曾曉輝，盧帥，汪朝暉

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢430022

急性心肌梗死（AMI）是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的缺血性心臟病，盡管近十年在AMI 的預(yù)防及救治上獲得了進(jìn)步，但其發(fā)病率及病死率仍較高，全球每年有超過700 萬人受其影響［1］。目前 AMI 的發(fā)生主要是由于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂并形成血栓，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性堵塞，引起心肌細(xì)胞缺血壞死。AMI 發(fā)生后會引發(fā)心肌細(xì)胞壞死凋亡、梗死部位炎癥形成、心肌纖維化等一系列病理改變，嚴(yán)重降低患者心功能，同時(shí)伴隨心肌細(xì)胞再生、新生血管形成等代償修復(fù)過程。因此減少心肌細(xì)胞壞死凋亡、抑制心臟炎癥及心肌纖維化、促進(jìn)心臟自我修復(fù)是治療AMI 的關(guān)鍵。環(huán)狀RNA（circRNA）是一種具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的新型非編碼RNA，由于特殊的合成方式導(dǎo)致其不含5'末端帽子結(jié)構(gòu)和3'多聚腺苷酸尾結(jié)構(gòu)，因此circRNA 不易被核酸外切酶分解，在各類組織細(xì)胞中表達(dá)更加穩(wěn)定［2］。近年來隨著基因芯片、二代測序以及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，使得包括circRNA 在內(nèi)的一系列非編碼RNA 成為了研究熱點(diǎn)。大量研究證實(shí)，circRNA 可在生物體內(nèi)發(fā)揮重要生物學(xué)功能，在某些疾?。ˋMI、心力衰竭、心律失常等）的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［3］。circRNA 可作為心血管疾病的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本文對circRNA 的生物學(xué)功能及其在AMI 心肌損傷、修復(fù)中的作用進(jìn)行綜述。

1 circRNA概述

1.1 circRNA 的生物學(xué)特性 于20 世紀(jì)70 年代，circRNA 在植物感染的類病毒中被發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是由于反向剪接而產(chǎn)生［4］。1993 年，在哺乳動(dòng)物中偶然發(fā)現(xiàn)了 circRNA 的大量存在［5］。2012 年，隨著RNA 測序技術(shù)和生物信息學(xué)的逐漸成熟，真核生物中circRNA 的豐度和普遍性才得到認(rèn)可。circRNA的合成機(jī)制目前尚未完全闡明，通過反向剪接將下游的5'剪接位點(diǎn)與上游的3'剪接位點(diǎn)通過共價(jià)鍵連接形成外顯子環(huán)狀RNA［6］。由于其特殊的合成方式和生物學(xué)結(jié)構(gòu)，circRNA 主要具有以下生物學(xué)特性：①circRNA 廣泛表達(dá)于人類細(xì)胞中，其表達(dá)量是mRNA 的 10 倍以上［6］。②由于 circRNA 的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其被核酸酶降解的較少，比線性RNA 更穩(wěn)定。③絕大多數(shù)circRNA 序列在物種之間具有高度保守性［6-7］。④絕大多數(shù) circRNA 位于細(xì)胞質(zhì)中，只有小部分位于細(xì)胞核［8］。⑤其主要來自外顯子，其他一小部分來自內(nèi)含子或內(nèi)含子片段。⑥其表達(dá)通常具有細(xì)胞、組織以及發(fā)育階段特異性。

1.2 circRNA的主要生物學(xué)功能

1.2.1 充當(dāng)微小RNA（miRNA）的分子海綿 miR?NA 可與mRNA 的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，進(jìn)而抑制該mRNA 的翻譯。circRNA 的分子海綿作用是指其可作為競爭性內(nèi)源性RNA 與miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)互相結(jié)合，抑制miRNA 的生物活性，從而間接調(diào)控下游靶分子的表達(dá)。circRNA ciRS-7 是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)能作為 miRNA 分子海綿的環(huán)狀 RNA［9］，其與 miR-7 具有70多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，能夠有效降低miR-7的生物活性，增強(qiáng)其下游靶基因的表達(dá)。ZHENG 等［10］發(fā)現(xiàn)，circHIPK3可通過充當(dāng)miR-124和miR-193的分子海綿對癌細(xì)胞發(fā)揮生長調(diào)節(jié)作用。

1.2.2 參與RNA 轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié) 盡管絕大多數(shù)circRNA 位于細(xì)胞質(zhì)中，但也有少部分位于細(xì)胞核，參與 RNA 轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。ZHANG 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀內(nèi)含子RNA 在細(xì)胞核中表達(dá)豐富，可在核內(nèi)通過與磷酸化的RNA 聚合酶Ⅱ相互結(jié)合，使其轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生改變，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA 是一種保留內(nèi)含子的circRNA，定位于其親本基因的啟動(dòng)子附近，并可與RNA 聚合酶Ⅱ結(jié)合，通過與保留在內(nèi)含子中的5'剪接位點(diǎn)相互作用來提高轉(zhuǎn)錄效率，從而促進(jìn)其親本基因的表達(dá)［12］。

1.2.3 調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性 部分circRNA 還可調(diào)節(jié) mRNA 的穩(wěn)定性。HANSEN 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，來源于小腦變性相關(guān)蛋白1（CDR1）基因的環(huán)狀反義RNA 可與CDR1 的mRNA 形成雙鏈結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其穩(wěn)定性。另有研究表明，小鼠巨噬細(xì)胞中的circ-Ras?GEF1B 可增強(qiáng)細(xì)胞間黏附分子 1（ICAM-1）mRNA 的穩(wěn)定性，從而使LPS/TLR4 炎癥信號通路中ICAM-1的表達(dá)增加［14］。

1.2.4 通過與蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮功能 circRNA可通過與蛋白質(zhì)結(jié)合從而對RNA 結(jié)合蛋白（RBP）發(fā)揮招募、轉(zhuǎn)運(yùn)以及蛋白支架的作用，調(diào)節(jié)RBP 生物活性。DU 等［15］研究表明，在小鼠成纖維細(xì)胞中，環(huán)狀RNA circFoxo3 可與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（P21）結(jié)合，這種circFOXO3-p21-CDK2 三元復(fù)合物的形成會抑制CDK2功能，從而阻止細(xì)胞周期進(jìn)程。

1.2.5 具有蛋白翻譯功能 以往有觀點(diǎn)認(rèn)為，circRNA 作為一種非編碼RNA 無法翻譯成蛋白質(zhì)，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 也具備蛋白翻譯功能。第一個(gè)被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)具有蛋白翻譯功能的circRNA是一種存在于丙型肝炎病毒中的單鏈環(huán)狀RNA，可產(chǎn)生一種具有122 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)［16］。YANG等［17］鑒定了人成纖維細(xì)胞中circRNA 所翻譯的幾種多肽，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)腺苷被甲基化修飾時(shí)，起始密碼子上游的6-甲基腺嘌呤修飾的共有基序促進(jìn)circRNA的翻譯能力。另有研究證明，circZNF609 可在小鼠以及人成肌細(xì)胞中與多聚核糖體相互作用，以剪接依賴性和帽依賴性的方式進(jìn)行蛋白翻譯［18］。雖然circRNA 已被認(rèn)為具有一定的翻譯能力，但是目前發(fā)現(xiàn)由于受其特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)影響導(dǎo)致翻譯效率不高，且circRNA 的翻譯產(chǎn)物（蛋白質(zhì)及多肽）的功能尚不明確，有待于學(xué)者進(jìn)一步探究。

2 circRNA在AMI心臟損傷與修復(fù)中的作用

2.1 circRNA 在 AMI中的表達(dá)譜 LIN 等［19］利用芯片技術(shù)檢測了AMI 患者和正常人外周血中circRNA的表達(dá)，共得到266個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中121個(gè)表達(dá)上調(diào)、145 個(gè)表達(dá)下調(diào)。WU 等［20］利用基因芯片進(jìn)行了AMI 小鼠中circRNA 的表達(dá)譜分析，circRNA 芯片中共檢測到1 163個(gè)circRNA，其中差異表達(dá)的 circRNA 有 63 個(gè)，其中 29 個(gè)表達(dá)上調(diào)、34 個(gè)表達(dá)下調(diào)；從表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的circRNA 中各選擇了6 個(gè)在心肌組織樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果和芯片結(jié)果一致。用Tar?getScan 等在線數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測了與mmu_circRNA_013216 和 mmu_circRNA_010567 相關(guān)的 miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與mmu_circRNA_013216 相互作用的miRNA有 miR-181a-3p、miR-486a-5p 和 miR-486b-5p；與mmu_circRNA_010567相關(guān)性較大的miRNA 有miR-124、miR-141 和miR-200a。以上研究表明差異表達(dá)的circRNA可能在AMI的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。

2.2 circRNA 在AMI 心肌細(xì)胞凋亡中的作用 心肌細(xì)胞凋亡在AMI 心肌損傷中起重要作用，其凋亡的嚴(yán)重程度直接影響患者的心功能及預(yù)后，是AMI的重要病理特征。WANG 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，circRNA MFACR 在心肌缺血損傷后的細(xì)胞凋亡中具有重要作用；circRNA MFACR 可充當(dāng) miR-652-3p 的分子海綿抑制其活性，miR-652-3p 活性被抑制后有利于其下游靶分子線粒體三功能蛋白18（MTP18）表達(dá)上調(diào)。MTP18 能夠促進(jìn)細(xì)胞線粒體裂變和心肌梗死小鼠心肌細(xì)胞凋亡。由此可知，circRNA MFACR 可通過MFACR/miR-652-3p/MTP18 信號軸來促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞線粒體分裂和細(xì)胞凋亡。CAI 等［22］在AMI大鼠心肌中發(fā)現(xiàn)circ-Ttc3 表達(dá)顯著上調(diào)，利用重組腺相關(guān)病毒在大鼠體內(nèi)干擾circ-Ttc3 的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，心肌梗死大鼠的心功能障礙加重，同時(shí)TUNEL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circ-Ttc3 沉默后也加劇了心肌細(xì)胞的凋亡；而circ-Ttc3 表達(dá)上調(diào)能夠抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和半胱氨酸蛋白酶3 的表達(dá)，繼而抑制心肌細(xì)胞凋亡。隨后通過線數(shù)據(jù)庫預(yù)測以及熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，circ-Ttc3可作為miR-15b的競爭性內(nèi)源性RNA，通過上調(diào)其下游靶基因ADP-核糖基化樣因子2（Arl2）的表達(dá)來發(fā)揮心臟保護(hù)作用。Arl2 是一種小型三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白，可參與氧化磷酸化和ATP 的產(chǎn)生。提示circ-Ttc3 也可通過調(diào)節(jié)ATP 的生成從而減輕心肌細(xì)胞凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，AMI 心肌組織及體外缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circ_0068655表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的circ_0068655 能抑制細(xì)胞活力并促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，提示circ_0068655 在AMI 心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用［23］。

2.3 circRNA 在梗死后心肌纖維化中的作用 心肌纖維化是一種由于心肌成纖維細(xì)胞過度激活進(jìn)而引起細(xì)胞外大量纖維蛋白沉積的常見心臟病理改變，是AMI 心室重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一，可導(dǎo)致AMI患者心肌收縮和舒張功能障礙。心肌纖維化的形成機(jī)制復(fù)雜，目前關(guān)于AMI 心肌纖維化的機(jī)制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，circ_LAS1L 能夠抑制AMI 后心臟成纖維細(xì)胞的活化、增殖和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［24］；circ_LAS1L 可與 miR-125b 結(jié)合并抑制其活性，從而促進(jìn)其下游靶基因分泌型卷曲相關(guān)蛋白5（SFRP5）的表達(dá)，繼而減少α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、膠原纖維Ⅰ和膠原纖維Ⅲ的生成。表明circ_LAS1L 可 通 過 circ_LAS1L/miR-125b/SFRP5 軸來調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能。BAI 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 010567 對AMI 大鼠心肌纖維化具有調(diào)節(jié)作用；利用小干擾RNA 干擾大鼠AMI模型中circRNA 010567 的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，心肌梗死大鼠的心功能明顯改善，心肌纖維化減輕。干擾組大鼠心臟組織中的轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）表達(dá)也隨之下降，提示將circRNA 010567 沉默后可能通過抑制TGF-β1信號通路來減輕AMI 心肌纖維化。另有研究發(fā)現(xiàn)，AMI 小鼠中circNFIB 表達(dá)降低，將circNFIB過表達(dá)后可通過調(diào)控miR-433 來抑制心臟成纖維細(xì)胞的增殖，繼而減輕心肌纖維化。

2.4 circRNA 在 AMI 心臟修復(fù)中的作用 AMI 發(fā)生后機(jī)體會啟動(dòng)代償修復(fù)機(jī)制，對心臟結(jié)構(gòu)和功能喪失進(jìn)行一定程度的補(bǔ)救。其中，心肌細(xì)胞增殖和新生血管形成是AMI 心臟修復(fù)的兩個(gè)主要生物學(xué)過程，兩者之間的協(xié)同作用對心臟再生修復(fù)必不可少。SI 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，circHipk3 在胎兒和新生兒心臟中高表達(dá)；circHipk3 過表達(dá)可改善AMI 小鼠的心功能，同時(shí)促進(jìn)了梗死區(qū)心肌細(xì)胞增殖，并使得毛細(xì)血管密度增加，而心肌細(xì)胞凋亡和纖維化則有所減輕；進(jìn)一步研究circHipk3 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖的機(jī)制，通過RNA 下拉實(shí)驗(yàn)以及蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)circHipk3 可與Notch1 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（N1ICD）結(jié)合，敲低circHipk3 的表達(dá)后可降低N1ICD 蛋白表達(dá)，表明circHipk3 對心肌細(xì)胞增殖的作用可能通過調(diào)節(jié)N1ICD穩(wěn)定性來實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，WANG等［27］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞所分泌的外泌體環(huán)狀RNA circHIPK3 能夠調(diào)節(jié)AMI 后的心臟血管生成；circH?IPK3 可抑制 miR-29a 活性，而 miR-29a 可通過靶向血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）來抑制心臟內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移。因此circHIPK3 可通過miR-29a/VEGFA 信號軸來促進(jìn)心肌內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成；同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外泌體中的circHIPK3能夠使AMI 小鼠心臟梗死區(qū)的血管密度增加，促進(jìn)新生血管形成并改善了心肌纖維化。

circRNA 還可通過與蛋白質(zhì)直接結(jié)合來完成其對AMI 后心臟結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。GARIKIPATI等［28］在AMI 小鼠心臟以及缺血性心肌病患者的心臟組織中發(fā)現(xiàn)circFndc3b 表達(dá)降低，在AMI 小鼠中將circFndc3b 過表達(dá)可改善小鼠左心室收縮功能；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)circFndc3b 過表達(dá)使得AMI 小鼠心臟毛細(xì)血管密度和α-SMA 陽性小動(dòng)脈增加，心肌纖維化減輕。該作用可通過FUS/VEGF-A 信號軸介導(dǎo)。以上研究為探索AMI 心臟修復(fù)治療提供了新的研究思路。

2.5 circRNA 可作為AMI 潛在的生物標(biāo)志物 當(dāng)AMI 發(fā)生后，由于心肌組織的損傷導(dǎo)致更多的心肌肌鈣蛋白（cTn）和肌酸激酶（CK）釋放到外周血中，使得血液中的cTn 和CK 含量增加，因此臨床上cTn和CK 可作為AMI 的診斷標(biāo)志物。然而，心肌炎、肺動(dòng)脈栓塞等其他疾病以及正常人劇烈運(yùn)動(dòng)后也可有cTn 和 CK 的異常釋放［29］，因此二者特異度不高，且穩(wěn)定性較低。研究證實(shí)，circRNA 具有穩(wěn)定性高、表達(dá)豐富、種類多樣等特點(diǎn)，可作為心血管疾病、癌癥以及免疫紊亂等疾病的生物標(biāo)志物［30］。circRNA MICRA 是一種主要存在于外周血細(xì)胞中的與心肌梗死相關(guān)的 circRNA。VAUSORT 等［31］發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，AMI 患者外周血細(xì)胞中circRNA MI?CRA 的表達(dá)低，MICRA 是左室功能障礙的預(yù)測指標(biāo)。SALGADO-SOMOZA 等［32］研究也發(fā)現(xiàn)，左室射血分?jǐn)?shù)明顯降低的AMI 患者外周血細(xì)胞中circRNA MICRA 的表達(dá)低于射血分?jǐn)?shù)保留或射血分?jǐn)?shù)輕微降低的患者。表明circRNA MICRA 有可能成為評估AMI 患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，但目前有關(guān)circRNA作為AMI生物標(biāo)志物的研究較少。

綜上所述，circRNA 具有多樣化的生物學(xué)功能，并在AMI 心臟損傷修復(fù)中具有重要作用。雖然目前對circRNA有了一定了解，但對circRNA的研究仍處于起步階段。對circRNA 是否具有其他生物學(xué)功能、以何種方式分解、在AMI 中是否參與了梗死后心肌炎癥的形成、何時(shí)可在臨床上作為AMI 的診斷標(biāo)志物等一系列問題仍知之甚少。隨著芯片技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展，相信circRNA 在AMI心肌損傷、修復(fù)中的作用將被深入研究，為AMI 的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。