VII 亞類含有 31 號(hào)（蟠桃棗）1 個(gè)品種，第 VIII 亞類含有 32 號(hào)（冬棗）、46 號(hào)（晉冬棗）2 個(gè)品種，第VIIII 亞類含有35 號(hào)（團(tuán)棗）1 個(gè)品種；第Ⅱ類含有7 個(gè)品種，分別為 33 號(hào)（宮棗）、38 號(hào)（北京白棗）、34 號(hào)（芒果冬棗）、37 號(hào)（冷白玉）、39 號(hào)（駿棗）、40 號(hào)（壺瓶棗）、36 號(hào)（官灘棗）。

表3 20 對(duì)SSR 引物等位變異數(shù)和PIC 值

3 結(jié)論與討論

SSR 標(biāo)記在研究不同材料親緣關(guān)系、遺傳多樣性及其種質(zhì)資源保護(hù)上具有很大的潛力，在棗樹(shù)及其他作物育種中已得到廣泛應(yīng)用，并得到可靠的研究成果[15-18]。麻利穎等[19]利用12 對(duì)SSR 引物對(duì)36個(gè)棗品種進(jìn)行分析，PIC 值變幅為0.62～0.85，平均為0.75。喇菲菲等[20]利用11 對(duì)SSR 引物對(duì)84 個(gè)棗品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)到37 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，PIC 值變幅為0.19～0.67，平均為0.48。劉秀云等[21]利用從64 對(duì)SSR 引物中篩選出23 對(duì)高效率SSR 引物，在供試材料中共檢測(cè)出117 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，PIC 值變幅為0.359～0.727，平均為0.548。通過(guò)比較位點(diǎn)多態(tài)性信息含量PIC 值指標(biāo)，可以提出更加適宜栽培棗品種（系）SSR 分析的引物，對(duì)其遺傳多樣性分析提供理論依據(jù)，對(duì)于經(jīng)濟(jì)有效和快速進(jìn)行棗樹(shù)的分子生物學(xué)分析具有一定的指導(dǎo)意義[22]。本研究結(jié)果顯示，20 對(duì)SSR 引物所揭示的37 個(gè)山西主要栽培棗樹(shù)品種（系）等位變異數(shù)變化范圍為11～31 個(gè)，平均為18.75 個(gè)，位點(diǎn)多態(tài)性信息含量PIC 變化范圍為0.719～0.967，平均為0.913。表明，本研究從50 對(duì)SSR 標(biāo)記中篩選到的20 對(duì)SSR 標(biāo)記適宜于對(duì)栽培棗樹(shù)品種（系）的遺傳多樣性分析，能對(duì)學(xué)者們開(kāi)展相關(guān)研究給予一定的參考。

本試驗(yàn)利用SSR 分子標(biāo)記對(duì)山西主要棗樹(shù)栽培品種的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，37 個(gè)棗樹(shù)品種（系）的遺傳相似系數(shù)（GS）變幅為0.795～0.917，平均GS 值為0.852，在相似系數(shù)0.83 處可將供試品種（系）聚為2 大類，第Ⅰ類在相似系數(shù)0.86 處又可分為9 個(gè)亞類。說(shuō)明山西主要棗樹(shù)栽培品種存在地區(qū)同質(zhì)化現(xiàn)象，這也反映了在棗樹(shù)育種中的突出問(wèn)題，一方面需要根據(jù)育種目標(biāo)充分選擇利用種質(zhì)資源，選用遺傳距離比較遠(yuǎn)的親本進(jìn)行雜交；另一方面應(yīng)注重將繁多的棗樹(shù)品種進(jìn)行引種收集，分類鑒定，注重棗樹(shù)資源保護(hù)。