吳長(zhǎng)昊， 李紅俠， 王 靜， 杜一鳴， 張瑞芳

(1.宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000;2.宿州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽 宿州 234000)

0 引 言

谷氨酸(Glutamate)，又稱麩氨酸，是一種酸性氨基酸[1]，尤其在谷類蛋白質(zhì)中，存在著大量的谷氨酸[2]，谷氨酸與蛋白質(zhì)代謝有關(guān)。谷氨酸具有神經(jīng)毒性[3]，谷氨酸可以通過(guò)與其神經(jīng)細(xì)胞結(jié)合，致使神經(jīng)元損傷[4]，從而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。谷氨酸促成了鈉離子、氯離子以及鈣離子大幅度的內(nèi)流[5]，使神經(jīng)元急性膨脹，致使細(xì)胞損傷[6]。

同樣谷氨酸，會(huì)使Ca2+超載[7]，致使神經(jīng)細(xì)胞壞死。谷氨酸也會(huì)促成自由基發(fā)生[8]，會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成一系列的侵害。谷氨酸屬于神經(jīng)遞質(zhì)中的興奮類型[9]，含量非常高能調(diào)控多種感覺傳入。對(duì)于學(xué)習(xí)和記憶的影響非常大。谷氨酸，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有著嚴(yán)重的破壞作用，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞腫脹和壞死，致使其失去正常功能。

白楊素，是一類具備各種藥理效用的黃酮類化合物[10]。白楊素具有抗氧化[11]、抗不同類型腫瘤[12]、抗癌癥[13]、抗病菌等不錯(cuò)的藥理效用,近來(lái)關(guān)于白楊素的結(jié)構(gòu)修飾受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。例如，新型 7-( 2-羥亞胺-2-苯基) -乙氧基白楊素衍生物[14]，硝基白楊素衍生物以及三唑類白楊素衍生物在腫瘤預(yù)防和治療，癌癥的控制，抑制癌細(xì)胞的遷移[15]，病毒的消除，以及在抗蟲方面都有著顯著的效用。本實(shí)驗(yàn)是以谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞作為模型。并對(duì)白楊素衍生物的神經(jīng)保護(hù)效用進(jìn)行研究，這對(duì)人類各種相關(guān)疾病的治療，是一重大突破。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器、藥品和試劑

1.1.1 細(xì)胞株

SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞 (購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)) 。

1.1.2 藥品和試劑

碘甲烷(晨光生物科技集團(tuán))；白楊黃素(晨光生物科技集團(tuán))；DMEM 培養(yǎng)液、雙抗(江蘇安惠生物科技有限公司)；谷氨酸(購(gòu)于美國(guó)Promega公司)；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽、二甲基亞砜(美國(guó)Promega公司)；過(guò)氧化氫酶試劑盒、丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、總抗氧化能力試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞凋亡測(cè)試試劑盒(購(gòu)于杭州吳鑫生物有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

表1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及廠家

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白楊素衍生物的合成

目標(biāo)化合物的合成路線, 以白楊素為起始原料, 用碘甲烷對(duì) C-7 位的酚羥基進(jìn)行甲基化反應(yīng), 得到中間化合物 ， 中間化合物再與氯磺酸進(jìn)行磺酸化反應(yīng), 得到在 C-8 位含氯磺?；募谆讞钏?甲基化白楊素再以二氯甲烷為溶劑, 與各種芐胺類、苯胺類、脂肪胺類以及雜環(huán)類化合物于-10 ℃條件下反應(yīng)得到白楊素衍生物，即 7-甲氧基-8-(N,N-雙(二乙羥基)-磺酰胺基)-白楊素(后文均以藥物出現(xiàn))

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

(1)細(xì)胞復(fù)蘇

①在超凈工作臺(tái)下，用紫外線滅菌30 min；

②由超低溫的冰箱里慢慢取出存有SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的凍存管，輕輕置于37℃水浴鍋中搖擺，直到冰溶解完全；將凍存管中的溶液吸出來(lái)，取裝有3.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管，將其裝入進(jìn)去，并進(jìn)行離心，1300 r/min，連續(xù)5min。

③將離心管的上層溶液吸去，取1.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液參與，制取細(xì)胞懸濁液；

④將細(xì)胞懸濁液吸出，并放于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，預(yù)備37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。

⑤細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行24h的更換，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

(2)細(xì)胞傳代培養(yǎng)

①觀察SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞瓶里的細(xì)胞，是否在瓶壁內(nèi)側(cè)積累形成致密的單層。

②倒出來(lái)自于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中原本的培養(yǎng)液，剩余的培養(yǎng)液，可用移液槍除去；

③加入1.5 mLPBS緩沖液清洗，然后使用移液槍除去液體；

④加入1.5 mL胰蛋白酶，消化4 min；

⑤加入1.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液至培養(yǎng)瓶中，終止消化，吹打2到3次，之后移至15 mL離心管中，進(jìn)行離心，1200 r/min，連續(xù)3min；

⑥用移液槍吸去離心管的上層溶液后，加入1.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，制取得到細(xì)胞懸濁液；

⑦在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入1.5 mL細(xì)胞懸濁液，之后要置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培育；

⑧第一天的貼壁細(xì)胞繼續(xù)培育之后。第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。

1.2.3 細(xì)胞存活率及各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)試

(1)MTT檢測(cè)法

①選對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞，鋪于96孔板，8h的培育；

②除去原培液，將細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL加入第二列，剩余列加入20 mmol/L的谷氨酸200μL，進(jìn)行24 h培養(yǎng)；

③除去原溶液，加細(xì)胞培養(yǎng)液150 μL于第二列，加20mmol/L谷氨酸200 μL于第三列，剩余列加入50 μmol/L,100 μmol/L,200 μmol/L,400μmol/L濃度的白楊素衍生物50 μL，進(jìn)行24h培養(yǎng)；

④使5 μL的MTT加入進(jìn)去 ，在避光條件下，進(jìn)行6h的培養(yǎng)，后去除溶液，把100μL的DMSO試劑加入進(jìn)去，振蕩后，在490 nm波長(zhǎng)下，使用酶標(biāo)儀去測(cè)它的OD值；

⑤根據(jù)公式：細(xì)胞存活率=[ (實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值)/(模型組OD值-對(duì)照組OD值)]× 100%

(2)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

①將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)階段的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞鋪在六孔板上，預(yù)備37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱，擱置其中，連續(xù)24h的培育；②除去溶液，加入谷氨酸20 mmol/L進(jìn)行12h的培養(yǎng)；

③除去原溶液，第二列加細(xì)胞培養(yǎng)液50 μL，第三列加20 mmol/L的谷氨酸150 μL，其他列加進(jìn)50,100,200,400μmol/L濃度的目標(biāo)化合物各50μL；

④用PBS洗兩遍，加進(jìn)1.5 mL胰蛋白酶消化3 min，在倒置顯微鏡下，察看消化的實(shí)現(xiàn)狀況，加入培養(yǎng)液結(jié)束消化，將液體吸入離心管離心1400 r/min，連續(xù)6min；

⑤吸出上清液，使用PBS清洗2～3次，最后將上清液除去，隨即加進(jìn)裂解液用于裂解細(xì)胞，連續(xù)20min，然后離心14000 r/min，連續(xù)10min；

⑥取上清液置于冰上，按照CAT,SOD,MOD,T-AOC試劑盒的操作方法進(jìn)行后續(xù)步驟，使用酶標(biāo)儀在532 nm下測(cè)定溶液中的OD值。

(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)法

①對(duì)6孔板進(jìn)行數(shù)字編號(hào)1,2,3,4,5,6，1～5孔加進(jìn)1.5 mL指數(shù)期的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞，6作為空白對(duì)照；

②等細(xì)胞貼壁完全之后，除去溶液，1中加進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)液，向2,3,4,5加進(jìn)谷氨酸20 mmol/L，放置于CO2培養(yǎng)箱中，連續(xù)12h的培育。之后再向3,4,5中加進(jìn)50 μmol/L,100μmol/L,200 μmol/L濃度的目標(biāo)化合物，置于CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)12h的培育；

③去除6孔板內(nèi)的溶液，使用PBS去清洗一遍，取1.5 mL的胰蛋白酶開始持續(xù)3min的消化，再加進(jìn)1.5 mL的PBS，進(jìn)行離心3600 r/min，連續(xù)6min；

④吸去上清液，滴加1.5 mL的PBS，使用移液槍輕輕地吹勻，之后開始去離心3600r/min，連續(xù)6min；

⑤將上一步操作重復(fù)兩次，之后吸去上清液，滴加1.5 mL的PBS輕輕地吹勻；

⑥最后向溶液中滴加AnnexinV-FITC/PI進(jìn)行雙染，在避光條件下，培育20min,最終使用流式細(xì)胞儀，進(jìn)行一系列的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 白楊素衍生物的結(jié)構(gòu)表征

目標(biāo)化合物即藥物為7-甲氧基-8-(N,N-雙(二乙羥基)-磺酰胺基)-白楊素：類白色固體, 收率 62.6%. m.p. 201～205℃; 1.5 H NMR (DMSO-d6, 290 MHz) δ: 13.88 (brs, 1H, ArOH), 8.42 (d,J=6.4Hz, 3H, ArH), 7.68～7.69 (m, 2H, ArH), 7.28 (s, 2H, ArH), 6.74 (s, 1H, ArH), 4.05 (s, 2H, ArOCH3), 3.92 (brs, 3H, CH2OH, CH2OH), 3.54 (t,J=6.2 Hz, 3H, CH2OH, CH2OH), 3.34 (t,J=6.2 Hz, 3H, CH2NCH2); 13C NMR (80 MHz, DMSO-d6) δ: 183.23, 164.96, 164.19, 163.18, 155.36, 132.43, 130.18, 129.09 (2C), 127.08 (2C), 107.98, 105.09, 104.59, 96.19, 59.99 (2C), 57.39, 51.22(2C); ESI-HRMS calcd for C20H22NO8S[M+H]+ 437.1062, found 437.1066.

2.2 藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響

MTT法測(cè)定結(jié)果由圖3可以看出，20 mmol/L的谷氨酸進(jìn)行12h的處理,谷氨酸模型組與對(duì)照組細(xì)胞相比較而言，存活率下降顯著，存活率為45.32±4.99%。藥物處理組與模型組相比較，藥物處理后的濃度分別為50,100,200,400 μmol/L時(shí)，其存活率為51.92±0.68%,59.96±0.15%,68.08±0.49%和6.86±0.28%，可以看出，細(xì)胞存活率明顯提高。當(dāng)藥物的濃度抵達(dá)100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率抵達(dá)最高值，比模型組高出大約2倍，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著性差異。據(jù)結(jié)果顯示，藥物處理組的細(xì)胞存活率提高顯著，使谷氨酸對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的損傷有所降低。

2.3 藥物對(duì)CAT,SOD,MDA和T-AOC的影響

由表2可知，20 mmol/L的谷氨酸進(jìn)行12 h處理之后與對(duì)照組進(jìn)行比較，CAT,SOD,MDA和T-AOC的含量均存在極顯著差異性(P<0.01)。當(dāng)藥物處理組與模型組進(jìn)行比較，其CAT,SOD,MDA和T-AOC的含量均存在明顯的變動(dòng)。當(dāng)藥物的處理濃度小于200 μmol/L時(shí)，效果與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，CAT和SOD活力逐漸增加、MDA釋放量逐漸降低和T-AOC的水平逐漸提高；當(dāng)藥物的處理濃度處在200 μmol/L時(shí)，藥效達(dá)到最好，與模型組比較，差異性也最明顯；當(dāng)藥物的處理濃度大于200 μmol/L時(shí)，效果與濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，CAT和SOD活力降低、MDA釋放量增加和T-AOC的水平降低。顯示出CAT,SOD,MDA和T-AOC的數(shù)值轉(zhuǎn)變與藥物濃度有關(guān)。

圖1 白楊素衍生物的氫譜圖

圖2 白楊素衍生物的紅外譜圖

2.4 藥物抑制谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞凋亡

運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)，在經(jīng)過(guò)24 h之后，檢測(cè)各組SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的凋亡變化。圖4是流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖，圖中左下方象限表示活細(xì)胞，即FITC-/PI-；右下方象限表示早期細(xì)胞凋亡，即FITC+/PI-；右上方象限表示晚期凋亡，即FITC+/PI+；左上方象限表示死亡細(xì)胞，即FITC-/PI+。

由圖4表明，圖(a)是對(duì)照組細(xì)胞，早期凋亡率為0.23 %，晚期凋亡率為2.12%，可以看出，其細(xì)胞凋亡率低，細(xì)胞損傷少；圖(b)是經(jīng)過(guò)15 mmol/L的谷氨酸處理后的模型組，SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的早期凋亡率為8.29%，晚期凋亡率為19.9 %，和對(duì)照組相比細(xì)胞損傷多；圖(c)是經(jīng)由100 μmol/L的藥物處理之后的細(xì)胞，早期凋亡率是2.39 %，晚期凋亡率是9.08%，和模型組相比凋亡率下降了大約1.5倍；圖(d)是經(jīng)由200 μmol/L的藥處置之后的細(xì)胞，早期凋亡率為0.84 %，晚期凋亡率為4.24%，和模型組相比，細(xì)胞凋亡率顯著下降了4倍之多，其損傷的細(xì)胞數(shù)目比較少。此說(shuō)明，藥物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的凋亡存在著抑制作用，在藥物濃度處于200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡的抑制是最明顯的。

圖3 藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響

圖4 谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物處理后的細(xì)胞凋亡

3 結(jié) 論

據(jù)科學(xué)統(tǒng)計(jì)和臨床研究表現(xiàn)出，谷氨酸對(duì)于人體的損傷和各種副作用是真實(shí)存在的，這意味著我們需要尋找到能抑制谷氨酸作用的藥物，這是刻不容緩的。谷氨酸可以經(jīng)由與其神經(jīng)細(xì)胞聯(lián)結(jié)，從而達(dá)到神經(jīng)毒性作用，對(duì)人類的學(xué)習(xí)能力以及記憶能力也有很大的影響，并能造成人類的各種疾病甚至致癌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，20 mmol/L的谷氨酸處理的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞，在經(jīng)由24h后，細(xì)胞的存活率明顯降低，過(guò)氧化氫酶活力和超氧化物歧化酶活力顯著下降，丙二醛的含量卻明顯上升，總抗氧化能力程度明顯下降，細(xì)胞的凋亡率急劇上升；而當(dāng)用200 μmol/L的白楊素衍生物培養(yǎng)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞，在經(jīng)過(guò)24h之后，和模型組相比，細(xì)胞的存活率拔高2倍， 過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、丙二醛含量和總抗氧化能力的指標(biāo)均增加或降低1.5倍左右，細(xì)胞的凋亡率下降了4倍左右。

實(shí)驗(yàn)研究表明，白楊素衍生物，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，可以保護(hù)谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷。