李樹力，李金澤，郭 振，3，朱文艷，3，周連群，3*，張芷齊，3*

（1. 上海大學(xué) 通信與信息工程學(xué)院，上海200444；2. 中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所 中國(guó)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州215163；3. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽 合肥230026）

1 引 言

數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digital Polymerase Chain Reaction，dPCR）技術(shù)在循環(huán)腫瘤DNA 檢測(cè)、稀有突變檢測(cè)和拷貝數(shù)變異分析等核酸定量分析中有著廣泛的應(yīng)用［1-2］。1999 年，Kinzler 和Vogelstein 等 提 出 了 數(shù) 字PCR 的 概 念［3］。 數(shù) 字PCR 實(shí)驗(yàn)包含3 個(gè)環(huán)節(jié)，即樣本的分散、PCR 擴(kuò)增、熒光信號(hào)的采集與數(shù)據(jù)分析。 在數(shù)據(jù)分析時(shí)，利用泊松分布可以精確計(jì)算得到原始樣本的模板拷貝數(shù)［4-5］。影響最終結(jié)果的關(guān)鍵在于對(duì)熒光信號(hào)的采集與處理，即讀取各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)并判斷其陰性或陽性。

隨著光刻與MEMS 技術(shù)的發(fā)展［6］，芯片式數(shù)字PCR 得以廣泛應(yīng)用，解決了微升級(jí)樣品到納升級(jí)反應(yīng)單元的精準(zhǔn)化分問題［7］。 芯片式數(shù)字PCR 相比于液滴式數(shù)字PCR，圖像信息獲取更方便。數(shù)字PCR 芯片圖像的特征是由大量的形狀類似的樣點(diǎn)組成的陣列，它們之間的排列一般都是規(guī)則的，處理這種微陣列圖像一般有三個(gè)步驟：樣點(diǎn)定位、樣點(diǎn)分割和信號(hào)強(qiáng)度提?。?-10］。其中，樣點(diǎn)定位是微陣列圖像分析中最基本、最重要的步驟，準(zhǔn)確的樣點(diǎn)定位大大提高了后續(xù)分割與量化步驟的效率。Saeid 等［11］提出一種局部閾值網(wǎng)格化的方法。Nguyen 等［12］提出一種基于小波檢測(cè)、主動(dòng)輪廓分割的方法。李鐵軍等［13］利用一種基于四階矩陣的對(duì)比度增強(qiáng)的方法，提高樣點(diǎn)定位的準(zhǔn)確性。Belean 等［14］提出一個(gè)基于偏微分方程的微陣列網(wǎng)格對(duì)齊的方法。牟穎等［15］使用最大類間方差法來提取信息。這些方法均基于投影法，容易實(shí)現(xiàn)，加以改進(jìn)也可以達(dá)到不錯(cuò)的定位結(jié)果，但是它們只適用于矩形排列方式的微陣列芯片圖像。而近些年，出現(xiàn)了一些類似蜂窩狀的六邊形排布方式的數(shù)字PCR 芯片［16］。與矩形網(wǎng)格相比，蜂窩狀網(wǎng)格在芯片上的利用率更高，在相同的面積里，蜂窩狀的排布方式可以設(shè)計(jì)更多的樣點(diǎn)位。對(duì)于這種非正交排列的陣列圖像，投影法無法分隔所有的樣點(diǎn)。Genpix［17］和ScanAlyze［18］等軟件包使用固定模板的方法，預(yù)先設(shè)置了幾種不同排布方式的模板，分析數(shù)據(jù)前，讓用戶手動(dòng)選擇，然后將模板對(duì)準(zhǔn)嵌套在采集到的芯片圖像上，利用設(shè)定好的坐標(biāo)定位每個(gè)樣點(diǎn)的位置。這種方法的局限性在于：圖片處理中需要人工參與，無法處理和預(yù)設(shè)模板排列方式不同的芯片。 Giannakeas 等［19］提出了一個(gè)生長(zhǎng)同心六邊形算法，利用Voronoi 圖［20］對(duì)樣點(diǎn)定位。這種方法可以處理蜂窩狀排布方式的芯片圖像，但是由于是逐點(diǎn)定位，計(jì)算量過于龐大，不適用于處理數(shù)據(jù)量大的數(shù)字PCR 芯片圖像［21-22］。由相機(jī)拍攝采集到的芯片圖像除了存在光照分布不均勻的問題，其樣點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度一般也非常低，這導(dǎo)致圖像整體灰度值集中在一個(gè)比較低的范圍，信號(hào)與背景的對(duì)比度低。如果不進(jìn)行特定的運(yùn)算處理，直接采用全局固定閾值分割的方法，無法準(zhǔn)確地分割出每個(gè)有效樣點(diǎn)。有一些方法對(duì)圖像對(duì)比度進(jìn)行了改進(jìn)［23］，其中最簡(jiǎn)單和有用的是自適應(yīng)直方圖均衡化方法［24］。然而，這些方法都試圖將原始圖像分割成小塊并調(diào)節(jié)增強(qiáng)程度，必然涉及到參數(shù)設(shè)置和閾值搜索，信號(hào)和亮度會(huì)被破壞。

針對(duì)目前任意排布方式的數(shù)字PCR 芯片，本文提出基于形態(tài)學(xué)的三通道蜂窩狀熒光圖像樣點(diǎn)尋址算法及數(shù)字PCR 圖像信息提取方法。該方法包含三通道圖像配準(zhǔn)、樣點(diǎn)的尋址定位（Automatic Hexagon Microarray Addressing Algorithm，AHMAA）、樣點(diǎn)分割、信息提取以及對(duì)樣點(diǎn)的篩選，能夠快速、準(zhǔn)確地獲取芯片多個(gè)通道的信息。

2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采用Applied Biosystems?QuantStudio ?3D的數(shù)字PCR 芯片［25］。該芯片是一種基于硅基基片的表面疏水孔壁親水的毛細(xì)管微陣列芯片，使用硅基底板制造并在其上蝕刻有約20 000 個(gè)大小均一的微米級(jí)反應(yīng)孔。芯片上的微孔以蜂窩狀網(wǎng)格的方式排列，微孔直徑為60 μm，孔間隔15 μm，結(jié)構(gòu)如圖1 所示。使用數(shù)字PCR 檢測(cè)系統(tǒng)在明場(chǎng)下拍攝芯片整體圖像，芯片尺寸為10 mm×10 mm，其中局部放大部分是使用掃描電鏡拍攝的芯片圖像，可以清晰地觀察到六邊形結(jié)構(gòu)。

PCR 實(shí)驗(yàn)使用到的試劑主要有質(zhì)粒DNA（生工生物工程股份有限公司），TaqManTMLiquid Biopsy dPCR Assay（Thermofisher），Quant-Studio ?3D Digital PCR Master Mix（Thermofisher）等。

芯片圖像由本實(shí)驗(yàn)室自主研制的數(shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng)采集。本系統(tǒng)主要基于CMOS 成像原理，有多個(gè)熒光通道，可同時(shí)采集多個(gè)通道的熒光信號(hào)。本文使用的數(shù)據(jù)是5 塊不同的PCR 芯片 ，分 別 在FAM ，VIC ，ROX（校 正）3 個(gè) 通 道采集圖片，每張圖片的規(guī)格為8 位2 048×2 448 pixel。

圖1 數(shù)字PCR 芯片結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of digital PCR chip

3 圖像處理

為了快速準(zhǔn)確地處理三通道蜂窩狀堆疊的微孔陣列芯片圖像，本文提出基于形態(tài)學(xué)的三通道蜂窩狀熒光圖像樣點(diǎn)尋址算法及數(shù)字PCR 圖像信息提取方法。圖2 展示了本文的整個(gè)數(shù)字PCR 芯片圖像處理流程。

該方法主要分為四個(gè)步驟，第一步：三通道的圖像配準(zhǔn)，針對(duì)不同通道的圖像進(jìn)行配準(zhǔn)融合，使樣點(diǎn)排布整齊；第二步：樣點(diǎn)尋址（AHMAA），通過增強(qiáng)圖像的對(duì)比度，選取有效樣點(diǎn)區(qū)域，基于改進(jìn)伽馬算法去除光照分布不均效應(yīng)，基于形態(tài)學(xué)算法對(duì)緊密排列樣點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，對(duì)微陣列芯片圖像進(jìn)行單元定位；第三步：樣點(diǎn)分割，以樣點(diǎn)坐標(biāo)為中心，選擇符合樣點(diǎn)結(jié)構(gòu)形狀的區(qū)域作為信息提取的區(qū)域；第四步：樣點(diǎn)的信息提取，提取每個(gè)樣點(diǎn)的生物分子熒光信息。

圖2 數(shù)字PCR 微陣列熒光圖像信息提取流程Fig. 2 Flow chart for information extraction of digital PCR microarray fluorescence image

3.1 三通道圖像配準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的數(shù)字PCR 圖像采集系統(tǒng)可以同時(shí)采集芯片在3 個(gè)不同波段的熒光圖像，為了同時(shí)獲取多個(gè)通道的圖片信息，本文將不同通道的圖片進(jìn)行融合處理。由于圖像采集系統(tǒng)中存在光學(xué)誤差，同一個(gè)樣點(diǎn)在不同通道里的位置并不是完全重合的，有幾個(gè)像素的偏差，進(jìn)而導(dǎo)致后續(xù)獲取樣點(diǎn)數(shù)據(jù)的不準(zhǔn)確。為了解決這一問題，本文采用了基于互信息的多模態(tài)圖像配準(zhǔn)方法，將不同通道的樣點(diǎn)對(duì)齊?；バ畔⒘慷仁怯糜跍y(cè)量?jī)蓚€(gè)變量之間的相關(guān)性的信息理論技術(shù)。算法使用來自兩個(gè)圖像的像素采樣的聯(lián)合概率分布來測(cè)量一組像素的值映射到另一圖像中的相似值的確定性，該信息是圖像相似程度的定量度量。高互信息意味著兩個(gè)分布之間的不確定性（熵）大大降低，表明圖像更好地被配準(zhǔn)［26］。

3.2 樣點(diǎn)尋址

圖像配準(zhǔn)完成后，得到一張包含多個(gè)通道信息的融合圖片，由于多個(gè)通道的圖像已經(jīng)配準(zhǔn)，所以對(duì)其中一個(gè)通道的圖像做尋址，得到樣點(diǎn)坐標(biāo)可以直接用于其他通道的圖像。為了準(zhǔn)確地定位樣點(diǎn)，針對(duì)芯片圖像存在的問題，本文對(duì)圖像進(jìn)行了以下幾步處理：

（1）提高圖像整體對(duì)比度，選擇ROI；

（2）去除光照不均影響；

（3）增強(qiáng)樣點(diǎn)孔內(nèi)外的對(duì)比度、二值化；

（4）計(jì)算統(tǒng)計(jì)樣點(diǎn)的位置信息。

圖像采集系統(tǒng)采集到的芯片圖像，除了芯片部分，還包含了芯片載具的部分，需要將芯片以外的部分都去掉。本文在提取邊緣之前，先對(duì)圖像直方圖進(jìn)行均值化處理，增強(qiáng)芯片區(qū)域與背景之間的對(duì)比度；然后，模糊處理，去除芯片區(qū)域內(nèi)細(xì)小邊緣的干擾；最后邊緣提取，得到準(zhǔn)確的外邊界。

針對(duì)上一步提取的芯片主體區(qū)域，本文使用基于形態(tài)學(xué)的方法，去除芯片內(nèi)部的連通區(qū)域；采用多次提取邊緣并減去的方法，將整個(gè)芯片主體區(qū)域的邊緣部分去掉。最終得到只含有有效樣點(diǎn)的區(qū)域，作為下一步處理的感興趣區(qū)域（Region of Interest，ROI）。

在采集芯片圖像的過程中，由于受到激發(fā)光源大小、鏡頭視野等外部因素的影響，芯片上的光照不均勻，主要表現(xiàn)為芯片中間區(qū)域的光照強(qiáng)度比芯片邊緣區(qū)域的光照強(qiáng)度更高［27］。這會(huì)導(dǎo)致樣點(diǎn)的分割結(jié)果不理想，陰陽性樣點(diǎn)的分類結(jié)果不準(zhǔn)確等問題。

本文使用改進(jìn)的基于二維γ 函數(shù)的光照校正算法來校正芯片的光照分布。該算法的主要思想是提取圖片的光照分量信息，通過校正使得光照過亮的區(qū)域整體亮度降低，光照過暗的地方亮度得到提高，提升整塊芯片的光照亮度均勻性。為了防止直接在RGB 3 個(gè)通道做校正導(dǎo)致圖像色彩失真，選擇在HSV 色彩空間進(jìn)行處理［26］，其中色調(diào)（H）、飽和度（S）、亮度（V）是相互獨(dú)立的。

算法主要步驟如下：

（1）輸入芯片圖像IRGB，將圖像從RGB 空間轉(zhuǎn)化到HSV 空間IHSV，單獨(dú)對(duì)亮度（V）處理；

（2）多尺度高斯卷積，賦予不同尺度不同的權(quán)值，得到芯片圖像的光照分量（gaus）；

（3）根據(jù)二維γ函數(shù)公式校正，得到校正后的亮度（V ′）；

（4）將校正后的亮度（V ′）與原圖的色調(diào)（H）、飽和度（S）重新合成，得到新的圖像I ′HSV；

（5）將圖像從HSV 空間轉(zhuǎn)化到RGB 空間，得到I ′RGB。

二維γ函數(shù)公式為：

為了增強(qiáng)樣點(diǎn)與周圍環(huán)境，即芯片上孔內(nèi)外的對(duì)比度，本文提出一種基于頂帽變換與底帽變換增強(qiáng)對(duì)比度的算法。頂帽變換與底帽變換都是基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的圖像處理方法［28］。

灰度圖像f的頂帽變換定義為f減去其開運(yùn)算結(jié)果，即：

在設(shè)置合適尺寸的構(gòu)造元素后，可以得到比較理想的孔內(nèi)與孔外的圖像信息。在得到頂帽與底帽變換之后的圖像后，將二者做差，可以大幅增強(qiáng)樣點(diǎn)孔內(nèi)與孔外的對(duì)比度。這種方法可以保證只有樣點(diǎn)被增強(qiáng)，而不受噪聲的干擾。

對(duì)上一步結(jié)果進(jìn)行二值化處理，去掉面積過小與過大的連通域，得到一幅包含所有有效樣點(diǎn)的二值化點(diǎn)陣。計(jì)算統(tǒng)計(jì)所有連通域的中心點(diǎn)的坐標(biāo)，將它作為樣點(diǎn)的位置信息，至此樣點(diǎn)的尋址定位步驟完成。

3.3 樣點(diǎn)分割

理論上，微孔陣列芯片的每個(gè)樣點(diǎn)孔都有固定的空間結(jié)構(gòu)和形狀，而使用AHMAA 算法得到的定位結(jié)果是每個(gè)樣點(diǎn)的中心點(diǎn)。當(dāng)我們得到了每個(gè)樣點(diǎn)的中心坐標(biāo)，則以定位點(diǎn)坐標(biāo)為中心，劃取一個(gè)樣點(diǎn)大小的正六邊形區(qū)域作為信息采集區(qū)域。這種直接分割的方法比先網(wǎng)格化定位，再對(duì)所有網(wǎng)格小碎片里的樣點(diǎn)分割的方法更快速、準(zhǔn)確。

3.4 信息提取

計(jì)算每個(gè)六邊形區(qū)域內(nèi)所有像素點(diǎn)的均值，作為樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度值。統(tǒng)計(jì)得到所有樣點(diǎn)的熒光信號(hào)值后，本文采用基于K 均值的分類方法對(duì)數(shù)據(jù)分類，得到芯片的陰陽性點(diǎn)數(shù)目信息。

4 結(jié)果與討論

圖3 是通過AHMAA 算法最終定位的結(jié)果。圖中視野內(nèi)所有樣點(diǎn)無論是陽性還是陰性，都被成功地識(shí)別并準(zhǔn)確地分割出來。

圖3 樣點(diǎn)定位結(jié)果Fig. 3 Result of spot addressing

圖4 展示了熒光通道1 與熒光通道2（FAMvs. VIC）的二維聚類散點(diǎn)圖。根據(jù)計(jì)算得出的閾值將圖像分為4 個(gè)象限，并將樣點(diǎn)分為4 類，分別代表FAM 陽性與VIC 陰性、FAM 陽性與VIC陽 性 、FAM 陰 性 與VIC 陰 性 、FAM 陰 性 與VIC陽性。

圖4 二維聚類散點(diǎn)Fig. 4 Two-dimensional clustering scatter plots

4.1 三通道圖像配準(zhǔn)

由于沒有一個(gè)準(zhǔn)確描述兩幅圖像對(duì)齊性的量，因此很難對(duì)配準(zhǔn)結(jié)果進(jìn)行定量分析。通常通過可視化的結(jié)果來定性地判斷配準(zhǔn)效果。圖5 顯示了三通道融合圖像配準(zhǔn)前后的效果（彩圖見期刊電子版）。在配準(zhǔn)前，由紅色和綠色代表的兩張不同通道的圖片有明顯的錯(cuò)位現(xiàn)象，導(dǎo)致同一個(gè)樣點(diǎn)在不同通道圖片上的坐標(biāo)位置不同；配準(zhǔn)后，綠色的圓圈與紅色的圓重合了。

4.2 對(duì)比度增強(qiáng)的作用

為了提取芯片的主體區(qū)域，需要準(zhǔn)確地識(shí)別芯片的邊緣范圍，直接使用傳統(tǒng)的邊緣提取方法，會(huì)受到大量的樣點(diǎn)邊緣信息干擾。所以，需要先提高圖像的整體對(duì)比度。

圖5 三通道芯片的圖像配準(zhǔn)Fig. 5 Image registration of multi-channel chip

圖6 展示了整體對(duì)比度增強(qiáng)前后，圖片的灰度直方圖分布。原圖的灰度值集中在0～100，圖片整體亮度非常暗，而且?guī)缀醴直娌怀鲂酒瑓^(qū)域的邊界；處理后圖片的灰度值均勻地分布在0～255，邊界非常明顯，為后續(xù)ROI 的提取打下了很好的基礎(chǔ)。

4.3 光照不均勻?qū)Y(jié)果的影響

在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常遇到一些光照不均勻的圖片，如果不加以處理，則會(huì)對(duì)后續(xù)樣點(diǎn)的識(shí)別和定位有很大影響；除此之外，光照不均也會(huì)對(duì)獲取到的樣點(diǎn)信號(hào)值有影響，導(dǎo)致亮度高的區(qū)域信號(hào)值偏高，影響陰陽性分類結(jié)果。

圖7 顯示了去除光照不均影響前后的差別，圖7（a）是待處理的圖片，圖7（b）是沒有經(jīng)過處理的圖像分割結(jié)果，可以從放大的局部細(xì)節(jié)7（e），7（f）中看到，在原圖中過暗或過亮的區(qū)域，都無法很好地分割和識(shí)別樣點(diǎn)。圖7（c）是圖7（a）的光照分量圖，在做了去除光照不均的處理后，分割結(jié)果如圖7（d）所示，可以觀察到局部細(xì)節(jié)圖7（g）和圖7（h），分割結(jié)果得到了很好的改善。

4.4 去除無效樣點(diǎn)的必要性

圖6 灰度直方圖Fig. 6 Gray histograms

圖7 去除光照不均影響前后圖像的分割效果Fig. 7 Segmentation results before and after removing effects of uneven illumination

實(shí)驗(yàn)中，芯片上經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)如圖8 中的連通區(qū)塊。這導(dǎo)致大片的樣點(diǎn)呈陽性表征，這些點(diǎn)就是典型的偽陽性點(diǎn)，會(huì)對(duì)后續(xù)生物學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果產(chǎn)生巨大的誤差，所以在芯片圖像處理的過程中，需要去除掉這一部分的點(diǎn)。使用本文提出的算法可以有效地去除這些點(diǎn)。圖8 中顯示的是2 組圖片，其中，（a），（c）是采集到的原圖，（b），（d）是最終選擇的點(diǎn)的區(qū)域，可以清楚地看到，箭頭標(biāo)記的問題區(qū)域被識(shí)別并去除了。

4.5 定位時(shí)間及精度

圖8 去除無效的樣點(diǎn)Fig. 8 Removal of invalid spots

為了驗(yàn)證算法的定位效率，本文在一塊完整的數(shù)字PCR 芯片上隨機(jī)截取4 組局部圖片，每組圖片分別有100 張，4 組圖片分別含有約10 個(gè)，100 個(gè)，1 000 個(gè)，10 000 個(gè)樣點(diǎn)。對(duì)每張圖片，分別用Voronoi 定位方法與本文提出的AHMAA定位算法進(jìn)行計(jì)算，得出每張圖片運(yùn)算的時(shí)間，并對(duì)每組數(shù)據(jù)計(jì)算其均值與標(biāo)準(zhǔn)差，畫出圖9 的誤差條形圖。當(dāng)計(jì)算約有10 個(gè)樣點(diǎn)的圖片時(shí)，Voronoi 耗 時(shí) 約0. 297 s，AHMAA 耗 時(shí) 約0. 022 s；當(dāng)計(jì)算約有100 個(gè)樣點(diǎn)的圖片時(shí)，Voronoi 耗時(shí)約0. 968 s，AHMAA 耗時(shí)約0. 028 s；當(dāng)計(jì)算約有1 000 個(gè)樣點(diǎn)的圖片時(shí)，Voronoi 耗時(shí)約17. 099 s，AHM AA 耗 時(shí) 約0. 100 s；當(dāng) 計(jì) 算 約 有10 000 個(gè)樣點(diǎn)的圖片時(shí)，Voronoi 耗時(shí)約1 230. 163 s，AHMAA 耗時(shí)約0. 649 s。

圖10 樣點(diǎn)間距的一致性Fig. 10 Consistency of distance between spots

圖9 樣點(diǎn)定位耗時(shí)對(duì)比Fig. 9 Comparison of spots location time

為了探究算法定位的準(zhǔn)確性，本文計(jì)算了樣點(diǎn)之間的距離。 理論上，對(duì)于精加工的微孔芯片，每個(gè)相鄰孔之間的距離都是固定的，而實(shí)際上，通過光學(xué)系統(tǒng)拍攝得到圖像上樣點(diǎn)的間距也是不會(huì)有太大誤差的。所以，如果通過本文的算法計(jì)算得出的樣點(diǎn)位置坐標(biāo)足夠精確，由此計(jì)算得出的樣點(diǎn)之間的距離應(yīng)該也是一個(gè)相對(duì)固定的值。

如圖10 所示，在芯片中間區(qū)域隨機(jī)選取了1 000 片方形碎片，每塊碎片都包含約20 個(gè)樣點(diǎn)，使用AHMAA 算法取得每個(gè)樣點(diǎn)的位置信息，計(jì)算得出這20 個(gè)點(diǎn)與點(diǎn)之間的歐式距離。在這樣的小碎片中，點(diǎn)與點(diǎn)之間大約有24 種不同的距離。其中，相鄰點(diǎn)之間的距離最短，對(duì)角線兩端兩個(gè)點(diǎn)之間的距離最長(zhǎng)。本文計(jì)算統(tǒng)計(jì)了所有的距離，然后將這1 000 塊碎片的相同距離的數(shù)據(jù)放在一起，計(jì)算每種距離的CV 值。最后得出結(jié)果，CV 值最大的是相鄰點(diǎn)之間的距離，為2. 69%，間隔一個(gè)點(diǎn)之間的距離CV 值為1. 43%，隨著距離的增大，CV 值逐漸減小。 圖10（b）是截取的前10 組距離的CV 值。 為了驗(yàn)證最終采集數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本文對(duì)5 張數(shù)字PCR芯片樣品，分別使用標(biāo)準(zhǔn)儀器系統(tǒng)軟件和本實(shí)驗(yàn)室自行研制的圖像采集系統(tǒng)及AHMAA 算法處理，得到有效填孔數(shù)與拷貝數(shù)，結(jié)果如表1～表2 所 示 。 這5 張 芯 片 中 ，編 號(hào) 為C0HGWS、C0HS51 的只含有FAM 染料，編號(hào)為C0HY06的只含有VIC 染料，編號(hào)為C0HUN8、C0I6MQ的是同時(shí)含有FAM 與VIC 染料的芯片。 與標(biāo)準(zhǔn)儀器的結(jié)果相比，通過AHMAA 算法處理得出的有效填孔數(shù)目結(jié)果的誤差率在0. 35%～3. 03%，平均相差 1. 208%，準(zhǔn)確率達(dá)到98. 792%；計(jì)算得到的拷貝數(shù)與之相比，誤差率在0. 57%～8. 31%，平均誤差率為3. 8%，準(zhǔn)確率達(dá)到96. 2%。

表2 拷貝數(shù)Tab. 2 Number of copies

表1 有效填孔數(shù)Tab. 1 Effective number of holes to be filled

5 結(jié) 論

為了解決蜂窩狀排列方式的數(shù)字PCR 芯片圖像對(duì)比度低、光照不均勻、樣點(diǎn)定位困難等問題，本文提出了基于形態(tài)學(xué)的圖像處理方法。該方法對(duì)一組包含約20 000 個(gè)樣點(diǎn)的數(shù)字PCR 芯片的三通道圖像，平均運(yùn)算時(shí)間約為20 s，定位最小樣點(diǎn)間距離誤差CV 值小于2. 69%。對(duì)5 組不同拷貝數(shù)的數(shù)字PCR 芯片，應(yīng)用AHMAA 算法處理統(tǒng)計(jì)得出的有效樣點(diǎn)數(shù)目結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)儀器［1］相比，誤差率在0. 35%～3. 03% 之間，平均相差1. 208%；計(jì)算得到的拷貝數(shù)相比，誤差率在0. 57%～8. 31%，平均誤差率為3. 8%。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文方法在樣點(diǎn)尋址的時(shí)候，使用了AHMAA 算法，可以準(zhǔn)確定位蜂窩狀排布方式的樣點(diǎn)，而其他方法使用基于投影法的算法，只能對(duì)矩形排布方式的樣點(diǎn)進(jìn)行尋址定位。與Voronoi 定位方法相比，處理相同數(shù)量樣點(diǎn)的圖片時(shí)，時(shí)間相差3 個(gè)數(shù)量級(jí)。 在計(jì)算的準(zhǔn)確度方面，與使用了預(yù)設(shè)模板的標(biāo)準(zhǔn)儀器相比，樣點(diǎn)識(shí)別數(shù)精度達(dá)到98. 79%，拷貝數(shù)計(jì)算準(zhǔn)確度達(dá)到96. 2%。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)蜂窩狀排布方式圖像的快速準(zhǔn)確處理，能在盡可能短的時(shí)間內(nèi)為用戶提供準(zhǔn)確的樣點(diǎn)熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，為后續(xù)拷貝數(shù)計(jì)算等生物統(tǒng)計(jì)學(xué)研究提供了精確的原始數(shù)據(jù)。