李玉杰，楊雪佳，吳登強(qiáng)，呂玥茜，李茵佳，周素芳

廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021

肝細(xì)胞癌是一種常見(jiàn)的惡性肝病[1]，HCC的死亡率在消化系統(tǒng)腫瘤中居第三位[2-5]。在大多數(shù)情況下，病毒感染導(dǎo)致HCC的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[6-7]，特別是慢性乙型肝炎病毒(HBV)是導(dǎo)致HCC的主要原因之一[8]。超過(guò)50%的肝癌病例是由慢性HBV感染引起的，在高流行地區(qū)，HBV感染估計(jì)占肝癌病例的80%以上[3]。此外，HBV相關(guān)肝癌患者的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率明顯高于未感染HBV的患者，HBV是證明與HCC發(fā)展直接相關(guān)的首批病毒之一[2，4，9]。目前可用的抗病毒藥物并不能完全消除慢性乙肝病毒[10-11]，慢性HBV感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥[12-13]，從而導(dǎo)致正常肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，這使得乙肝病毒和煙草成為最重要的環(huán)境致癌物質(zhì)。雖然HBV與HCC之間的因果關(guān)系已經(jīng)確立，但肝癌發(fā)生的原因和潛在機(jī)制仍有待于充分闡明[6,11,13]。后基因組技術(shù)的出現(xiàn)以及全球公開(kāi)數(shù)據(jù)集的顯著發(fā)展，為研究肝癌的發(fā)病機(jī)制提供了工具，使得研究在單個(gè)陣列中同時(shí)表達(dá)數(shù)千個(gè)基因的mRNA成為可能，利用生物信息學(xué)方法可以識(shí)別與腫瘤消退相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物和信號(hào)通路[14]。最近，許多研究使用全基因組數(shù)據(jù)集來(lái)識(shí)別肝癌的診斷和預(yù)后分子標(biāo)記，特別是來(lái)自癌癥基因組圖譜(TCGA，The Cancer Genome Atlas)研究網(wǎng)絡(luò)和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)的HCC數(shù)據(jù)集。人類(lèi)HCC的基因表達(dá)分析已經(jīng)成功地根據(jù)預(yù)后、病因和肝內(nèi)復(fù)發(fā)對(duì)HCC進(jìn)行了分子分類(lèi)[3，15-16]。但是目前利用微陣列技術(shù)對(duì)HBV相關(guān)的HCC研究較少[17]，相關(guān)的生物標(biāo)記物較多，不能為臨床預(yù)后提供針對(duì)性的依據(jù)，迫切需要進(jìn)一步對(duì)相關(guān)的全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全面的基因組分析，以研究診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[4，18]。在本研究中，根據(jù)GEO和TCGA的數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)HBV相關(guān)的肝癌組織和非腫瘤組織差異表達(dá)基因(DEGs)的研究，還對(duì)DEGs進(jìn)行了基因本體(GO)功能富集分析和基因組京都百科全書(shū)(KEGG，The KEGG resource for deciphering the genome)途徑富集分析，此外，還有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)等，分析了基因表達(dá)與HCC預(yù)后和進(jìn)展的關(guān)系。本研究的結(jié)果有助于確定肝癌患者個(gè)體化治療和乙肝病毒感染史的關(guān)鍵生物標(biāo)記物，為進(jìn)一步了解腫瘤進(jìn)展和肝癌的研究提供依據(jù)[19-21]。

1 材料與方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù)篩選 首先從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下 載 基 于GPL570(HG-U133_Plus_2)人類(lèi)基因組U133 Plus 2.0陣列的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE55092和GSE121248，GSE55092包括49個(gè)HBV相關(guān)的HCC樣本和91個(gè)非腫瘤樣本，GSE55092包括70個(gè)HBV相關(guān)的HCC樣本和37個(gè)非腫瘤樣本，使用GEO2R在線(xiàn)分析工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行計(jì)算，調(diào)整后P＜0.01和表達(dá)倍數(shù)變化值|log2(fold change)|≥2的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)?！癵plots”R軟件包用于篩選由2個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集的DEGs列表，通過(guò)韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)分析共同包含的差異表達(dá)基因[22-23]。

1.2 DEGs功能和通路分析 注釋可視化與綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(DAVID 3https://DAVID.ncifcrf.gov/home.jsp；6.8版)是一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，它集成了生物數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模基因的生物功能提供系統(tǒng)全面的注釋信息，蛋白質(zhì)列表幫助用戶(hù)從中提取生物信息[24]。KEGG是世界上最常用的了解高級(jí)功能和生物系統(tǒng)的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)之一[25]。在分子水平上，KEGG整合了由高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)產(chǎn)生的大量實(shí)用數(shù)據(jù)庫(kù)資源。GO被廣泛應(yīng)用于生物信息學(xué)中，包括細(xì)胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物過(guò)程(BP)三個(gè)方面[18]。為了分析DEGs的GO和通路富集信息，使用了DAVID在線(xiàn)工具，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因篩選 檢索相互作用的基因和蛋白質(zhì)的搜索工具string(https://string-db.org/；11.0版)，是一個(gè)用于識(shí)別DEG之間相互作用和功能關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)，能夠構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。在Cytoscape 3.5.1(https://cytoscape.org/)軟件中，利用CytoHubba插件獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中得分最高的前14個(gè)hub基因。

1.4 遺傳標(biāo)記的生存分析和臨床特點(diǎn) GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，http://gepia.cancer-pku.cn/)是一個(gè)新開(kāi)發(fā)的交互式網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，用于分析9 736個(gè)腫瘤和8 587個(gè)正常樣本的RNA序列表達(dá)數(shù)據(jù)，通過(guò)GEPIA分析hub基因在腫瘤不同階段的表達(dá)量和在不同腫瘤中的表達(dá)差異，利用cBio-Portal(http://www.cbioportal)分析來(lái)自TCGA的hub基因之間的相關(guān)性。使用Kaplan-Meier Plotter(www.kmplot.com)的Kaplan-Meier曲線(xiàn)特征分析與hub基因相關(guān)的總體生存率，其中包括364例患者。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 GEO數(shù)據(jù)集的校正P值用GEO2R軟件計(jì)算，調(diào)整P＜0.01的數(shù)據(jù)被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO項(xiàng)和KEGG途徑P＜0.01，被認(rèn)為顯著富集。對(duì)于Kaplan-Meier分析，生存曲線(xiàn)比較采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的篩選 利用GEO2R在線(xiàn)分析工具處理HCC表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)?；趞logFC|＞2.0和校正P＜0.01篩選差異表達(dá)基因的層次聚類(lèi)熱圖，從GSE55092數(shù)據(jù)集中共篩選出389個(gè)DEGs，聚類(lèi)熱圖如圖1A所示，GSE121248篩選出來(lái)了146個(gè)DEGs，聚類(lèi)熱圖如圖1B所示，VENN圖中顯示兩個(gè)數(shù)據(jù)集中包含了129個(gè)DEGs如圖1C。

2.2 GO功能注釋和KEGG富集分析 肝癌中的DEGs的GO功能注釋和KEGG富集分析的主要功能和通路分別在圖2A～2D中顯示。GO中的BP顯著富集為“氧化還原過(guò)程”、“外源藥物分解代謝過(guò)程”和“一元羧酸代謝過(guò)程”，CC主要表現(xiàn)為“細(xì)胞外區(qū)域”和“細(xì)胞器膜”，MF主要富集在“血紅素結(jié)合”、“鐵離子結(jié)合”和“分子氧的結(jié)合或還原”，KEGG顯示DEGs在“視黃醇代謝”、“咖啡因代謝”和“p53信號(hào)通路”中富集程度最高。目前的結(jié)果表明，DEGs在細(xì)胞分裂和代謝途徑方面有顯著的富集作用。

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 共有129個(gè)DEGs用于構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖3A所示，根據(jù)CytoHubba插件中的最大集團(tuán)中心性算法(MCC，maximal clique centrality)算法篩選出前14個(gè)hub基因，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1(CDK1)[26]、細(xì)胞周期蛋白B1(CCNB1)、DAN拓?fù)洚悩?gòu)酶(TOP2A)、重組人核糖核苷酸還原酶M2(RRM2)、上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2癌基因(ECT2)、微管相關(guān)蛋白(PRC1)、透明質(zhì)酸介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)因子受體重組蛋白(HMMR)、異常紡錘型小腦畸形癥蛋白基因(ASPM)、泛素蛋白連接酶(DTL)、人類(lèi)重組蛋白(RACGAP1)、微小RNA-217靶基因(ANLN)有絲分裂檢查點(diǎn)絲氨酸/蘇氨酸激酶B(BUB1B)、PDZ結(jié)合激酶(PBK)、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白激酶 2(NEK2)。在這 14 個(gè) hub 基因中(圖 3B)，CDK1、CCNB1和TOP2A顯示較高的得分，其名稱(chēng)、縮寫(xiě)和功能見(jiàn)表 1[15，27-28]。

圖1 基于|logFC|＞2.0和校正P值＜0.01篩選差異表達(dá)基因的層次聚類(lèi)熱圖和韋恩圖

圖2 對(duì)DEGs進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析

圖3 DEGs與前10位hub基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

表1 關(guān)鍵基因的功能信息

2.43 種HCC遺傳標(biāo)記的預(yù)后潛力和相關(guān)性分析 根據(jù)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(圖4A～4C)，3個(gè)hub基因CDK1、CCNB1和TOP2A之間存在顯著相關(guān)性(P＜0.05)，利用GEPIA數(shù)據(jù)集比較了HCC和肝組織中CDK1、CCNB1和TOP2A的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明，hub基因在肝癌組織中的表達(dá)水平均高于正常組織(圖4D～4F)，緊接著分析hub基因在肝癌分期中的表達(dá)，結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A～5C)。通過(guò)分析CDK1、CCNB1和TOP2A表達(dá)對(duì)肝癌患者生存和預(yù)后的影響[16]，Kaplan-Meier曲線(xiàn)和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)分析顯示，CDK1、CCNB1和TOP2A水平的升高與肝癌患者的總體生存率(OS)降低顯著相關(guān)，高表達(dá)的輕微趨勢(shì)與預(yù)后不良相關(guān)(P＜0.05；圖5D～5F)。

圖4 hub基因相關(guān)性和表達(dá)量分析

圖5 hub基因在不同腫瘤分級(jí)中的表達(dá)和生存分析

3 討論

肝癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程[1]。近年來(lái)，大量的生物標(biāo)志物被用于肝癌的早期診斷[29]，尤其是慢性乙肝病毒是導(dǎo)致HCC的重要原因之一，但是現(xiàn)在關(guān)于此的研究還很少，多基因水平的研究有助于探索癌癥的發(fā)病機(jī)制[8,19,30]。本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)2個(gè)肝癌基因芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最后發(fā)現(xiàn)CDK1、CCNB1和TOP2A與患者生存率低、腫瘤分級(jí)高有關(guān)。本研究主要針對(duì)HBV感染的肝癌病例，有別于以往的研究[3,7,10,12,31-32]，本研究還分析了臨床特征與生物標(biāo)志物的關(guān)系，這些基因的表達(dá)與總生存率和病理分期有關(guān)[13]。為了探討肝癌的分子機(jī)制，在兩個(gè)來(lái)自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)集中，共有139個(gè)HBV感染的腫瘤樣本，128個(gè)非腫瘤樣本，通過(guò)GEO2R和韋恩圖分析共得到129個(gè)DEGs，經(jīng)過(guò)富集和PPI分析，共鑒定出了14個(gè)hub基因。在這14個(gè)hub基因中，CDK1、CCNB1和TOP2A相互作用密切，KEGG分析表明，在“視黃醇代謝”、“咖啡因代謝”和“p53信號(hào)通路”中富集程度最高，說(shuō)明DEGs顯著影響細(xì)胞分裂和代謝途徑等方面，促進(jìn)后期復(fù)合物依賴(lài)性分解代謝過(guò)程、氧化還原過(guò)程和細(xì)胞分裂，是前3位富集最顯著的BPs，腫瘤發(fā)生的主要原因可能是細(xì)胞周期失衡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖。先前有相關(guān)研究報(bào)道，HBV感染可引起代謝信號(hào)通路的改變[2，6，8，20，31]，其結(jié)果可能改變正常的肝細(xì)胞代謝，從而有助于乙肝相關(guān)致癌的進(jìn)展[6]。

CDK1是CCNB1在G2/M轉(zhuǎn)換和有絲分裂恢復(fù)中所必需的[33]，兩者是高度相關(guān)的，HBV可以激活HCC細(xì)胞中的CCNB1-CDK1激酶。在其他研究中，發(fā)現(xiàn)HBV陽(yáng)性患者的HCC組織中CCNB1和CDK1上調(diào)。并且，這兩個(gè)基因的過(guò)度表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)。CDK1被認(rèn)為是CCNB1的重要組成部分，因?yàn)樗梢杂绊慔BV陽(yáng)性肝癌患者的總生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率。TOP2A過(guò)表達(dá)與肝癌早期發(fā)展、短期生存和化療耐藥有關(guān)。在本研究中，利用TCGA的數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析表明，CDK1、CCNB1和TOP2A之間存在密切的相關(guān)性，3個(gè)hub基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，三者與肝癌患者的生存率顯著相關(guān)，HCC組織中CDK1、CCNB1和TOP2A的高表達(dá)與預(yù)后差和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高有關(guān)。然而，這3個(gè)基因在肝癌和其他癌癥類(lèi)型中的生物學(xué)功能，包括代謝和細(xì)胞周期，尚需進(jìn)一步研究，這可能是它們作為治療肝癌或者其他癌癥類(lèi)型的靶點(diǎn)。

總之，本研究在一個(gè)大的隊(duì)列基礎(chǔ)上，與HBV感染患者的非腫瘤組織相比，在HCC組織中發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)DEG?；贒EGs，確定了幾個(gè)關(guān)鍵途徑。同時(shí)，PPI網(wǎng)絡(luò)也揭示了這些途徑中DEGs的相互作用。一些結(jié)果與之前的研究一致[20]。本研究為有HBV感染史的患者提供了新的HCC病因和非腫瘤肝組織轉(zhuǎn)化為HCC組織的分子機(jī)制。重要的是，這些結(jié)果可能為這些患者的靶向治療提供一些潛在的治療靶點(diǎn)，有助于肝癌的早期診斷和治療。