鄧惜緣，劉麗元，周子航，溫 萬(wàn)，高旭紅，顧亞玲

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏畜牧站，銀川 750004）

荷斯坦奶牛原產(chǎn)于荷蘭，為一種風(fēng)土馴化能力極強(qiáng)的品種，適應(yīng)性強(qiáng)、體型大、產(chǎn)奶量高，是我國(guó)存欄量最多品種，全年平均產(chǎn)乳量超7 000 kg。我國(guó)荷斯坦奶牛又分為乳用型荷斯坦奶牛和兼用型荷斯坦奶牛。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體家族（Fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）包括5 個(gè)基因，其中FGFR1、FGFR2、FGFR3 和FGFR4，為跨膜酪氨酸激酶受體，其胞外區(qū)具有2 或3 個(gè)免疫球蛋白（Ig）樣結(jié)構(gòu)域，而FGFR5 缺乏細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域被一個(gè)短的富含組氨酸基序的胞內(nèi)尾部取代[1]。FGFR2 全稱為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2，位于奶牛第26 號(hào)染色體，全長(zhǎng)107 412 bp，具有不同亞型，在上皮細(xì)胞中編碼FGFR2b 亞型，在間質(zhì)細(xì)胞中編碼FGFR2c 亞型。FGFR2 基因分別結(jié)合不同F(xiàn)GF 激活信號(hào)通路，介導(dǎo)FGFs 信號(hào)傳遞入細(xì)胞質(zhì)，為b FGF 最主要受體。b FGF與其結(jié)合后可激活細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）和磷脂酰肌醇-3 激酶和蛋白激酶B（PI3K/AKT）等信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種起源于中胚層、神經(jīng)外胚層的細(xì)胞分化增殖，還參與機(jī)體多種生理病理學(xué)過(guò)程（如胚胎發(fā)育、組織愈合、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移）[2]。Cunningham 等最新研究擴(kuò)展FGF 信號(hào)已知領(lǐng)域，并為功能研究確定許多新靶點(diǎn)[3]。FGF信號(hào)通路結(jié)構(gòu)靈活，在典型的RAF/MAPK/ERK/RSK和PI3K/AKT/PDK/mTOR/S6K 通 路 中，F(xiàn)GFR2 激 酶活性抑制反應(yīng)被識(shí)別。同時(shí)觀察到磷酸化依賴性負(fù)反饋途徑被抑制，定義FGFR2 抑制的內(nèi)在抗性機(jī)制。該發(fā)現(xiàn)對(duì)FGFR 抑制劑治療應(yīng)用有指導(dǎo)意義，因FGFR抑制劑識(shí)別具有相同遺傳損傷和耐藥途徑細(xì)胞的反應(yīng)。

本課題組以寧夏地區(qū)1 280頭荷斯坦母牛為研究對(duì)象，利用Illumina 牛150K Bovine 全基因組SNP 芯片作基因分型，對(duì)5 個(gè)泌乳性狀（產(chǎn)奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量）與體細(xì)胞評(píng)分，運(yùn)用Farm CPU 統(tǒng)計(jì)方法作全基因組關(guān)聯(lián)分析[4]。在奶牛第26號(hào)染色體上存在P值4.68×10-8且名為ARS-BFGL-NGS-106897 的SNP 位點(diǎn)與奶牛體細(xì)胞數(shù)有關(guān)，與其相距30 kb即41 956 121 bp存在FGFR2基因且最小等位基因頻率為0.55。通過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR2 參與FGF 信號(hào)通路（P00021），也參與多種生物學(xué)過(guò)程，如MAPK 級(jí)聯(lián)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控。因此本研究分析前期GWAS 篩選出的FGFR2 基因不同組織表達(dá)量，再分析荷斯坦奶牛FGFR2 基因生物信息學(xué)，以期為進(jìn)一步研究荷斯坦奶牛FGFR2 基因生物學(xué)功能提供參考，為后期FGFR2 基因功能驗(yàn)證提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

荷斯坦奶牛來(lái)自寧夏回族自治銀川市賀蘭縣茂盛奶牛場(chǎng)，選擇3頭具有相同父本且飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同的荷斯坦奶牛，取屠宰后奶牛組織（肝臟、卵巢、乳腺、腎臟、心臟、子宮），DEPC 水洗凈，液氮速凍后送回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存，備用。

1.1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：LA Taq（DRR02AG）(TaKaRa)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）（艾德來(lái)）；2×SYBR?Green 預(yù)混液（中國(guó)DF）；pcDNA3.1-EGFP-C 載體（優(yōu)寶生物）；DH5α感受態(tài)細(xì)胞（天根）。

主要試驗(yàn)儀器：analytikjena-qTOWER 2.2型熒光定量PCR 儀（德國(guó)）、SCILOGEX D3024R 離心機(jī)（美國(guó)）、普通PCR 儀analytikjena-Easycycler（德國(guó)）、超微量核酸蛋白測(cè)定儀scandrop100（德國(guó)）、移液器（美國(guó)bio-rad）、U-3010 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Hitachi）、凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius）、H6-1微型電泳槽（上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠）、SW-CJ-1D 潔凈工作臺(tái)（上海琪特分析儀器有限公司）、DYY-8 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳（江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠）、PCR 反應(yīng)儀擴(kuò)增儀（加拿大BBI）、YXJ-2 離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

使用Trizol 提取荷斯坦奶牛不同組織總RNA，通過(guò)凝膠電泳試驗(yàn)檢測(cè)提取效果，超微量核酸蛋白測(cè)定儀（scandrop100）檢測(cè)RNA其OD260/OD280值。

采用Aidlab 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）反轉(zhuǎn)錄，采用20 μL 反應(yīng)體系：總RNA 500 ng、5×RT Reaction Mix 4 μL、Rondam primer/oligodT 0.8 μL、 TUREscript HRTase/RI Mix 0.8 μL、RNase Free dH2O 加至20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：42 ℃40 min，65 ℃10 min反應(yīng)結(jié)束后，得到cDNA，-80 ℃保存。

1.2.2 奶牛FGFR2基因克隆

根據(jù)GenBank 中已知牛FGFR2 基因序列（XM_024985484.1）及GADPH 序列（NM_0010 34034.2），利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物，由陜西致研生物科技有限公司合成。

由于CDS 區(qū)序列較長(zhǎng)，分六段擴(kuò)增，由上海生工生物工程股份有限公司合成。具體引物序列如表1所示。

PCR 擴(kuò)增體系（25 μL）：2X GC Buffer I 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）0.2 μL，ddH2O 10.1 μL，Template 1 μL（cDNA）、Taq 酶(5 U·μL-1) 0.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，72 ℃修復(fù)延伸7 min，循環(huán)33次。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，特異性好擴(kuò)增產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱備用。純化后產(chǎn)物通過(guò)TA 克隆將該序列在16 ℃連接至pcDNA3.1-EGFP-C 載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂板于LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，藍(lán)白斑篩選，選擇白色菌落菌液送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 組織表達(dá)差異分析

根據(jù)序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物, 檢測(cè)FGFR2 基因在心臟、肝臟、乳腺、子宮、卵巢和腎臟組織表達(dá)量。反應(yīng)體系（10 μL）：2×SYBR?Green Supermix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序：95 ℃PCR 預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，58 ℃組合延伸30 s，循環(huán)39 次。共設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)以及3 個(gè)技術(shù)學(xué)重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參，利用2-△△Ct計(jì)算各樣品基因相對(duì)表達(dá)量，利用SPASS 22.0 分析荷斯坦奶牛FGFR2基因不同組織表達(dá)量單因素差異。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

基 本BLAST 檢 索（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）；利用Prot-Param 在線軟件分析理化性質(zhì)（http：//web. expasy.org/protparam /）；利用DNAMAN比對(duì)序列；運(yùn)用SignalP 4.1 軟件分析信號(hào)肽（http：//www.ebs.dtu.dk/services/SignalP/）；運(yùn)用ProtScale 軟件分析親疏水性（http：//web.expasy.org /protscale/）；通過(guò)在線軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；保守結(jié)構(gòu)域通過(guò)NCBI 上CDD 預(yù)測(cè)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）；運(yùn)用Psort 軟件分析亞細(xì)胞定位（https：//www.genscript.com/psort.html）；通過(guò)在線軟件Prabi 服務(wù)器SOPMA 程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)在線軟件SWISS-MODEL（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，研究確定FGFR2 蛋白質(zhì)各項(xiàng)生物信息，了解該基因部分功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 FGFR2基因RNA提取與擴(kuò)增及克隆測(cè)序

不同組織RNA 提取后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳效果見(jiàn)圖1，產(chǎn)物用超微量核酸蛋白測(cè)定儀（scandrop100）檢測(cè)RNA OD 值（見(jiàn)表2），可看到明顯的28S與18S條帶，全部符合RNA要求。以荷斯坦奶牛乳腺組織為模板，分六段擴(kuò)增，引物特異性較好，六段目的基因片段長(zhǎng)度符合要求，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2 荷斯坦奶牛FGFR2基因組織表達(dá)分析

目的基因FGFR2擴(kuò)增曲線圖3，圖4為溶解曲線，產(chǎn)物TM 值為80 ℃。內(nèi)參基因GAPDH 為擴(kuò)增曲線圖5，圖6 為溶解曲線，產(chǎn)物TM 值為83 ℃。綜合溶解曲線與擴(kuò)增曲線圖，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

表2 不同組織RNA提取濃度與純度檢驗(yàn)Table 2 Test of RNA extraction concentration and purity in different tissues

以GAPDH為內(nèi)參，利用2-△△Ct計(jì)算各樣品基因相對(duì)表達(dá)量，利用SPSS 25.0 一般線性模型（GLM）作平均值下單因素方差分析，Duncan's多重檢驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺組織FGFR2 基因mRNA 表達(dá)量最高，并極顯著高于肝臟、卵巢、子宮和心臟，與腎臟組織mRNA表達(dá)量差異不顯著（見(jiàn)圖7）。

2.3 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白理化性質(zhì)分析

ProtParam 在線服務(wù)器分析結(jié)果如圖8 和表3所示，奶牛FGFR2 基因編碼790 個(gè)氨基酸，20 種氨基酸中亮氨酸（Leu）數(shù)目最多，共64 個(gè)，占全部氨基酸8.1%。負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為100，正電荷殘基（Arg + Lys）總數(shù)為89，分子式為C3923H6159N1067O1190S44，相對(duì)分子質(zhì)量為12 383。半衰期為30 h，脂肪指數(shù)為78.71，親水性平均值為-0.409。基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定指數(shù)為46.09，顯示編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定。

表3 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of FGFR2 protein in Holstein cows

2.4 荷斯坦奶牛FGFR2基因序列相似性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用Meg Align 軟件將克隆得到的荷斯坦奶牛FGFR2 基因序列與家貓、黃牛、家雞、獼猴、黑猩猩、野豬、家犬、綿羊、熱帶爪蟾、蘇門(mén)答臘猩猩基因序列作相似性比對(duì)，其中荷斯坦奶牛與黃牛序列相似性高達(dá)100%，與熱帶爪蟾相似性最低為67.2%（見(jiàn)表4）?；赥amura-Nei 模型最大似然法推導(dǎo)進(jìn)化樹(shù)模型，選擇具有最高對(duì)數(shù)可行性的樹(shù)（-6 150.52），將Neighbor-Join 和BioNJ算法應(yīng)用于最大復(fù)合似然（MCL）方法估計(jì)成對(duì)距離矩陣，選擇具有優(yōu)越對(duì)數(shù)似然值拓?fù)?，最后獲得用于啟發(fā)式搜索的初始樹(shù)。分析涉及10 個(gè)核苷酸序列，所有包含空白和缺失數(shù)據(jù)的位置均刪除，所有進(jìn)化分析在MEGA7.0 中完成，結(jié)果顯示荷斯坦奶牛與黃牛親緣性最近，其次為野豬；而與熱帶爪蟾較低等脊椎動(dòng)物相距最遠(yuǎn)（見(jiàn)圖9）。

2.5 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白疏水性分析

運(yùn)用ExPASy 服務(wù)器中ProtScale 程序分析奶牛FGFR2 蛋白親疏水性發(fā)現(xiàn)，第358 位丙氨酸（Ala）疏水性最強(qiáng)為3.211，第167 位賴氨酸（Lys）疏水性最弱為-2.622，在負(fù)值區(qū)域有較多氨基酸（見(jiàn)圖10）。

表4 荷斯坦奶牛與其他10 個(gè)物種FGFR2基因序列相似性比對(duì)Table 4 Sequence similarity comparison of FGFR2 gene between Holstein cows and other 10 species

2.6 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及信號(hào)肽分析

運(yùn)用TMHMM 2.0 分析奶牛FGFR2 基因蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖11 所示。結(jié)果表明，F(xiàn)GFR2 蛋白存在1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，位于第344～366 氨基酸殘基之間。使用SignaIP 4.1在線軟件預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽發(fā)現(xiàn)，編碼產(chǎn)物C 值為0.112，Y 值為0.107，S 值為0.116，荷斯坦奶牛FGFR2 蛋白不具有信號(hào)肽（見(jiàn)圖12）。結(jié)合軟件SecretomeP2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）分 析， 得 到SecP score分?jǐn)?shù)高于0.6，則荷斯坦奶牛FGFR2基因編碼蛋白屬于非經(jīng)典分泌蛋白。

2.7 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

由圖13 可知，α-螺旋占23.80%，β-轉(zhuǎn)角占4.18%，無(wú)規(guī)則卷曲占51.27%， 延伸鏈占20.76%。由此推測(cè)，無(wú)規(guī)卷曲為荷斯坦奶牛FGFR2 最大量二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈散布其中。由圖14可知，F(xiàn)GFR2蛋白以無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋為主，與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析一致。

2.8 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白亞細(xì)胞定位分析

運(yùn)用PSORTⅡ預(yù)測(cè)FGFR2 編碼產(chǎn)物亞細(xì)胞分布情況：細(xì)胞質(zhì)21.7%，細(xì)胞核43.5%，線粒體17.4%，質(zhì)膜4.3%，液泡4.3%，過(guò)氧化物酶體4.3%，分泌系統(tǒng)小泡4.3%。

2.9 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

運(yùn)用NCBI 的CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)荷斯坦奶牛FGFR2 蛋白保守結(jié)構(gòu)域。如圖15 所示，荷斯坦奶牛FGFR2蛋白有3個(gè)特定匹配和2個(gè)匹配的超家族保守結(jié)構(gòu)域。

3 討 論

FGFR2 基因已確定與胃癌[5-6]、乳腺癌[7-8]、和膽管癌[9]等多種癌癥密切相關(guān)，且Pemazyre 治療FGFR2 基因融合型膽管癌已獲得美國(guó)FDA 首批認(rèn)證[10-12]。在骨骼發(fā)育過(guò)程中, FGFR2 基因可調(diào)節(jié)位于軟骨膜、骨膜和顱縫處前骨生成細(xì)胞和骨生成細(xì)胞增生和分化[13]。Brajadenta 等研究發(fā)現(xiàn)FGFR2基因中至少有7 個(gè)突變引起Apert（尖頭并指綜合征）綜合征[14]。Kim 等研究發(fā)現(xiàn)FGFR2 信號(hào)為導(dǎo)致面中部前后向空間異常關(guān)鍵因素，研究結(jié)果為預(yù)防FGFR2基因突變引起的顱面畸形提供新療法[15]。為證明FGFR2 主要影響軟骨細(xì)胞增生和分化，尹良軍等應(yīng)用基因敲入技術(shù)建立FGFR2 功能獲得型基因突變小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)FGFR2 不僅具有調(diào)控成骨細(xì)胞系發(fā)育功能，還具有調(diào)控軟骨細(xì)胞系發(fā)育重要功能，從而同時(shí)影響膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨，在骨骼發(fā)育、骨折修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用[16]。可知FGFR2在調(diào)節(jié)骨相關(guān)生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮作用。

分析克隆的荷斯坦奶牛FGFR2 基因序列發(fā)現(xiàn)，該基因CDS 區(qū)序列長(zhǎng)2 372 bp，編碼790 個(gè)氨基酸，其中亮氨酸含量最多，亮氨酸增加蛋白質(zhì)合成，抑制蛋白質(zhì)分解。亮氨酸代謝產(chǎn)物α- 酮戊己酸（α-KIC）和β- 羥基-β- 甲基丁酸（HMB）具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝作用。帶負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）大于帶正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys），故FGFR2基因編碼蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷， 其不穩(wěn)定指數(shù)為46.09，為不穩(wěn)定蛋白，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。由于具有跨膜結(jié)構(gòu)但無(wú)信號(hào)肽，則推測(cè)為非經(jīng)典分泌蛋白，與FGF2分泌途徑：由質(zhì)膜直接易位介導(dǎo)，依賴于質(zhì)膜內(nèi)磷脂酰肌醇（4,5）二磷酸和質(zhì)膜外層的硫酸乙酰肝素蛋白多糖結(jié)論一致[17-18]。

畢艷楠等研究發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)小鼠乳腺組織中FGFR2 表達(dá)量顯著升高[19]，表明FGFR2 基因與奶牛乳腺纖維化分子作用機(jī)制關(guān)系密切，與前期GWAS 篩選結(jié)果一致，且與不同組織表達(dá)差異分析得出乳腺組織表達(dá)量最高結(jié)果也一致。王澤鑫等通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TOPO-FGFR2 真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)入人膽管癌Hucct1 和HEK293T 細(xì)胞，在細(xì)胞水平驗(yàn)證FGFR2基因過(guò)表達(dá)具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用，與GWAS 結(jié)論相符[20]。同時(shí)，畢艷楠等發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR2與bFGF共同作用促進(jìn)奶牛乳腺成纖維細(xì)胞中PI3K 和Akt mRNA和蛋白表達(dá)[21]。

基于前期GWAS 及不同組織差異分析得出乳腺組織相對(duì)表達(dá)量高的結(jié)果，再結(jié)合其他學(xué)者研究可推斷荷斯坦奶牛FGFR2 基因具有促進(jìn)乳腺細(xì)胞生長(zhǎng)作用，后期將開(kāi)展細(xì)胞水平功能驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆荷斯坦奶牛FGFR2基因, 得到2 373 bp 的CDS 區(qū)序列，編碼790 個(gè)氨基酸殘基；生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR2 蛋白為非經(jīng)典分泌蛋白，編碼產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞核；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，荷斯坦奶牛FGFR2 基因在乳腺組織中相對(duì)表達(dá)量最高。研究結(jié)果為荷斯坦奶牛FGFR2 基因在奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究提供理論依據(jù)。