李逸軒，付君婷，鄧小剛，段欣汝，韓淳，呂鵬飛，3，鄺仕成，2，肖莎

1.海南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學(xué)教研室，海南 ?？?571199；

2.海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院藥學(xué)部，海南 ?？?570311；

3.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺外科，海南 ?？?570102

肺癌是全球癌癥患者死亡的首要原因[1]，如何控制和預(yù)防肺癌已成為全世界范圍內(nèi)的關(guān)注焦點(diǎn)。由于肺癌的發(fā)生和惡化是多種因素導(dǎo)致的，并且沒(méi)有很好的特效藥，因此近幾年肺癌的患病率和死亡率均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。在肺癌的診療過(guò)程中，早期肺癌由于不具有典型的臨床癥狀(如咳嗽，胸痛等)，從而導(dǎo)致檢出率較低，而中后期肺癌治療的預(yù)后效果并未能達(dá)到人群預(yù)期效果，且對(duì)患者機(jī)體產(chǎn)生較大傷害，較高的花費(fèi)同樣為社會(huì)的醫(yī)療增添負(fù)擔(dān)，因此探尋可篩查出早期肺癌的生物標(biāo)記物具有重要的臨床意義。目前臨床上仍無(wú)法對(duì)早期肺癌做出準(zhǔn)確的篩查，而非編碼小分子RNA在一些惡性腫瘤中的表達(dá)存在特異性，研究人員認(rèn)為這一發(fā)現(xiàn)對(duì)深入探討更加高效的肺癌早期診斷具有重要的意義。

非編碼小分子RNA(microRNAs，miRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)21～25個(gè)核苷酸的小分子，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞繁殖、代謝、凋亡等生理過(guò)程發(fā)揮著重要作用[2]，其作用機(jī)制是特異性結(jié)合靶基因mRNAs上的3'非編碼區(qū)域，干擾mRNAs在轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)或蛋白質(zhì)翻譯，從而干擾一系列的正?；虮磉_(dá)的生物學(xué)進(jìn)程。在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中，miRNA起著致癌或者抑癌基因的作用，而引起腫瘤組織的非正常增生以及浸潤(rùn)[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)在肝癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌以及肺癌等多種實(shí)體性惡性腫瘤中，miRNA-486、miRNA-200和miRNA-10b在腫瘤組織中存在不同程度的上調(diào)或下調(diào)的表達(dá)狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌患者機(jī)體miRNA-486的表達(dá)量顯著降低[4]，miRNA-10b在肺癌患者血液中呈低表達(dá)[5]，可以用于早期篩查的重要指標(biāo)。本研究旨在探討miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b在肺癌患者與非肺癌患者血液中表達(dá)的差異性，分析其在肺癌患者血液中的表達(dá)與肺癌遺傳易感性是否有關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用病例對(duì)照研究方法，選擇2012年1月至2016年7月期間海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院呼吸內(nèi)科的93例肺癌患者作為病例組，41例非肺癌患者作為對(duì)照組。在簽署知情同意書(shū)后，開(kāi)展問(wèn)卷調(diào)查，記錄人口學(xué)特征、既往病史、家族病史及生活方式(吸煙、飲酒)等一般情況。規(guī)定平均每天吸煙大于1支的并且超過(guò)半年的定義為吸煙者，規(guī)定平均每天飲酒大于1兩的并且超過(guò)半年的定義為飲酒者。

1.2 血液樣本的采集 利用經(jīng)過(guò)枸櫞酸鈉抗凝處理過(guò)的真空采血管采集研究對(duì)象的外周靜脈血6 mL，4℃冰箱保存，采集血液樣本當(dāng)天完成其miRNA提取。

1.3 miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b的相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè) 遵循北京全式金生物技術(shù)(Trans-Gen Biotech)有限公司提供的操作程序提取miRNA，使用由TransGen Biotech提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再使用miRNAreal-time PCR反應(yīng)試劑盒(Trans-Gen Biotech)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，總體系為20 μL，PCR正向引物 (10 μmol/L)0.4 μL，PCR 反向引物 (10 μmol/L)0.4 μL，2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix 10.0 μL，Passive Reference Dye(50×)(optional)5.2 μL，ddH2O 2.0 μL，DNA模板2.0 μL。以U6作為內(nèi)參考基因，血液miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b水平的相對(duì)表達(dá)量采用2-△Ct表示，△Ct486=Ct486-CtU6，△Ct200=Ct200-CtU6，△Ct10b=Ct10b-CtU6。匯總3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用EXCEL2010、SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料中滿足正態(tài)性分布的采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()描述，組間比較采用t檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)性分布的采用中位數(shù)和四分位間距[M(P25，P75)]描述，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的基本情況比較 兩組患者的性別、年齡、吸煙史、飲酒史比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的基本情況比較

2.2 兩組患者的血液miRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 病例組患者的血液miRNA-486相對(duì)表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組、miRNA-10b相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但兩組患者的血液miRNA-200相對(duì)表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組患者的血液miRNA相對(duì)表達(dá)水平比較[M(P25，P75)]

2.3 病例組患者血液中miRNA的相對(duì)表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系 病例組患者血液中的miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b相對(duì)表達(dá)水平在性別、年齡、吸煙史、飲酒史方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，見(jiàn)表3～表5。

表3 病例組血漿中miR-486的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系[M(P25，P75)]

?images/BZ_14_1270_276_2266_334.png性別-0.1890.850男女35.25(33.21，36.78)35.13(33.35，36.95)年齡(歲)0～60 61～100吸煙史-0.0080.994 35.24(33.39，36.87)35.16(33.17，36.69)-0.3830.702有無(wú)35.21(32.26，36.85)35.11(34.21，36.68)飲酒史-0.6800.496有無(wú)34.81(32.31，36.17)35.17(33.30，36.80)

?臨床特征性別miR-200Z值-0.997 P值0.319男女35.54(34.00，36.86)35.78(34.75，37.69)年齡(歲)0～60 61～100吸煙史-0.1940.846 35.44(34.27，36.98)35.73(33.96，36.93)-0.6040.546有無(wú)35.59(33.94，36.91)35.69(34.27，37.61)飲酒史-1.3310.183有無(wú)34.71(34.10，37.33)36.07(34.27，36.94)

3 討論

由于臨床上對(duì)肺癌的診斷多依靠病理檢驗(yàn)取患者的組織進(jìn)行活檢，會(huì)對(duì)患者造成機(jī)體的創(chuàng)傷且對(duì)早期肺癌進(jìn)行篩查時(shí)無(wú)法做到大面積推廣，血清標(biāo)記物用于篩查早期肺癌具有創(chuàng)傷小、高效性和易于推廣的特點(diǎn)。miRNA一直作為國(guó)內(nèi)外學(xué)者近幾年研究腫瘤作用的熱點(diǎn)相關(guān)分子，均有大量研究實(shí)驗(yàn)證明miRNA分子可以作為特異性診斷腫瘤的生物標(biāo)志物，其中miR-486、miRNA-200、miRNA-10b是與腫瘤發(fā)生相關(guān)的重要生物標(biāo)志物。本次研究前期采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)海南地區(qū)漢族肺癌患者和對(duì)照患者血液中差異表達(dá)的miRNA，在初次實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序時(shí)研究發(fā)現(xiàn)miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b的表達(dá)差異性顯著，且均呈下調(diào)狀態(tài)[6]。因此，研究人員通過(guò)real-time PCR法檢測(cè)93例肺癌患者和41例非肺癌患者血液miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-486在兩組患者血液中的表達(dá)具有差異性，肺癌患者血液中miRNA-486的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組患者與諸多學(xué)者研究結(jié)論相一致。楊陽(yáng)等[7]和姜溪[8]同樣發(fā)現(xiàn)在肺癌患者血漿中miRNA-486的表達(dá)下調(diào)，可以作為肺癌潛在篩查及預(yù)后的生物指標(biāo)，黃馨萍等[4]、何佳等[9]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-486在肝癌組織中低表達(dá)，安學(xué)鳳等[10]研究結(jié)果顯示早期乳腺癌患者的血清中miR-486呈低表達(dá)，可以作為特異性診斷早期乳腺癌的生物標(biāo)志物。另外，本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-10b在肺癌患者血液中相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。楊云龍等[11]研究也發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者外周血單核細(xì)胞中miRNA-10b的表達(dá)量顯著高于健康者，可作為非小細(xì)胞肺癌的早期篩查和治療的重要指標(biāo)。miRNA-200家族在腫瘤患者體內(nèi)是一個(gè)重要的參考指標(biāo)，其包括miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141 和 miRNA-429[11]。鄧超等[12]研究提示病例組患者血清中miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的相對(duì)表達(dá)量顯著低于健康組。JING等[13]通過(guò)transwell和尾靜脈注射法測(cè)定miR-200c和USP25在遷移/侵襲和肺轉(zhuǎn)移形成中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-200c可通過(guò)抑制USP25表達(dá)對(duì)，從而起到對(duì)非小細(xì)胞肺癌發(fā)揮腫瘤抑制的作用。但在探討miRNA-200在肺癌患者血液中相對(duì)表達(dá)時(shí)，本研究并未發(fā)現(xiàn)miRNA-200在兩組患者血液中的表達(dá)有顯著性差異。對(duì)比其他學(xué)者的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，本組研究人員探討其原因可能是沒(méi)有進(jìn)行miRNA相應(yīng)家族各個(gè)指標(biāo)的分析，僅僅進(jìn)行了一個(gè)綜合表達(dá)量的檢測(cè)。提示在今后的研究中應(yīng)進(jìn)一步探討肺癌患者血液中miRNA-200各家族其他指標(biāo)的表達(dá)量。

本研究尚存在一定的不足之處，在深入探究病例組miR-486和miRNA-10b的表達(dá)情況與其性別、年齡、吸煙史、飲酒史的關(guān)聯(lián)時(shí)，結(jié)果均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析其原因可能為研究樣本數(shù)量過(guò)少，存在偏倚現(xiàn)象，在以后的研究中應(yīng)考慮擴(kuò)大樣本容量。

綜上所述，miRNAs在肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著癌基因或抑癌基因的作用也預(yù)示著它將為肺癌患者早期診斷提供了可能。miR-486和miRNA-10b可作為肺癌遺傳易感性生物標(biāo)志物。