常佳麗，張?jiān)冢?滔，馬旭光

(樂山師范學(xué)院 化學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，四川 樂山614000)

0 引言

亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation, n-damo)是由一類特殊功能菌介導(dǎo)完成、在厭氧條件下耦合甲烷氧化與亞硝酸鹽還原的酶促反應(yīng)過程[1-2]。Ettwig等通過厭氧富集培養(yǎng)和宏基因組學(xué)技術(shù)手段，在河流底泥中檢測到n-damo功能菌的存在，并命名為CandidatusMethylomirabilis oxyfera (M.oxyfera)[3-5]。該類菌在厭氧條件下，通過新型胞內(nèi)自產(chǎn)氧途徑氧化甲烷，并獲取生長代謝的能量[5]。甲烷單加氧酶是甲烷氧化代謝途徑的關(guān)鍵酶，編碼甲烷單加氧酶ɑ亞基的pmoA基因可作為鑒定n-damo細(xì)菌的遺傳分子標(biāo)記[6]。

在污水厭氧生物處理領(lǐng)域，存在厭氧段溫室氣體甲烷無序排放、出水總氮不達(dá)標(biāo)等問題，限制了厭氧技術(shù)在水處理領(lǐng)域的大規(guī)模推廣應(yīng)用。N-damo過程可利用原位產(chǎn)生的甲烷進(jìn)行脫氮，無需外源添加其他碳源，同時(shí)實(shí)現(xiàn)溫室氣體的減排和出水總氮的達(dá)標(biāo)，是兼具環(huán)境友好型和經(jīng)濟(jì)節(jié)約型的新型脫氮工藝，具有潛在應(yīng)用前景[7-8]。

近年來，越來越多研究證實(shí)n-damo功能菌在自然界中分布廣泛，河流底泥、濕地、河口沉積物、淹水稻田土、剩余污泥等生態(tài)系統(tǒng)中均不同程度檢測到n-damo細(xì)菌的存在[9-15]，但鮮有研究報(bào)道酸性環(huán)境中該類菌的賦存情況。此外，n-damo細(xì)菌生長代謝速率低、代時(shí)長，富集培養(yǎng)耗時(shí)久，限制了n-damo在實(shí)際污水處理中的推廣應(yīng)用[16]。因此，從其他生境中尋找更多n-damo菌源進(jìn)行富集培養(yǎng)馴化是未來該領(lǐng)域發(fā)展的重要方向之一，也是突破應(yīng)用瓶頸的關(guān)鍵所在。

基于此，本研究重點(diǎn)關(guān)注酸性厭氧生境典型代表——發(fā)育自酸性紅壤的淹水稻田土，借助微生物分子生態(tài)學(xué)檢測手段，解析其中n-damo細(xì)菌的多樣性和豐度，以期為后續(xù)的富集培養(yǎng)研究提供菌源。

1 材料與方法

1.1 土樣的采集及理化性質(zhì)的測定

本研究選取四川眉山(經(jīng)緯度：E 103°14′20″；N 45°51′58.87″)稻田土作為研究對(duì)象，采用五點(diǎn)隨機(jī)采樣法采集三塊不同點(diǎn)位的稻田土壤樣品(分別命名為MS-I，MS-II和MS-III)。采樣時(shí)間為2019年6月，正值水稻種植晚期，稻田為淹水狀態(tài)，自水土交界面向下延伸20 cm采集表層土樣。采集的土樣經(jīng)充分混勻后，無菌條件下，取0.5 g置于2 mL bead-beating離心管中，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存，用于后續(xù)分子生物學(xué)檢測。剩余土樣風(fēng)干后，剔除植物殘?bào)w、石礫，研磨過篩，常溫保存，用于土壤理化性質(zhì)的測定。土壤有機(jī)質(zhì)和全氮含量采用國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法(GB9848-44和HJ-717-2014)進(jìn)行測定，土壤分別用去離子水和1 mol/L KCl浸提后，采用酸度計(jì)(雷磁，PHS-25)測定pH值。

1.2 土樣核酸DNA的提取

采用土壤核酸提取試劑盒(MP FastDNASpin Kit for Soil)，參照試劑盒方法說明書，提取土壤樣品的核酸DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測土樣DNA的提取情況，采用超微量分光光度計(jì)(Biofuture，MD2000D)測定核酸濃度和純度。

1.3 基于n-damo細(xì)菌16S rRNA基因和pmoA基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和克隆測序

以1.2提取的DNA為模板，采用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(nested-polymerase chain reaction, nested-PCR)擴(kuò)增樣品中n-damo細(xì)菌的16S rRNA基因和pmoA基因，PCR擴(kuò)增引物參見表1；采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化)純化目標(biāo)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；利用DNA T4連接酶將純化后的目標(biāo)基因連接至pMD19-T質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞中，利用藍(lán)白斑篩選，得到含有目標(biāo)基因的陽性克隆子；分別隨機(jī)挑選30個(gè)含有n-damo細(xì)菌16S rRNA基因和pmoA基因的陽性克隆子，送樣至上海生工測序平臺(tái)進(jìn)行一代Sanger法測序。

續(xù)表

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序結(jié)果上傳至NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，獲取相應(yīng)參比序列，利用MEGA 5.0軟件，經(jīng)Neighbor-joining計(jì)算方法比對(duì)建樹后，明確待測菌株的遺傳學(xué)分類。

1.5 基于n-damo細(xì)菌16S rRNA基因和pmoA基因的定量PCR

以1.2提取的DNA為模板，采用定量PCR技術(shù)(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測樣品中n-damo細(xì)菌的豐度，qPCR檢測試劑為Power SYBR Green PCR Master Mix(Promega)，檢測儀器為實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7500)，qPCR引物詳見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 眉山稻田土理化性質(zhì)分析

本研究共采集3份土樣，去離子水浸提pH值均小于6.0，1 mol/L KCl浸提pH值均小于5.5，有機(jī)質(zhì)和總氮含量分別在20～30 g/kg和1.0～2.0 g/kg范圍內(nèi)波動(dòng)(表2)。根據(jù)2015年洪雅縣土肥站的土壤養(yǎng)分調(diào)研報(bào)告[17]，本研究所涉及土樣均屬于微酸性中等養(yǎng)分水平土壤。已知n-damo細(xì)菌在中性環(huán)境分布廣泛[9-15]，但鮮有研究報(bào)道酸性環(huán)境中該類群的多樣性及豐度，故解析酸性土樣中n-damo菌的賦存情況，對(duì)開辟新的菌源意義重大。此外，尋找特殊生境條件下的n-damo細(xì)菌，有助于富集培養(yǎng)具有獨(dú)特生理代謝功能的微生物，例如嗜酸性的n-damo細(xì)菌，用于低pH污水的深度脫氮處理。

表2 土樣的基本理化性質(zhì)

2.2 N-damo細(xì)菌的定性檢測

根據(jù)文獻(xiàn)可知，巢式PCR第二段擴(kuò)增反應(yīng)的目標(biāo)基因長度分別為460 bp(16S rRNA基因)和389 bp(pmoA基因)[4,6]。本研究成功擴(kuò)增得到n-damo細(xì)菌特異性的16S rRNA基因和pmoA基因，如圖1所示，泳道1、3和5為核酸DNA Marker(100 bp ladder，自下而上依次為100 bp ～ 600 bp)，2和4分別對(duì)應(yīng)n-damo細(xì)菌特異性pmoA基因和16S rRNA基因片段，擴(kuò)增條帶清晰、亮度高、無非特異性擴(kuò)增條帶、擴(kuò)增長度與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合，可進(jìn)行后續(xù)克隆測序分析。

圖1 n-damo細(xì)菌16S rRNA和pmoA基因巢式PCR第二段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

2.3 酸性稻田土中n-damo細(xì)菌的多樣性

本研究分別對(duì)n-damo細(xì)菌特異性的16S rRNA基因和pmoA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分類鑒定，以便更客觀準(zhǔn)確地反映n-damo細(xì)菌的多樣性賦存情況。基于n-damo 16S rRNA和pmoA基因序列相似度的聚類分析結(jié)果得出，樣品中的n-damo細(xì)菌分別聚為4和3個(gè)OTUs(Operational taxonomic units，可操作分類單元)，如圖2和圖3中的紅色圓圈所示。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本研究檢測到的n-damo細(xì)菌位于CandidatusMethylomirabilis oxyfera系統(tǒng)發(fā)育分支，絕大多數(shù)酸性稻田土中的n-damo細(xì)菌與其它中性生境中檢測到的n-damo細(xì)菌親緣關(guān)系較近。例如，圖2的OTU1與太湖底泥環(huán)境樣品克隆子TH4-27相似度達(dá)98%以上[12]，其余OTUs與西溪濕地、紅樹林濕地沉積物、黃河河口底泥、中性稻田土壤等環(huán)境樣品中的n-damo細(xì)菌均具有較高的相似度(圖2和圖3)[9-11]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，基于n-damo 16S rRNA和pmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果均指示，酸性稻田土中存在未知OTU(圖2的OTU4和圖3的OTU3)，與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的序列均不匹配，推測本研究土樣中可能含有獨(dú)特的n-damo細(xì)菌。后續(xù)研究工作可增加樣本量，采集更多酸性環(huán)境土壤樣本，以驗(yàn)證本研究的檢測結(jié)果。

圖2 基于n-damo細(xì)菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

基于n-damopmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹樹根為好氧甲烷氧化菌Methylomonas，從圖3可知，本研究擴(kuò)增所得pmoA基因序列全部歸屬于CandidatusMethylomirabilis oxyfera系統(tǒng)發(fā)育分支，未見好氧甲烷氧化菌，證實(shí)了cmo182-cmo586這對(duì)引物的專一性，利用該引物對(duì)能夠靶向鑒定環(huán)境樣品中n-damo厭氧甲烷氧化菌的賦存情況[6]。

圖3 基于n-damo細(xì)菌pmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 酸性稻田土中n-damo細(xì)菌的豐度

本研究采用針對(duì)n-damo細(xì)菌16S rRNA基因和pmoA基因的定量PCR，檢測酸性稻田土中n-damo細(xì)菌的豐度。研究共檢測了三塊樣田，MS-I、MS-II和MS-III樣田中n-damo 16S rRNA基因拷貝濃度分別可達(dá)1.25 × 108、2.31 × 108和1.34 × 108拷貝每克干重，pmoA基因拷貝濃度分別為8.66 × 106、2.54 × 107和1.55 × 107拷貝每克干重。其中，pmoA基因普遍比16S rRNA基因豐度低一個(gè)數(shù)量級(jí)，可能的原因在于n-damo細(xì)菌單個(gè)細(xì)胞中含有多個(gè)16S rRNA基因拷貝，但通常pmoA基因?yàn)閱慰截?。?duì)比其他研究發(fā)現(xiàn)，不同生境中的n-damo細(xì)菌16S rRNA基因豐度值波動(dòng)較大，其中， 三峽江水水位波動(dòng)帶最低，僅為4.70 ×102copies /g， 長江河口沉積物最高，可達(dá)9.77×107copies / g[18]。本研究16S rRNA基因拷貝濃度與長江河口沉積物生境的豐度相當(dāng)，甚至更高，暗示酸性稻田土可能是n-damo功能菌的適宜生境。

圖4 基于n-damo細(xì)菌16S rRNA和pmoA基因的定量分析

3 結(jié)論與展望

本研究利用分子克隆和定量PCR技術(shù)對(duì)眉山稻田土壤中亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化細(xì)菌進(jìn)行定性定量檢測，得出以下結(jié)論：

a)采集自眉山洪雅縣的稻田土樣為弱酸性中等養(yǎng)分水平土壤；

b)酸性稻田土中存在n-damo細(xì)菌，且含有潛在的嗜酸性n-damo功能菌；

c)酸性稻田土n-damo細(xì)菌豐度較高，與其它中性環(huán)境樣品n-damo細(xì)菌豐度相當(dāng)。

結(jié)合本研究結(jié)果和該領(lǐng)域最新進(jìn)展，對(duì)后續(xù)研究工作做出下列展望：

a)可針對(duì)嗜酸性n-damo功能菌的富集培養(yǎng)開展系列試驗(yàn)；

b)除酸性稻田土，還可采集茶園土、酸性尾礦、酸性泥炭沼澤地等其它低pH生境樣品，擴(kuò)大對(duì)酸性環(huán)境中n-damo細(xì)菌分布多樣性的認(rèn)知；

c)針對(duì)多種酸性生境中n-damo細(xì)菌群落的分布模式、結(jié)構(gòu)特征以及生理生態(tài)影響機(jī)制展開研究，篩選富集得到最優(yōu)功能菌；

d)采用先進(jìn)的組學(xué)技術(shù)深度挖掘n-damo細(xì)菌的生理代謝功能，為實(shí)現(xiàn)其在實(shí)際廢水深度脫氮中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。