董學(xué)妍,滕曉晶, 王智毅,王賢軍,余道軍

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 浙江 杭州 310006; 2.杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 浙江 杭州 310008)

胃癌的發(fā)病率位居惡性腫瘤第2位，嚴(yán)重影響著人類健康[1]。目前，胃癌的臨床治療仍以手術(shù)切除為主，同時(shí)輔以放療和化療。但放化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也常會(huì)對機(jī)體的免疫功能造成一定程度的損傷，免疫功能越低，患者的預(yù)后也越差[2-3]。諸多臨床實(shí)驗(yàn)研究[4-6]顯示，中藥在治療腫瘤、減輕放化療毒副作用、增強(qiáng)患者免疫力等方面都發(fā)揮著巨大的作用。扶正康復(fù)合劑是浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要用于惡性腫瘤的中醫(yī)維持治療。扶正康復(fù)合劑的抗腫瘤作用機(jī)理尚未闡明，因而影響了其市場的拓展和應(yīng)用[7-8]。本研究以胃癌荷瘤裸鼠為模型，探討扶正康復(fù)方對胃癌腫瘤生長的抑制作用及其對細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2017-0005，使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2018-0012。42只SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠4～5周齡，體質(zhì)量18～22 g，飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境中。胃癌SGC7901細(xì)胞株購于中科院上海富恒細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑 扶正康復(fù)合劑由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院中藥房提供。每貼生藥用9倍質(zhì)量的水煎煮提取3次，每次1 h，最后成約180 mL藥液。順鉑注射液購于南京制藥有限公司(006013CF)，小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒購于上海信裕生物有限公司。

1.3 胃癌SGC7901移植性裸鼠建模和分組 BALB/c裸鼠適應(yīng)性生長3 d后，按裸鼠體質(zhì)量大小順序編號(hào)，采用隨機(jī)化工具將裸鼠分成6組，每組7只，分別為模型組、扶正低劑量組[12 g/(kg·d)]、扶正高劑量組[24 g/(kg·d)]、順鉑組[2 mg/(kg·d)]、聯(lián)合用藥低劑量組[順鉑2 mg/(kg·d)+扶正康復(fù)合劑12 g/(kg·d)]、聯(lián)合用藥高劑量組[順鉑2 mg/(kg·d)+扶正康復(fù)合劑24 g/(kg·d)]。將0.2 mL(含細(xì)胞數(shù)1×106個(gè))胃癌SGC7901細(xì)胞株懸液注射入各組裸鼠左下肢外側(cè)皮下，待皮下腫瘤生長至1 cm×1 cm大小為胃癌SGC7901荷瘤裸鼠建模成功。

1.4 給藥方式 依照《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[9]的動(dòng)物用藥劑量公式計(jì)算扶正低劑量組、扶正高劑量組的用藥劑量分別為12 g/(kg·d)和24 g/(kg·d)，給予7 d 0.4 mL/d灌胃。順鉑組給予0.2 mL/d腹腔注射，共注射7 d。模型組給予生理鹽水灌胃。

1.5 裸鼠體質(zhì)量、腫瘤組織質(zhì)量及抑瘤率計(jì)算 各組裸鼠于給藥7 d后采血并剝離腫瘤組織，稱體質(zhì)量和腫瘤組織質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率(%)=(對照組平均腫瘤組織質(zhì)量—實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤組織質(zhì)量)/對照組平均腫瘤組織質(zhì)量×100%。

1.6 TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-6水平檢測 對各組裸鼠進(jìn)行眼球取血，1.5 mL全血經(jīng)3 600 r/min離心15 min，離心半徑為13.5 cm，取血清。采用雙抗體夾心ELISA法檢測各組裸鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6水平，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對腫瘤生長的影響 順鉑組、扶正高劑量組、聯(lián)合用藥低劑量組、聯(lián)合用藥高劑量組的腫瘤組織質(zhì)量均低于模型組，聯(lián)合用藥高劑量組的腫瘤組織質(zhì)量低于順鉑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其抑瘤率為57.78%。見表1。

表1 各組裸鼠腫瘤生長情況

2.2 對TNF-α、IFNγ、IL-2、IL-6水平的影響 順鉑組裸鼠血清中免疫相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6水平均低于模型組，聯(lián)合用藥低劑量組和高劑量組裸鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6水平均高于順鉑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組裸鼠血清TNF-α、IFNγ、IL-2、IL-6水平

3 討論

中醫(yī)藥治療可提高腫瘤患者免疫功能，改善臨床癥狀。胃癌主要表現(xiàn)為脾胃虧損，中醫(yī)對胃癌的治療遵循扶正培本的原則[10]。扶正康復(fù)合劑的主要成分為人參、石斛、茯苓、豬苓、白術(shù)、防風(fēng)、米仁、巴戟天、谷麥芽等15味中藥，具有大補(bǔ)元?dú)?、滋養(yǎng)陰津、補(bǔ)脾益胃等功效，是浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院治療腫瘤的臨床經(jīng)驗(yàn)方。順鉑在胃癌、睪丸癌、卵巢癌、子宮癌、膀胱癌、頸部癌、前列腺癌、腦癌等多種腫瘤的治療中表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。但使用順鉑治療常會(huì)出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制現(xiàn)象、脫發(fā)、色素沉淀等不良反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥高劑量組的腫瘤組織質(zhì)量明顯低于順鉑組，抑瘤率為57.78%，提示扶正康復(fù)合劑聯(lián)合順鉑治療可抑制腫瘤生長，抑瘤效果優(yōu)于單獨(dú)使用順鉑。扶正康復(fù)合劑中人參的主要成分為人參皂苷，人參皂苷具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用，人參皂苷Rh2的劑量與抑制胃癌SGC7901細(xì)胞增殖成正相關(guān)[11]；扶正康復(fù)合劑中的石斛可起到抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等多種功能[12-13]。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮著重要的免疫監(jiān)視作用。當(dāng)宿主免疫功能低下或受抑制時(shí)，腫瘤的發(fā)生明顯增加。同時(shí)，腫瘤的產(chǎn)生對機(jī)體免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生一定抑制作用。研究[14-15]表明，免疫細(xì)胞Th1/Th2失調(diào)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫和遲發(fā)性超敏性炎癥反應(yīng)；Th2主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，參與體液免疫應(yīng)答[16-17]。正常生理情況下，Th1和Th2處于動(dòng)態(tài)平衡，維護(hù)機(jī)體正常的細(xì)胞免疫和體液免疫。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，Th1和Th2功能發(fā)生紊亂[18]。本研究結(jié)果顯示，順鉑組裸鼠血清中免疫相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6水平均明顯低于模型組，表明順鉑可對機(jī)體免疫功能造成一定的損傷。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥低劑量組、聯(lián)合用藥高劑量組裸鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6水平均明顯高于順鉑組，表明扶正康復(fù)合劑可影響裸鼠分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6免疫相關(guān)細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用。有研究[19]顯示，人參多糖增強(qiáng)機(jī)體免疫水平的功效是通過提高IL-2、IL-8 和TNF-α水平實(shí)現(xiàn)的。另有報(bào)道[20]指出，茯苓能明顯抑制小鼠H22 實(shí)體瘤和肉瘤細(xì)胞的生長，提高T淋巴細(xì)胞的增殖能力，增加血清中TNF-α的含量，發(fā)揮機(jī)體的抗腫瘤能力和免疫調(diào)節(jié)作用。人參和茯苓是扶正康復(fù)合劑中的主要成分，扶正康復(fù)合劑增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的功效可能與人參和茯苓有關(guān)。

綜上所述，扶正康復(fù)合劑能抑制胃癌SGC7901細(xì)胞荷瘤裸鼠腫瘤的生長，能促進(jìn)裸鼠分泌免疫相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6。