王鑫 李慧 王向東 李莉 鞏永鳳

[摘要] 目的 改良并完善順鉑誘導(dǎo)小鼠慢性腎臟疾病模型，研究其腎功能、組織結(jié)構(gòu)及分子水平的改變。

方法 對不同周齡雄性C57BL/6小鼠注射不同劑量順鉑，觀察小鼠生存率，選取合適的順鉑劑量及小鼠周齡用以制備模型。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗測定順鉑注射后小鼠血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平的變化，采用免疫熒光（IF）、馬松三色（MT）染色和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法觀察順鉑注射對腎纖維化的影響，采用IF、蘇木精-伊紅（HE）染色和RT-qPCR方法觀察順鉑注射對小鼠腎組織中細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞浸潤的影響。

結(jié)果 選擇8周齡小鼠，通過腹腔注射7 mg/kg順鉑（每周1次，共4次）構(gòu)建慢性腎臟疾病模型。與對照組（小鼠腹腔注射無菌生理鹽水）比較，順鉑注射24、42 d小鼠Scr和BUN水平顯著升高（F=12.05、41.89，P<0.01），腎臟纖維化面積顯著增加（F=78.87，P<0.01），腎纖維化相關(guān)基因膠原纖維1α1（Col1α1）和纖連蛋白（Fn）mRNA表達(dá)水平明顯升高（F=37.01、57.10，P<0.01），腎組織炎性細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞和F4/80+巨噬細(xì)胞浸潤明顯增加，腎組織炎癥相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）以及腫瘤壞死因子α（TNF-α）mRNA表達(dá)水平顯著升高（F=10.24～86.82，P<0.01）。注射42 d小鼠上述指標(biāo)變化較注射24 d小鼠更明顯（P<0.01）。

結(jié)論 反復(fù)低劑量順鉑腹腔注射后腎臟發(fā)生纖維化、慢性炎癥和功能障礙。本研究通過縮短模型制備周期以及減少順鉑用藥劑量，完善了順鉑誘導(dǎo)腎纖維化和慢性炎癥小鼠模型。

[關(guān)鍵詞] 順鉑;腎衰竭，慢性;纖維化;炎癥;小鼠，近交C57BL

[中圖分類號] R364.5;R979.19

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）06-0801-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.207

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211230.1017.010.html;2021-12-30 13：40：55

INFLUENCE OF CISPLATIN INJECTION ON RENAL FUNCTION AND STRUCTURE IN C57BL/6 MICE

WANG Xin， LI Hui， WANG Xiangdong， LI Li， GONG Yongfeng

（Department of Pathology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To improve and perfect the mouse model of chronic kidney disease induced by cisplatin， and to investigate the changes in renal function， renal histology， and molecular levels.

Methods Male C57BL/6 mice with different ages in weeks were injected with different doses of cisplatin， and the survival rate of the mice was calculated. The appropriate dose of cisplatin and the mice with the appropriate age in weeks were selected to establish a model. ELISA was used to measure the changes in serum creatinine （Scr） and blood urea nitrogen （BUN） after cisplatin injection; immunofluorescence assay， Masson staining， and RT-qPCR were used to observe the influence of cisplatin injection on renal fibrosis; immunofluorescence assay， HE staining， and RT-qPCR were used to observe the influence of cisplatin injection on cytokines and inflammatory cell infiltration in renal tissue.

Results The mice aged 8 weeks were selected to establish a model of chronic kidney disease by intraperitoneal injection of 7 mg/kg cisplatin once a week for 4 weeks. Compared with the control group （treated with intraperitoneal injection of sterile normal saline）， the mice treated with cisplatin injection for 24 and 42 days had significant increases in the levels of Scr and BUN （F=12.05，41.89;P<0.01）， the area of renal fibrosis （F=78.87，P<0.01）， the mRNA expression levels of the renal fibrosis-related genes Col1α1 and Fn （F=37.01，57.10;P<0.01）， the infiltration of inflammatory cells， CD3+ T cells， and F4/80+ macrophages in renal tissue， and the mRNA expression levels of the inflammation-related cytokines IL-1β， IL-6， MCP-1， and TNF-α in renal tissue （F=10.24-86.82，P<0.01）. The mice treated with injection for 42 days had significantly greater changes in the above indices than those treated with injection for 24 days （P<0.01）.

Conclusion Renal fibrosis， chronic inflammation， and dysfunction are observed after repeated injection of low-dose cisplatin. This study improves the mouse model of cisplatin-induced renal fibrosis and chronic inflammation by shortening the cycle of model preparation and reducing the dose of cisplatin.

[KEY WORDS]cisplatin; kidney failure， chronic; fibrosis; inflammation; mice， inbred C57BL

慢性腎臟疾?。–KD）是一種臨床病理綜合征，以持續(xù)的腎臟結(jié)構(gòu)和（或）功能發(fā)生改變?yōu)樘卣鱗1]。

常見構(gòu)建急性腎損傷（AKI）-CKD模型方法包括缺血再灌注和毒性物質(zhì)誘導(dǎo)兩種方式，其中前者包括單側(cè)及雙側(cè)腎血管夾閉，后者包括白喉毒素、馬兜鈴酸、葉酸、順鉑等誘導(dǎo)[2]。順鉑是一種強(qiáng)效化療藥物，廣泛用于治療各種實體瘤。人體使用順鉑后會出現(xiàn)多種不良反應(yīng)，而腎毒性是臨床應(yīng)用順鉑的主要不良反應(yīng)[3]。過去數(shù)十年中，順鉑腎毒性的發(fā)病機(jī)制在AKI中被廣泛研究[4-5]。然而，臨床上順鉑治療腫瘤往往每周1次或每月1次，順鉑長期應(yīng)用導(dǎo)致了CKD。為了更好地模擬臨床化療藥物對腎臟的慢性影響，通常應(yīng)用多次低劑量順鉑注射的方法來制備模型。雖然不斷有研究從小鼠、大鼠、猴子等不同動物到順鉑注射次數(shù)以及注射劑量，對多次低劑量順鉑誘導(dǎo)CKD進(jìn)行摸索[6-8]，但至今仍未有一個公認(rèn)的模型來模擬臨床長期使用順鉑所導(dǎo)致的慢性腎功能不全。本研究旨在改良并完善順鉑誘導(dǎo)小鼠CKD模型，研究其腎功能、組織結(jié)構(gòu)及分子水平改變，為進(jìn)一步研究順鉑導(dǎo)致腎纖維化和慢性炎癥提供更好模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選擇成年健康雄性C57BL/6小鼠，SPF級，8、12和16周齡小鼠分別為90、20和20只，購自維通利華（CHN）公司。

1.1.2 藥物與試劑 順鉑（美國MCE生物科技有限公司）;PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）;小鼠血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司）;馬松三色（MT）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;TRIzol Reagent（15596026）、Po-werUpTM SYBR Green 預(yù)混液、RIPA裂解液（美國Thermo Fisher公司）;PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（日本Takara公司）;DAPI（北京索萊寶科技有限公司）;兔多克隆抗體anti-Fibronectin（英國abcam公司），山羊單克隆抗體anti-Type Ⅰcollagen（美國SouthernBiotech公司），大鼠單克隆抗體anti-F4/80（美國Thermo Fisher公司），兔單克隆抗體anti-CD3（美國Novus Biologicals公司），羊抗兔二抗、兔抗大鼠二抗、兔抗小鼠二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立及分組 取40只8周齡雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為2組（每組20只），用于觀察不同劑量（7和9 mg/kg）順鉑注射后小鼠生存率。取8、12、16周齡雄性C57BL/6小鼠各20只，用于觀察順鉑（7 mg/kg，每周1次，共4次）注射后小鼠生存率。取30只8周齡雄性C57BL/6小鼠（每只體質(zhì)量22～25 g），隨機(jī)分為對照組、實驗1組和實驗2組，每組10只。實驗組小鼠以7 mg/kg劑量順鉑（溶解于生理鹽水）腹腔注射，每周1次，連續(xù)注射4次，對照組則同法腹腔注射等體積的無菌生理鹽水。對照組小鼠在注射后第42天，實驗1組和實驗2組小鼠分別在注射后第24和42天，摘眼球取血和剖腹取腎，進(jìn)行后續(xù)實驗分析。

1.2.2 血清的制備及保存 將血液樣本室溫靜置2 h，在4 ℃下以3 000 r/min離心15 min。用移液器小心收取上清，-80 ℃凍存保存。

1.2.3 腎組織取材 腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉小鼠，并固定小鼠四肢于實驗臺上，沿腹部中線剖開腹腔，暴露腎臟并剝?nèi)ツI包膜。取出一側(cè)腎臟保存于-80 ℃冰箱中備用;另一側(cè)腎臟取出后用刀片沿縱軸對半切開，一半固定于40 g/L的多聚甲醛中，另一半用OCT包埋用于冷凍切片。

1.2.4 血清Scr和BUN水平的測定 使用Scr和BUN的ELISA試劑盒測定其水平。

1.2.5 腎組織學(xué)檢查 常規(guī)方法制備腎組織石蠟切片[9]，切片厚度為4 μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和MT染色，光鏡下拍照。HE染色用于觀察小鼠腎組織結(jié)構(gòu)改變和炎癥細(xì)胞的浸潤。MT染色后在光學(xué)顯微鏡（200倍）下觀察藍(lán)染膠原纖維，每組取5個視野，用Image J圖像分析軟件計算腎臟膠原纖維量。

1.2.6 腎組織免疫熒光（IF）檢測 取出-80 ℃保存的腎組織，切片（8 μm），用冰甲醇固定15 min，封閉液室溫封閉1 h;加入一抗Ly6G（1∶200）、F4/80（1∶200）、CD3（1∶200）、膠原纖維1α1（Col1α1，1∶100）和纖連蛋白（Fn，1∶100），4 ℃孵育過夜;以PBS洗3次，每次10 min;加入對應(yīng)二抗，室溫孵育2 h;以PBS洗3次，每次10 min;使用DAPI染核5 min;以PBS洗4次，每次5 min;用moviol封片，激光共聚焦顯微鏡拍照觀察。

1.2.7 腎組織RNA的提取及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測 取小鼠腎臟組織100 mg，放入1.5 mL Trizol中勻漿，取1 mL置于1.5 mL無酶無菌EP管中，勻漿機(jī)充分勻漿，利用沉淀法（氯仿、異丙醇）提取RNA。對相應(yīng)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量，以Actb作為內(nèi)參照，計算目的基因的2-△△Ct值，以其作為目的基因的相對表達(dá)水平。實驗所用引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)以±s表示，3組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey分析。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量順鉑對小鼠生存率的影響

注射第24天時，7 mg/kg順鉑注射小鼠的生存率為100%，9 mg/kg順鉑注射小鼠生存率為10%。注射第42天時，7 mg/kg順鉑注射小鼠生存率為90%。因此，選取7 mg/kg作為合適注射劑量進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 順鉑注射對不同周齡小鼠生存率的影響

順鉑注射第42天時，8周齡小鼠的生存率為90.0%，12周齡小鼠生存率為37.5%，16周齡小鼠生存率為0。因此，選用8周齡小鼠進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 順鉑注射對腎功能的影響

實驗1組、實驗2組小鼠血清Scr和BUN水平較對照組顯著升高，實驗2組小鼠血清Scr和BUN水平較實驗1組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.05、41.89，P<0.01）。見表2。

2.4 順鉑注射對腎纖維化的影響

2.4.1 MT染色 實驗1組和實驗2組小鼠腎小球和腎小管間質(zhì)均發(fā)現(xiàn)膠原纖維沉積，以小管間質(zhì)程度更重，可見腎間質(zhì)增寬以及炎性細(xì)胞聚集。實驗1組藍(lán)染膠原纖維少，實驗2組藍(lán)染膠原纖維比實驗1組顯著增多。見圖1。對小鼠腎纖維化程度進(jìn)行定量檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗1組和實驗2組小鼠腎纖維化面積顯著增加，實驗2組腎纖維化面積則較實驗1組顯著增加（F=78.87，P<0.01）。見表3。

2.4.2 Col1α1和Fn mRNA及蛋白表達(dá)水平變化

與對照組相比，實驗1組和實驗2組小鼠腎組織中Col1α1和Fn mRNA表達(dá)水平明顯升高，且實驗2組二者水平比實驗1組更高（F=37.01、57.10，P<0.01）。見表3。IF染色結(jié)果顯示，對照組Col1α1和Fn基本無陽性信號，實驗1組陽性信號增多不明顯，但實驗2組陽性信號顯著增多。見圖1。

2.5 順鉑注射對腎臟炎癥反應(yīng)的影響

HE染色結(jié)果顯示，實驗1組和實驗2組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，小管擴(kuò)張，小管刷狀緣部分脫落和壞死，大量白細(xì)胞浸潤;相較于實驗1組，實驗2組炎性細(xì)胞浸潤顯著增多。IF結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗1組和實驗2組CD3+T細(xì)胞和F4/80+巨噬細(xì)胞浸潤增多，以實驗2組更加明顯。見圖2。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗1組和實驗2組小鼠腎組織炎癥相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）mRNA表達(dá)水平顯著升高，且實驗2組IL-1β、MCP-1和TNF-α mRNA的表達(dá)水平比實驗1組更高（F=10.24～86.82，P<0.01）。見表4。

3 討論

CKD發(fā)生發(fā)展過程中，伴隨持續(xù)的腎功能和結(jié)構(gòu)改變，腎小球濾過及腎小管重吸收、排泄功能均發(fā)生不同程度障礙。腎纖維化，尤其是腎小管間質(zhì)纖維化是所有腎臟疾病最終導(dǎo)致慢性腎衰竭的共同途徑[10]。臨床上順鉑化療引起的腎毒性一直是個棘手的問題。因此，探尋一個好的動物模型來模擬臨床上順鉑導(dǎo)致的CKD，對于研究順鉑長期腎毒性的機(jī)制尤為重要。

本研究采用反復(fù)低劑量順鉑注射的方法構(gòu)建小鼠CKD模型。首先本研究根據(jù)文獻(xiàn)報道對小鼠注射9 mg/kg的順鉑（每周1次，共4次）[11]，結(jié)果顯示注射第24天時小鼠的存活率僅為10%，而將順鉑劑量降低為7 mg/kg，則注射第24天時小鼠的存活率達(dá)100%，故選取7 mg/kg作為合適的注射劑量。另外，有研究表明，小鼠周齡因素和順鉑誘導(dǎo)的腎毒性具有相關(guān)性[12]。故本研究對不同周齡小鼠進(jìn)行7 mg/kg順鉑注射，結(jié)果顯示，8、12、16周齡小鼠注射第42天時的存活率分別為90.0%、37.5%和0，因此選用8周齡小鼠進(jìn)行后續(xù)實驗。順鉑注射第24、42天時，小鼠血清Scr和BUN水平顯著升高，說明腎功能嚴(yán)重受損。進(jìn)一步觀察腎組織的病理變化，MT染色結(jié)果顯示，在順鉑注射第24、42天時，小鼠腎纖維化明顯，且第42天時的纖維化程度顯著高于第24天。與此同時，在順鉑所致的CKD模型中，炎性細(xì)胞浸潤明顯，尤其是CD3+T細(xì)胞以及F4/80+巨噬細(xì)胞浸潤明顯增強(qiáng)，部分細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α）水平顯著升高。上述實驗結(jié)果在一定程度上說明腎臟慢性炎癥與腎纖維化和腎功能障礙有著密切聯(lián)系。

既往大多數(shù)研究結(jié)果表明，順鉑腎毒性急性期伴隨著大量炎性細(xì)胞浸潤和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平升高[13-14]，但尚未明確順鉑腎毒性慢性期慢性炎癥和腎纖維化的關(guān)系[15]。本研究通過小鼠腎臟HE染色和炎性細(xì)胞IF檢測證實，雄性C57BL/6小鼠順鉑注射后，腎臟炎癥細(xì)胞浸潤程度和腎纖維化程度具有一定相關(guān)性。

本研究構(gòu)建的CKD小鼠模型與有關(guān)文獻(xiàn)報道的模型相比有一定的優(yōu)勢。首先，從注射劑量來看，有研究注射10、15 mg/kg順鉑導(dǎo)致小鼠生存率過低[16]，無法保證實驗研究順利進(jìn)行，而本研究使用7 mg/kg劑量順鉑，小鼠耐受性高，注射第42天時生存率能夠達(dá)到90%，可以保證實驗順利進(jìn)行。其次，從順鉑注射次數(shù)來看，有研究結(jié)果顯示，注射1次、2次誘導(dǎo)的腎纖維化不明顯[17]，而本研究采用4次注射較易誘導(dǎo)出明顯的腎纖維化。有文獻(xiàn)報道，7 mg/kg劑量順鉑注射在第24天時不能誘導(dǎo)出明顯的腎纖維化[11]。本研究結(jié)果顯示，順鉑注射第24天時腎纖維化程度輕微，當(dāng)時間延長至第42天時，腎纖維化非常明顯，與部分研究造模時間長達(dá)數(shù)月相比，極大提高了構(gòu)建模型的效率[18]。

綜上所述，低劑量順鉑反復(fù)注射（7 mg/kg，每周1次，共4次）既能保證小鼠生存率，又能較好地引起腎纖維化，且在病變過程中伴隨著較強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和一定程度的腎功能障礙。此模型能夠很好地模擬臨床上順鉑導(dǎo)致的CKD，能夠為順鉑導(dǎo)致腎損傷的研究提供簡便可靠的動物實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

[參考文獻(xiàn)]

[1]ZOCCALI C， VANHOLDER R， MASSY Z A， et al. The systemic nature of CKD[J].Nature Reviews Nephrology， 2017，13（6）：344-358.

[2]FU Y， TANG C Y， CAI J， et al. Rodent models of AKI-CKD transition[J]. American Journal of Physiology Renal Physiology， 2018，315（4）：F1098-F1106.

[3]S NCHEZ-GONZ LEZ P D， L PEZ-HERN NDEZ F J， L PEZ-NOVOA J M， et al. An integrative view of the pathophysiological events leading to cisplatin nephrotoxicity[J].Critical Reviews in Toxicology， 2011，41（10）：803-821.

[4]SANTOS N A G， CARVALHO RODRIGUES M A， MARTINS N M， et al. Cisplatin-induced nephrotoxicity and targets of nephroprotection： an update[J].Archives of Toxicology， 2012，86（8）：1233-1250.

[5]謝立平. 順鉑腎毒性早期發(fā)病機(jī)理的初步研究[J].實用腫瘤雜志， 1996（6）：268-270.

[6]BLACK L M， LEVER J M， TRAYLOR A M， et al. Divergent effects of AKI to CKD models on inflammation and fibrosis[J].American Journal of Physiology Renal Physiology， 2018，315（4）：F1107-F1118.

[7]AL ZA’ABI M， AL SALAM S， AL SULEIMANI Y， et al. Effects of repeated increasing doses of cisplatin as models of acute kidney injury and chronic kidney disease in rats[J].Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology， 2021，394（2）：249-259.

[8]MOGHADASALI R， HAJINASROLLAH M， ARGANI H， et al. Autologous transplantation of mesenchymal stromal cells tends to prevent progress of interstitial fibrosis in a rhesus Macaca mulatta monkey model of chronic kidney disease[J].Cytotherapy， 2015，17（11）：1495-1505.

[9]方薇. Gpr97在急性腎損傷中的作用及機(jī)制研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)， 2018.

[10]KUNCIO G S， NEILSON E G， HAVERTY T. Mechanisms of tubulointerstitial fibrosis[J].Kidney International， 1991，39（3）：550-556.

[11]SEARS S M， SHARP C N， KRUEGER A， et al. C57BL/6 mice require a higher dose of cisplatin to induce renal fibrosis and CCL2 correlates with cisplatin-induced kidney injury[J].American Journal of Physiology Renal Physiology， 2020，319（4）：F674-F685.

[12]ESPANDIARI P， ROSENZWEIG B， ZHANG J， et al. Age-related differences in susceptibility to cisplatin-induced renal toxicity[J].Journal of Applied Toxicology： JAT， 2010，30（2）：172-182.

[13]TAN R Z， LIU J， ZHANG Y Y， et al. Curcumin relieved cisplatin-induced kidney inflammation through inhibiting Mincle-maintained M1 macrophage phenotype[J].Phytomedicine： International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology， 2019，52：284-294.

[14]CANO-PE ALVER J L， GRIERA M， GARCA-JEREZ A， et al. Renal integrin-linked kinase depletion induces kidney cGMP-axis upregulation： consequences on basal and acutely damaged renal function[J].Molecular Medicine （Cambridge， Mass）， 2016，21（1）：873-885.

[15]SHARP C N， DOLL M， DUPRE T V， et al. Moderate aging does not exacerbate cisplatin-induced kidney injury or fibrosis despite altered inflammatory cytokine expression and immune cell infiltration[J].American Journal of Physiology Renal Physiology， 2019，316（1）：F162-F172.

[16]GO R S， ADJEI A A. Review of the comparative pharmacology and clinical activity of cisplatin and carboplatin[J].Journal of Clinical Oncology， 1999，17（1）：409.

[17]SU H， YE C， LEI C T， et al. Subcellular trafficking of tubular MDM2 implicates in acute kidney injury to chronic kidney disease transition during multiple low-dose cisplatin exposure[J].FASEB Journal， 2020，34（1）：1620-1636.

[18]陸斯斯. 單次臨床劑量順鉑誘導(dǎo)大鼠腎間質(zhì)纖維化及金納多注射液對其改善作用的研究[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)， 2018.

（本文編輯 馬偉平）