吳巖，宮春愛，王偉宏

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海201999

腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一，化療在腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用，但部分患者化療效果不理想，且化療對患者的傷害較大，這是腫瘤治療的難點［1-2］。造成這種現(xiàn)象的主要原因是藥物對腫瘤組織缺乏選擇性，殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也損傷了正常細(xì)胞。腫瘤靶向治療效果優(yōu)于傳統(tǒng)化療，并且毒副反應(yīng)低。因此，腫瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)的研究備受關(guān)注［3-5］。為滿足臨床需要，2019 年 6 月—2020 年6 月我們制備了一種具有腫瘤微環(huán)境敏感的硫辛酸（LA）修飾的多肽載體，多肽序列為LA-K-L2-G2-R8（LA-KR），通過該載體將抗腫瘤藥物準(zhǔn)確遞送至腫瘤細(xì)胞，從而增強(qiáng)藥效，減少毒副反應(yīng)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231，中國科學(xué)院上海分院），多肽單體合成（上海強(qiáng)耀生物科技有限公司），羧基熒光素標(biāo)記的小干擾RNA（FAM-siRNA，上海暢碩生物科技有限公司），CCK-8 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），胎牛血清（FBS，美國Gibco 公司），半胱氨酸和硫辛酸（上海生工生物工程股份有限公司），甲醇等其他試劑為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。核磁共振譜儀（400-Plus，美國 Varian 公司），粒度電位分析儀（ZS90，英國馬爾文儀器有限公司），流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，美國BD 公司），磁力攪拌器（B11-2型，上海司樂儀器有限公司），透射電鏡（日本HITA?CHI公司）。

1.2 納米粒載體的制備及多肽載體結(jié)構(gòu)鑒定 將多肽單體溶于甲醇中，利用30%半胱氨酸鹽酸鹽作為交聯(lián)劑，磁力攪拌12 h后吹干甲醇，得到半胱氨酸交聯(lián)后的硫辛酸多肽載體（LA-KRss）；取20 mg LAKRss 溶于1 mL 二氯甲烷中，加入去離子水8 mL，冰浴超聲30 s，功率200 W。將溶液倒入盛有10 mL 去離子水的燒杯中，磁力攪拌揮發(fā)2 h 即得納米粒載體。將LA-KRss 溶于重水，用600 MHz 磁共振氫譜儀鑒定LA-KRss結(jié)構(gòu)。

1.3 納米粒載體基本表征檢測 利用透射電子顯微鏡觀察納米粒載體形態(tài)和均勻度，粒度電位分析儀檢測納米粒載體粒徑及表面電位。

1.4 納米粒載體臨界膠束濃度篩選 按照1.2 制備空白納米粒膠束溶液，配制1 mg/mL 膠束溶液。用芘作為熒光探針，在含有微量芘的容量瓶中配制各濃度的膠束溶液，用熒光光度計檢測波長373 nm（I1）和383 nm（I3）的熒光度值，以空白載體濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)、I1/I3為縱坐標(biāo)作圖。

1.5 多肽載體LA-KRss 對FAM-siRNA 包裹能力檢測 采用瓊脂糖凝膠電泳實驗。制備氮（N）/磷（P）值為0、0.5、1、2、3、4、5、10 的LA-KRss/FAM-siRNA，孵育 0.5 h，其中 FAM-siRNA 的加入量均為 1 μg。用TAE 緩沖液（由三羥甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸組成）制備1%瓊脂糖凝膠。將制備好的LA-KRss/FAM-siRNA 加入瓊脂糖凝膠中，設(shè)置電壓為100 V，電泳時間30 min，在紫外光下顯像并拍照。同時二硫蘇糖醇（DTT）模擬的還原性條件下多肽載體LA-KRss 對FAM-siRNA 基因藥物的壓縮包裹情況。DTT可模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)高谷胱甘肽的還原性條件。通過與N/P=0 時的條帶對比，判斷LA-KRss 對FAM-siRNA的包裹情況。

1.6 MDA-MB-231 對多肽載體LA-KRss 介導(dǎo)的基因藥物FAM-siRNA 攝取情況檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。將對數(shù)生長期的MDA-MB-231 接種于12 孔板，3×105/孔，培養(yǎng) 24 h，隨機(jī)分為對照組、FAM 組、LA組，分別加入空白培養(yǎng)基、FAM-siRNA 1 μg+培養(yǎng)基、LA-KRss+FAM-siRNA 1 μg+培養(yǎng)基。每組設(shè)3個復(fù)孔。于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，離心后重懸于PBS，并加入碘化丙啶染液。利用流式細(xì)胞儀檢測，統(tǒng)計各組的熒光密度值。

1.7 納米粒載體對MDA-MB-231 的毒性檢測 采用CCK-8 法。將對數(shù)生長期MDA-MB-231 接種于96 孔板，1×104/孔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12 h 后，將不同濃度（5、10、20、40、80、160 μg/mL）納米粒載體溶液加入培養(yǎng)板中，每個濃度設(shè)6 個復(fù)孔。于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出96 孔板，棄掉舊培養(yǎng)基，每孔加入90 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中放置1 h，將96 孔板置于酶標(biāo)儀振蕩30 s，檢測波長450 nm 處各孔的吸光度（OD）值，并計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（加藥組OD 值-空白培養(yǎng)基組OD 值）/（空白細(xì)胞組OD 值-空白培養(yǎng)基組OD值）×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多肽載體LA-KRss 的結(jié)構(gòu) 多肽單體在半胱氨酸的作用下成功聚合。圖譜中各峰歸屬：2.45、2.64及1.36～1.79屬于硫辛酸部分的質(zhì)子峰，0.80、0.86、2.15 分別屬于亮氨酸中伯碳、仲碳、叔碳上的氫，2.24 屬于羰基亞甲基上的氫，3.58 屬于硫辛酸的甲基；4.17 屬于賴氨酸中接近氨基的-CH2；3.12、3.27、3.71 屬于接近精氨酸叔碳的-CH2-；4.24、3.88屬于聚合物中的叔碳質(zhì)子峰。

2.2 納米粒載體的基本表征 透射電鏡下觀察到的納米粒載體為圓形，均一性較好，粒徑為（160.6±1.9）nm，電位為（16.3± 0.7）mV。

2.3 納米粒載體的臨界膠束濃度 I1/I3突變點處納米粒濃度即納米粒載體的臨界膠束濃度為0.002 12 mg/mL。

2.4 多肽載體LA-KRss 對FAM-siRNA 的包裹能力 當(dāng) N/P 為 0～1 時，F(xiàn)AM-siRNA 不能被多肽載體有效壓縮包裹，在電場作用下可見清晰條帶；N/P=2時，未觀察到明顯條帶，說明FAM-siRNA 在同等電場的作用下并未發(fā)生遷移，此時FAM-siRNA 被多肽載體有效包載；在DTT 條件下，N/P=2 時可以看到明顯條帶，多肽載體可在還原性條件下釋放藥物。

2.5 MDA-MB-231 對 FAM-siRNA 的攝取情況 對照組、FAM 組、LA 組光密度值分別為194.7 ± 35.4、363.7 ± 35.6、2 577.3 ± 224.1。LA 組、FAM 組光密度值高于對照組（P均<0.05），LA 組光密度值高于FAM組（P<0.05）。

2.6 納米粒載體對MDA-MB-231 的毒性作用 納米粒載體濃度為 5、10、20、40、80、160 μg/mL 時，細(xì)胞存活率分別為（98.3 ± 0.8）%、（97.3 ± 1.2）%、（97.6 ± 2.0）%、（96.1 ± 1.6）%、（95.5 ± 2.2）%、（95.2 ± 2.0）%，比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。

3 討論

長期以來傳統(tǒng)的化療藥物在腫瘤的治療中占有重要地位，但因其殺傷細(xì)胞的非選擇性，導(dǎo)致了嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，限制其臨床應(yīng)用［6-8］。此外，多數(shù)化療藥物的水溶性差也是臨床應(yīng)用面臨的一個重要問題［9］，如常用化療藥物阿霉素、多西他賽、紫杉醇等，因其水溶性差常被制成不同劑型或通過合適的載藥系統(tǒng)來提高溶解度。隨著各種新型抗腫瘤藥物不斷研發(fā)，各種治療手段的應(yīng)用，綜合治療成為各種癌癥患者更為合理的治療策略。RNAi 可抑制相關(guān)癌基因的表達(dá)，有可能成為治療腫瘤的新策略。研究表明，RNAi 技術(shù)與化療等方法聯(lián)合應(yīng)用，可發(fā)揮協(xié)同作用，大幅提高抗腫瘤療效［10-11］。但如何構(gòu)建載體遞送基因藥物，是治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

多肽是一種以肽鍵連接多個氨基酸的大分子。作為藥物載體，多肽在體內(nèi)可被生物降解，具有毒性低、無免疫原性、制備容易等特點。多肽類載體主要是指各種細(xì)胞穿膜肽。寡聚精氨酸八肽（R8）是目前最有潛力的細(xì)胞穿膜肽。研究發(fā)現(xiàn)，5～11 個連續(xù)的精氨酸串聯(lián)具有顯著的穿透細(xì)胞膜的能力，其中R8 最有效［12-13］。R8 具有與 siRNA 及 DNA 靜電相互作用的潛力，并且動物模型研究顯示其無毒性［14-15］。通過對它結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，使其可同時實現(xiàn)穿透細(xì)胞膜及包載基因藥物。本研究通過固相合成法合成了硫辛酸修飾的多肽單體，由于硫辛酸五元環(huán)內(nèi)二硫鍵在半胱氨酸的作用下能發(fā)生分子間交聯(lián)，進(jìn)而生成多個多肽單體聚合的載體。該多肽載體在MR 檢查中顯示多肽單體成功聚合。納米粒載體結(jié)構(gòu)中含有疏水性的空腔，能包載疏水性化療藥物，并且可以通過精氨酸的正電性壓縮基因藥物，同時可以響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)高谷胱甘肽的還原性條件，進(jìn)而可以釋放藥物。本研究重點考察了所構(gòu)建載體遞送基因的應(yīng)用研究，所構(gòu)建載體LA-KR 富含帶正電荷的氨基酸，能夠攜帶負(fù)電荷的基因藥物，如siRNA，通過該載體的包裹可以解決疏水性抗腫瘤藥物水溶性差的問題。本研究主要考察所構(gòu)建載體遞送基因藥物的效果，以希望為基因藥物的遞送提供參考。

細(xì)胞內(nèi)部的谷胱甘肽含量很高，而腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的谷胱甘肽含量是正常細(xì)胞的4 倍［16］?；谀[瘤微環(huán)境的這個特點，可以構(gòu)建腫瘤微環(huán)境還原性條件敏感的多肽納米粒載體，載體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，其二硫鍵結(jié)構(gòu)在谷胱甘肽的作用下會斷裂降解，可以更好地釋放其包載的藥物，發(fā)揮藥效［17-19］。硫辛酸的分子結(jié)構(gòu)中含有二硫鍵，其側(cè)鏈上的羧基活性較高，能與細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層融合，攜帶藥物穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。有研究表明，硫辛酸修飾的多肽載體可以實現(xiàn)腫瘤微環(huán)境敏感釋藥，毒性比較低，生物相容性好［20］。

載體把藥物成功遞送至腫瘤細(xì)胞發(fā)揮藥效，不僅需要靶向性，還要求載體能夠穿過腫瘤血管內(nèi)皮間隙（多為380～780 nm），最終到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)。因此，載體的粒徑大小至關(guān)重要。本研究制備的納米粒載體粒徑為160 nm 左右，可以通過腫瘤血管內(nèi)皮間隙。為了考察該納米粒載體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的能力，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞攝取情況。結(jié)果證實該納米粒載體能夠有效穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，確保將攜帶的藥物載入靶細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，安全性也是藥物載體必須要考察的因素之一。毒性實驗結(jié)果表明，該納米粒載體對MDA-MB-231毒性低。

綜上所述，本研究合成的納米粒載體克服了一般載體難以安全降解、攜帶藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部能力不足、自身毒性、釋藥能力不強(qiáng)等問題，并且增加了疏水性化療藥的溶解度。該納米粒載體細(xì)胞毒性低，可以響應(yīng)腫瘤高谷胱甘肽的微環(huán)境，并且能夠穿透細(xì)胞膜將其包載藥物帶入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮藥效。此外，該納米粒載體能夠成功壓縮基因藥物，為基因藥物納米遞送載體及腫瘤靶向基因治療提供參考。但本研究只是初步評價了納米粒載體的基本特性，為進(jìn)一步驗證該載體的應(yīng)用價值，后續(xù)將進(jìn)行載體包載化療藥物的包封率、載藥量和體外釋放等研究。