■石寶明 遲子涵

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

自由基是指化合物分子由于共價鍵斷裂，形成的具有不配對電子的原子或離子基團。自由基通常具有得到或失去電子的傾向，因此其化學(xué)性質(zhì)十分活潑，易與機體的其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成新的自由基或氧化物。動物體內(nèi)自由基主要分為兩類：一類是由氧轉(zhuǎn)變而成的氧自由基，也稱為活性氧，包括O2-、H2O2、OH-、RO·、ROO·和單線態(tài)氧O2等[1]；另一類為體內(nèi)代謝過程產(chǎn)生的其他自由基，如硫自由基等。動物機體具有一套抗氧化清除系統(tǒng)，可以使自由基反應(yīng)被阻斷在各種代謝途徑之中，以此維持機體內(nèi)自由基生成與清除的動態(tài)平衡。當(dāng)機體處于正常狀態(tài)時，自由基可以在動物體內(nèi)作為信息分子和調(diào)控分子，是一種具有廣泛作用的多功能介質(zhì)。當(dāng)機體自由基穩(wěn)態(tài)被打破時，自由基積累過多，此時自由基作為一種具有細胞毒性的氧化劑，會對機體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等造成損傷，從而引發(fā)細胞的結(jié)構(gòu)被破壞，甚至引發(fā)細胞的突變。飼料作為動物攝入營養(yǎng)成分的最主要的營養(yǎng)物質(zhì)，在對動物體內(nèi)自由基平衡的調(diào)控方面起著重要作用。

1 自由基的產(chǎn)生

生物體內(nèi)自由基來源分為外源與內(nèi)源[2]。外源自由基的產(chǎn)生通常是由于外界環(huán)境改變引起的，攝入某些藥物（如抗生素等）也有可能導(dǎo)致外源性自由基產(chǎn)生。動物體內(nèi)的自由基大多為內(nèi)源自由基，由動物體正常代謝反應(yīng)產(chǎn)生，包括酶促反應(yīng)與非酶促反應(yīng)。

1.1 酶促反應(yīng)產(chǎn)生自由基

酶促反應(yīng)產(chǎn)生的自由基主要集中在線粒體。與線粒體呼吸鏈有關(guān)的酶與這部分自由基的生成有重要關(guān)系。高達3%的氧氣可以從能量產(chǎn)生過程中逃逸出來，成為自由基，從而破壞所有類型的生物分子，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA[3]。線粒體的內(nèi)外膜間隙及間液中含有許多參與呼吸鏈酶和輔酶，電子傳遞時可產(chǎn)生氧自由基。另外，NADPH氧化酶、細胞色素P-450還原酶、醛氧化酶、谷胱甘肽還原酶、二氫乳酸脫氫酶等都可以催化一些反應(yīng)產(chǎn)生O2-[4-6]。黃嘌呤氧化酶、D-氨基酸氧化酶等可以催化一些反應(yīng)產(chǎn)生H2O2[7]。

1.2 非酶促反應(yīng)產(chǎn)生自由基

該部分自由基的產(chǎn)生方式通常是由自由基作為引發(fā)基而發(fā)生的連鎖反應(yīng)。此類反應(yīng)通常由自由基參與，通過電子轉(zhuǎn)移或共價鍵斷裂，在體內(nèi)其他物質(zhì)的參與下產(chǎn)生更多種類的自由基。例如：在機體內(nèi)的鐵、銅、鉻、釩等金屬離子的催化下H2O2和O2-能迅速反應(yīng)生成OH-[8]。一些物質(zhì)如血紅蛋白、肌紅蛋白、甘油醛、維生素C等也可發(fā)生自氧化產(chǎn)生O2-。

2 自由基對生物體的危害

當(dāng)動物處于疾病或衰老狀態(tài)時，機體不能有效清除體內(nèi)自由基，自由基積累過多導(dǎo)致組織損傷從而引發(fā)疾病。

2.1 自由基對脂質(zhì)的損傷

自由基性質(zhì)活潑，與細胞膜不飽和脂肪酸相遇后，能夠奪取不飽和脂肪酸亞甲基中的氫原子，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化。自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化是一種鏈式反應(yīng)，包括三個階段：鏈引發(fā)、鏈增長和鏈終止[9]。隨著脂質(zhì)中不飽和脂肪酸的減少，細胞膜蛋白比例失衡，細胞膜通透性增強。Ca2+轉(zhuǎn)運不斷增強，ATP酶等許多鈣依賴性蛋白酶被激活。自由基過多時，會使鏈式反應(yīng)不斷進行從而導(dǎo)致細胞膜進一步受損，細胞完整性被破壞甚至引發(fā)細胞死亡。線粒體由于呼吸作用不斷產(chǎn)生自由基，當(dāng)自由基清除系統(tǒng)受損時，線粒體膜受到破壞，抑制線粒體功能表達，ATP產(chǎn)生減少從而影響細胞能量代謝。已有研究表明，脂質(zhì)過氧化與包括奶牛在內(nèi)的家畜的多種疾病狀態(tài)以及生產(chǎn)性能和繁殖性能下降密切相關(guān)[10-11]。

2.2 自由基對核酸的損傷

自由基對DNA的攻擊包括修飾DNA堿基以及引發(fā)DNA鏈的斷裂。DNA堿基性質(zhì)活潑，易被自由基氧化損傷，是自由基攻擊的主要靶點[12]。鳥嘌呤的還原電位最低，因此鳥嘌呤是羥基自由基主要進攻位點[13]。羥基自由基對嘌呤分子的攻擊位點主要集中在C4、C5、C8以及C2位置[14]。DNA鏈斷裂是DNA損傷的另一種具象化表現(xiàn)[15-16]。活性氧(ROS)能夠抽離DNA環(huán)上的H原子致使DNA鏈斷裂。OH-會奪去DNA脫氧核糖環(huán)不同位點的H并形成碳基自由基。奪取的難易程度為：H5＞H4＞H3≈H2＞H1[17-18]。自由基與堿基反應(yīng)形成的加合物也可發(fā)生單分子開環(huán)反應(yīng)，進而發(fā)生分子間或分子內(nèi)的抽氫反應(yīng)，最終引起核酸鏈的斷裂。此外，H原子還能與DNA分子堿基的雙鍵進行加成反應(yīng)，形成H-加合物，從而引發(fā)DNA鏈斷裂。

2.3 自由基對蛋白質(zhì)的損傷

活性氧與脂質(zhì)和糖化蛋白反應(yīng)產(chǎn)生的醛和酮可以修飾蛋白質(zhì)。自由基介導(dǎo)的氨基酸損傷主要會造成肽鏈裂解、氨基酸側(cè)鏈的氧化，同時引發(fā)蛋白質(zhì)的交聯(lián)。氧化應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)活性和功能改變會導(dǎo)致蛋白質(zhì)中半胱氨酸和蛋氨酸的直接氧化。當(dāng)運輸?shù)鞍资艿阶杂苫魰r，會導(dǎo)致血液中的營養(yǎng)物質(zhì)不能被正常輸送到生物體內(nèi)。一些化合物還可以在過氧化氫的條件下與血紅蛋白發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。此外，通過凝膠色譜進行研究發(fā)現(xiàn)，活性氧對氨基多糖和蛋白多糖也有損傷作用[19]。

3 自由基產(chǎn)生與飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)系

對于動物來說，飼料內(nèi)的各種營養(yǎng)物質(zhì)對于體內(nèi)自由基的清除與產(chǎn)生起重要作用。當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)比例失調(diào)時，體內(nèi)自由基無法被及時清除，從而導(dǎo)致機體受損。

3.1 蛋白質(zhì)對自由基的影響

蛋白質(zhì)是參與機體抗氧化系統(tǒng)組成的重要物質(zhì)，抗氧化防御系統(tǒng)包括機體內(nèi)抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷氧還蛋白(Grx)等和非酶谷胱甘肽系統(tǒng)，二者均有氨基酸參與構(gòu)成。SOD是最重要的抗氧化劑之一[20]。GSH-Px是一種豐富的細胞內(nèi)硫醇，在氧化劑的解毒過程中起著至關(guān)重要的作用，其在許多不同的細胞中都是一種重要的抗氧化劑[21]。一些小肽更是可以直接清除體內(nèi)自由基。飼料中蛋白質(zhì)的缺乏不僅會影響體內(nèi)抗氧化酶的合成，還可能降低動物體內(nèi)抗氧化劑的合成。飼料中蛋白質(zhì)濃度過高也可能會導(dǎo)致動物體內(nèi)自由基含量升高。Wu等[22]發(fā)現(xiàn)增加飼料蛋白的攝入能夠誘導(dǎo)大鼠NOS產(chǎn)生，從而增加大鼠體內(nèi)NO的含量。

3.2 脂質(zhì)對自由基的影響

飼料中通常含有多不飽和脂肪酸，被動物攝入后可經(jīng)氧合反應(yīng)產(chǎn)生氧化脂質(zhì)。氧化脂質(zhì)自身可作為氧化劑，同時也可以促進氧化劑的生成。有研究表明，環(huán)氧合酶(COX-2)可催化不飽和脂肪酸產(chǎn)生前列腺素以及血栓素等氧化脂質(zhì)。這些氧化脂質(zhì)會刺激COX-2途徑活化，同時導(dǎo)致ROS生成增加[23-24]。Li等[25]發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸的代謝產(chǎn)物15-羥化二十烷四烯酸(15-HETE)能夠誘導(dǎo)ROS的生成。Han等[26]發(fā)現(xiàn)，20-羥化二十烷四烯酸(20-HETE)能夠提高線粒體內(nèi)ROS的生成。然而，一些氧化脂質(zhì)不會促進體內(nèi)自由基產(chǎn)生，反而可以起到清除體內(nèi)自由基的效果。氧化脂質(zhì)(PGD2)可經(jīng)脫水反應(yīng)生成15-dPGJ2，該物質(zhì)可抑制NF-κB信號通路從而降低COX-2的表達，減少促炎氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生，從而保護細胞免受氧化損傷[27-28]。同時，15-dPGJ2還可以增加一些抗氧化酶(SOD、GSH-Px等)的基因表達[29-30]，從而起到清除體內(nèi)自由基的作用。Chen等[31]發(fā)現(xiàn)，人脂氧素A4(LXA4)可以提高細胞內(nèi)SOD活性，提高細胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)水平從而保護肝臟免受氧化損傷。在飼料中添加過量脂肪可能是引起動物體內(nèi)自由基積累過多的原因之一。有試驗表明，高脂飼料誘導(dǎo)了NADPH氧化酶亞基gp91，并促進了結(jié)腸上皮細胞和固有層細胞中活性氧的產(chǎn)生[32]。Zalewska等[33]發(fā)現(xiàn)飼喂高脂飼料的大鼠腮GSH和氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值顯著降低，GSSG水平顯著升高。大鼠腮腺中自由基產(chǎn)生以及脂質(zhì)過氧化明顯。Li等[34]發(fā)現(xiàn)，高脂飼料可以加重腸道氮氧化物(NOx)相關(guān)的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致腸緊密連接的完整性喪失，從而增加腸道通透性。

3.3 維生素對自由基的影響

在動物體內(nèi)，許多維生素可以起到抑制自由基產(chǎn)生以及清除體內(nèi)多余自由基的作用。如VA、煙酸以及一些類胡蘿卜素均可通過抑制細胞內(nèi)iNOS基因的表達從而降低體內(nèi)NO的產(chǎn)生，因此維生素可以抑制NO自由基誘發(fā)的細胞毒性。VE還可以抑制ROS誘發(fā)的脂類H2O2自由基的生成。除了影響自由基的產(chǎn)生，維生素還可以參與自由基的清除。VC與VE在體內(nèi)充當(dāng)抗氧化劑時會產(chǎn)生協(xié)同作用。VC可以從自由基中再生VE從而增強VE的抗氧化效果。VC能夠清除動物體內(nèi)的次氯酸和酪氨酸自由基，保護脂質(zhì)免受活性氧誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)。Fischer-Nielsen等[35]發(fā)現(xiàn)VC能夠減弱自由基誘導(dǎo)的氧化損傷。類胡蘿卜素可以抑制自由基的活性從而起到抗氧化的作用，一些類胡蘿卜素可以與ROO·反應(yīng)生成無活性的產(chǎn)物從而使其喪失功能。β-胡蘿卜素還可以破壞脂質(zhì)過氧化的鏈式反應(yīng)，從而保護細胞膜免受氧化損傷。

3.4 礦物質(zhì)對自由基的影響

飼料中礦物質(zhì)元素的含量也會影響動物體內(nèi)自由基的水平。在礦物質(zhì)元素中，硒被認為是最重要的抗氧化劑。目前在動物組織中發(fā)現(xiàn)了25種硒蛋白，其中一半以上直接或間接參與維持身體氧化還原平衡和抗氧化防御。硒在動物體內(nèi)以硒代胱氨酸(SeCys)的形式存在，是各種硒蛋白的重要組成部分，而硒蛋白是動物體內(nèi)抗氧化網(wǎng)絡(luò)的重要元件以及調(diào)節(jié)劑。硒是GSHPx的輔助因子,是該酶的活化中心。當(dāng)飼料中硒含量不足時，會導(dǎo)致GSH-Px活性降低，從而影響體內(nèi)H2O2與ROOH自由基的降解。研究發(fā)現(xiàn)，飼喂蛋雞含硒飼料可以使其血漿中GSH-Px和SOD活性顯著升高[36]。此外，有研究表明補硒鴿子的睪丸和卵巢中GSH-Px4表達增加[37]。鋅在延緩氧化過程中起著重要的生化作用，因此也是一種潛在的抗氧化劑。鋅代謝異常會使氧自由基產(chǎn)生增加并導(dǎo)致嚴重的氧化應(yīng)激[38]。鋅還可以促進金屬硫蛋白的合成，金屬硫蛋白中含鋅的巰基化合物簇可以有效清除羥基自由基。銅在動物體內(nèi)對自由基清除具有雙重生物學(xué)效應(yīng)，動物攝入高銅或低銅均會造成脂質(zhì)過氧化水平提高。

4 飼料調(diào)控動物體內(nèi)自由基的方法

4.1 添加維生素

飼料中通常加入VA、VE、VC等作為抗氧化劑。VE不僅可以抑制自由基的產(chǎn)生，還可以抑制細胞膜內(nèi)多不飽和脂肪酸的氧化，預(yù)防脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。VC的抗氧化活性主要是通過清除自由基實現(xiàn)的，VC作為電子供體可清除OH·、ROO·等自由基。Yokota等[39]發(fā)現(xiàn)飼喂缺乏α-生育酚飼料的小鼠大腦脂質(zhì)過氧化作用增強，同時神經(jīng)衰退現(xiàn)象增強。Surai等[40]發(fā)現(xiàn)在種雞或公雞的飲食中補充VE，提高了它們對氧化應(yīng)激的抵抗力。在飼料中添加維生素除了可以起到清除多余自由基的作用，還可以改善肉質(zhì)，提高動物生產(chǎn)性能。Belles等[41]研究表明，在飼料中加入VE可以保持羊肉肉色同時改善脂質(zhì)過氧化水平。

4.2 添加酚類物質(zhì)

酚類物質(zhì)因其含有苯環(huán)的特殊結(jié)構(gòu)，可作為良好的電子與氫的供體。其本身不易與氧結(jié)合，性質(zhì)相對穩(wěn)定，因此是一種良好的抗氧化劑。Wang等[42]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以提高血漿中SOD等抗氧化酶的活性，同時增加GSH含量，起到抗氧化的作用。陳丹丹[43]發(fā)現(xiàn)，茶多酚能夠減弱脂質(zhì)過氧化，具有良好的抗氧化能力。

4.3 添加抗氧化肽

抗氧化肽在體外可以直接清除自由基。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑化合物中H-X基團的鍵電離能(BDE)決定了反應(yīng)活性，鍵電離能越大，反應(yīng)活性越強[44-45]。因此，含有諸如酪氨酸、色氨酸和組氨酸等能容易給質(zhì)子的氨基酸基團的抗氧化肽，通常通過H原子轉(zhuǎn)移的機制淬滅自由基。一項關(guān)于玉米蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，HAL?GA和HAIGA肽在氧化自由基吸收能力(ORAC)試驗中具有不同的活性，前者的活性大約是后者的1.6倍[46]。在細胞內(nèi)，抗氧化肽主要通過調(diào)節(jié)抗氧化酶減少脂質(zhì)過氧化[47]，以及提高GSH含量，降低GSSG含量，維持GSH/GSSG比值的穩(wěn)定保護細胞氧化損傷。機體可以通過核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。加入抗氧化肽后會增強Nrf2基因的表達從而增加抗氧化酶的合成。Kim等[48]發(fā)現(xiàn)藻膽蛋白抗氧化肽可通過Nrf2-SOD通路降低H2O2介導(dǎo)的氧化損傷，并恢復(fù)SOD的表達。抗氧化肽還可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）水平從而保護細胞免受氧化損傷。γ-GCS是一種重要的調(diào)節(jié)和限速酶，可以平衡胞內(nèi)GSH水平[49]。γ-GCS在細胞中的表達水平可以影響體內(nèi)GSH的含量。當(dāng)體內(nèi)活性氧含量過高時，細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，γ-GCS含量也會下降[50-51]，導(dǎo)致GSH合成減少，同時活性氧引起了GSH消耗增加，最終導(dǎo)致細胞內(nèi)GSH含量減少，GSH/GSSG穩(wěn)態(tài)失衡。張燕[52]以不同濃度的蛋清源抗氧化肽處理HEK293細胞發(fā)現(xiàn)γ-GCS基因相對表達量較損傷組有一定程度的提高，細胞的抗氧化能力得到提高。

4.4 添加蝦青素

蝦青素是在水生動物中發(fā)現(xiàn)的一種酮式類胡蘿卜素。與其他類胡蘿卜素相比，蝦青素酯化能力更強、抗氧化活性更高，同時構(gòu)型更加極化。蝦青素可以將激發(fā)O2的能量吸收到類胡蘿卜素鏈上，促使類胡蘿卜素分子降解，并防止其他分子或組織受到損害[53]。還可以防止由多不飽和脂肪酸降解引發(fā)的連鎖反應(yīng)產(chǎn)生自由基，從而保護膜磷脂和其他脂質(zhì)免受過氧化的損傷[54-55]。蝦青素的抗氧化活性已在多項研究中得到證實。在某些情況下，蝦青素清除自由基的能力數(shù)倍強于維生素E和β-胡蘿卜素。Hormozi等[56]發(fā)現(xiàn)，蝦青素可以提高LS-180細胞中SOD、CAT以及GSH-Px活性，顯著降低丙二醛水平，從而使細胞抗氧化活性顯著提高。Dose等[57]使用光子計數(shù)法測定了蝦青素的氧猝滅活性，發(fā)現(xiàn)合成蝦青素具有良好的自由基清除以及抗氧化能力。蝦青素不能由動物合成，必須從飲食中獲得，因此在飼料中添加蝦青素可以作為一種有效的清除自由基的手段。

4.5 添加植物提取物

植物提取物是從植物中提取出的一種活性物質(zhì)，其在生物體內(nèi)能發(fā)揮包括氧化作用的多種功能，可以作為天然抗氧化劑加入到飼料中。植物提取物可以減少機體自由基的產(chǎn)生，其抑制自由基產(chǎn)生的方式依賴于其抑制氧化酶活性的能力。潘峰等[58]發(fā)現(xiàn)，絞股藍皂苷可以降低細胞內(nèi)黃嘌呤氧化酶(XOD)和髓過氧化物酶(MPO)的活性，從而減少大鼠的自由基產(chǎn)生。一些植物提取物可以作為電子供給體從而起到直接清除自由基的作用。這些植物提取物中含有還原性基團，可以減緩自由基鏈式反應(yīng)。植物提取物還可以調(diào)節(jié)動物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)從而改善動物清除自由基的能力。研究表明,在砷誘導(dǎo)氧化損傷中，姜黃素可以提高Nrf2表達量,調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶的表達從而減弱氧化損傷[59]。Machha等[60]研究表明，口服槲皮素可以提高糖尿病大鼠模型SOD活性以及總抗氧化能力。Rubiolo等[61]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以激活Nrf2通路，增加抗氧化酶基因表達量，提高抗氧化酶活性并增強機體抗氧化能力。

4.6 添加多糖

一些多糖具有較為良好的抗氧化能力，其本身具有對自由基的清除能力，可以吸附自由基避免自由基對細胞造成損傷。同時多糖可以提升機體自身抗氧化系統(tǒng)的防御能力，使機體自身自由基清除能力提高。Anandan等[62]發(fā)現(xiàn)，殼聚糖可以提升老齡小鼠模型心臟組織GSH、GSH-Px以及谷胱甘肽還氧酶（GR）水平并能達到幼年小鼠水平，從而減弱自由基損傷。Wang等[63]發(fā)現(xiàn)，灘棗源多糖可以清除自由基，減弱CCl4誘導(dǎo)的肝損傷。一些植物源多糖均在體外檢測出良好的自由基能力。青竹梅多糖可以有效清除·OH，藍莓多糖能夠清除·OH和DPPH，生姜多糖清除DPPH·能力較強[64]，南瓜多糖能夠清除O2-[65]。

5 小結(jié)

綜上所述，自由基通常在動物體內(nèi)保持平衡，當(dāng)這種平衡遭到破壞時，會對動物體造成多種損傷。飼料是動物獲取營養(yǎng)物質(zhì)最主要的手段，因此調(diào)節(jié)飼料中各種營養(yǎng)物質(zhì)的配比對于調(diào)節(jié)動物體內(nèi)自由基平衡是至關(guān)重要的。了解各種營養(yǎng)物質(zhì)對體內(nèi)自由基產(chǎn)生以及清除的影響，并研發(fā)出健康的新型飼料，從而在供給動物均衡營養(yǎng)的同時，提高動物的抗氧化能力。這將對畜牧業(yè)產(chǎn)生重要的良性影響。