尚芳，裴斌，周偉康，樊志敏

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210000；2.南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210000)

0 引言

近年來，隨著人民生活水平的提高和飲食結構的改變，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)在我國的發(fā)病率逐年上升[1]。手術治療是目前治療CRC的首選方法，但面臨創(chuàng)傷大、風險高等問題，對患者而言恢復周期長，經(jīng)濟壓力大。同時，與早期患者相比中晚期患者預后較差。因此，結直腸癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療尤為重要。惡性腫瘤是由多種因素共同作用造成機體功能紊亂的復雜疾病，其組織與人體正常組織在代謝方面有著顯著差異。代謝組學 (metabonomics/metabolomics) 通過生物體內(nèi)代謝物進行系統(tǒng)定量分析的方法，尋找出代謝物與生理、病理之間的對應關系。其研究方法非常類似于我國傳統(tǒng)中醫(yī)司外揣內(nèi)、見微知著的診療思想。辨證論治是中醫(yī)的核心內(nèi)容，更是臨床診療的基礎。代謝組學從微觀視角通過生物體代謝物能夠?qū)ι矬w所患疾病得出診斷，從而可以為預后治療情況、臨床治療情況提供更多有效評價依據(jù)。中醫(yī)辯證論治則是從宏觀視角，指導臨床思維，二者相輔相成?，F(xiàn)將近年來代謝組學在CRC中西醫(yī)診療中的應用綜述如下。

1 代謝組學簡介

1.1 代謝組學的背景和定義

1998年Tweeddale等在研究大腸桿菌的代謝時首次提出代謝組(Metabolome)這一概念，并提出“代謝物組成分析能夠提供有關細胞代謝和調(diào)控的重要信息”。1999年，Nicholson[2]等在近二十年生物代謝系統(tǒng)研究的基礎上提出了代謝組學的定義，其解釋為“對生物體病因或基因改變等情況下代謝參數(shù)的定量研究”。國內(nèi)外學者對代謝組學的解釋可概括為：所謂的代謝組學可以簡單理解為：生命個體對機體內(nèi)外環(huán)境作出的代謝應答，通多定量方法對應答全貌、動態(tài)進行測定的學科[3]。

1.2 代謝組學的研究方法及特點

代謝組學的研究對象是相對分子質(zhì)量小于1000的小分子代謝物質(zhì)，包括糖、氨基酸、脂質(zhì)等。代謝組學融合了包括化學計量學、生物信息學在內(nèi)的多種研究方法[4]。相較于基因組學和蛋白質(zhì)組學，代謝組學具有以下特點：(1)檢測樣本容易獲取，且采集樣本過程中對人體傷害較??；(2)檢測指標遠比基因和蛋白質(zhì)少很多，檢測方法簡單易行；(3)代謝組學可以為藥理研究、病理生理提供動態(tài)信息；(4)代謝組學將生物體看作動態(tài)的整體，研究內(nèi)外因素變化時對這一整體的代謝影響，進而揭示生化途徑[4,5]。

目前代謝組學已成為疾病研究的新工具，為疾病的認識提供了新視角，廣泛用于各個系統(tǒng)疾病相關標志物的發(fā)現(xiàn)[6,7]，且在對心臟病[8,9]、糖尿病[10,11]、腫瘤[12,13]、阿爾茲海默癥[14,15]的研究中取得了進展。不僅推動了疾病識別與治療進程，同時也可以為新藥測試、精準治療提供更多參考和依據(jù)[16]。

代謝組學研究過程基本上分為如下幾個步驟：

第一，制備相關樣品。需要將研究對象導入到刺激環(huán)境中，比如：改變其基因組，剔除某些基因鏈或?qū)胄禄?，這樣可以觀察轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平的參數(shù)變化，也可以從環(huán)境因素入手，觀察基因轉(zhuǎn)錄的情況。

第二，采集樣本并進行預處理，樣本采集內(nèi)容有很多，如：研究對象的血液、尿液、組織細胞等，甚至也可以將整個生物體視為樣本。在實驗活動中需要兼顧到收集樣本時間，樣本種類、群體分布等因素，這些都會影響到后續(xù)分析。

第三，分析代謝物。一般是通過定量分析手段對采集數(shù)據(jù)進行分析，定量分析方法主要有核磁共振、質(zhì)譜、色譜等等，依托更多信息技術平臺可以分析出樣本類型、含量及變化情況，從而構建代謝組數(shù)據(jù)。當前最常用的分析技術主要是核磁共振、質(zhì)譜技術。這些分析方法基本上可以劃分為3大類。比如：色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀分析方法又細分為包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀(LC/MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀(GC/MS)、毛細管電泳-質(zhì)譜(CE/MS)等，其中：對于分離高揮發(fā)性混合物可以采取 GC-MS 方法，對于分離低揮發(fā)性混合物可以采取LC-MS方法[17]。不同方法其優(yōu)勢及劣勢均不同，為此在代謝組研究分析中常常會將二三種方法聯(lián)合使用。

第四，分析數(shù)據(jù)，完成了代謝組數(shù)據(jù)分析之后，需要對數(shù)據(jù)進行計量分析，方法有很多，一類是非監(jiān)督分析，如：主成分分析(PCA) 、非線形映射(NLM) 、聚類分析(HCA) 等；一類是監(jiān)督分析，如：偏最小二乘法(PLS) 、獨立建模分類法(SIMCA) 、人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(ANN) 等[18]。最常用的方法是主成分分析法和偏最小二乘法。主成分分析法主要用于對比代謝組之間的區(qū)別和相似程度，而偏最小二乘法給出導致區(qū)別或相似的貢獻變量及其貢獻程度。

2 代謝組學在CRC診療中的應用

2.1 診斷

機體的正常生理活動需要各個系統(tǒng)平衡協(xié)作，如果系統(tǒng)平衡被內(nèi)部因素或外部因素影響，生理機體代謝就會發(fā)生改變，生物體所有的活動都是通過各個系統(tǒng)均衡運行實現(xiàn)的，如果某一系統(tǒng)出現(xiàn)了混亂且沒有及時糾正，那么就會引發(fā)新問題，積累到一定程度后就會出現(xiàn)宏觀性改變，甚至出現(xiàn)病理改變。對于代謝紊亂的問題可以通過尿液或血液檢測得出，通過分析代謝情況能夠觀測出生物體變化情況，從而及早找出誘發(fā)疾病的代謝組標志物簇。并了解發(fā)病相關的分子機制，就有可能在疾病的早期做到早期診斷和干預。目前臨床上CRC的診斷主要依賴內(nèi)鏡下診斷和病理診斷相結合。但結腸鏡檢查具有侵入性，患者耐受性差，穿孔風險大，且對操作者技術要求較高。代謝組學則很好地彌補了這一缺陷。

許多研究[19-21]表明代謝組學在癌癥的早期診斷方面具有巨大潛力?？死瓱峥死瓱崂瓱醄22]等收集結直腸癌確診患者血清標本 40 例，癌前病變(包括潰瘍性腸病、結直腸腺瘤) 患者血清標本 20 例，健康對照組血清標本 60 例，通過使用核磁共振技術，依托了最小二乘分析方法，對采樣的三組血清進行了檢測分析，觀察了代謝物情況，最終得出結論：在結直腸腫瘤對象體內(nèi)多種氨基酸含量出現(xiàn)了大幅度降低，但是血清內(nèi)部的酮體含量卻超出了正常范圍。綜合對比腫瘤患者與結直腸癌前病變患者的各項血清指標來看，腫瘤患者和結直腸癌前病變患者與正常人相比部分代謝物含量下降明顯，如：血清膽堿、亮氨酸、β －葡萄糖代謝物等。結合實驗數(shù)據(jù)推測出，結直腸癌前病變患者極有可能會癌變。馬延磊[23]使用了GC—MS技術，引入了健康對象與患結直腸癌對象，通過實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)二組對象的代謝譜與總代謝水平有顯著不同，同時還參考了美聞標準以及技術研究院質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，對研究對象的代謝物進行了檢測分析，應用數(shù)學模型PLS-DA進行模式特征性分類。同時對腸癌組與對照組的區(qū)分率利用監(jiān)督性的聚類分析進行分析，結果發(fā)現(xiàn)與對照組代謝物相對含量相比，腸癌一組中血清L－纈氨酸、L－蘇氨酸等含量顯著較低，但是3-羥丁酸這一指標卻增加，后來通過監(jiān)督性分析方法進一步分析數(shù)據(jù)得出結論，為結直腸癌診斷提供了依據(jù)，將其診斷準確率大大提升至93.5%。Cheng等[24]使用氣相色譜-飛行時間-質(zhì)譜和超高效液相色譜四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜分析，對101例CRC患者和103例健康受試者進行尿液代謝組學研究。研究發(fā)現(xiàn)在CRC受試者中觀察到許多代謝途徑失調(diào)，例如糖酵解，TCA循環(huán)，尿素循環(huán)，嘧啶代謝，色氨酸代謝，多胺代謝以及腸道微生物-宿主共代謝。并構建了含有七大代謝物的診斷模型。

2.2 評估療效，指導個體化治療

代謝組學在腫瘤的臨床療效檢測和個體化治療中也應用十分廣泛。接受手術或放化療的患者，體內(nèi)腫瘤負荷顯著降低，機體代謝也會相應發(fā)生改變。利用代謝組學技術分析患者代謝譜的變化有助于評估手術或放化療的效果。Qiu 等[25]人綜合對比了術前術后患者的代謝情況，并綜合運用了正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)分析方法，得出二組數(shù)據(jù)存在顯著差異，經(jīng)過手術治療后，實驗組對象的氨基酸代謝水平提高，相對應的三羧酸循環(huán)和微生物代謝水平降低。患者與正常健康人員代謝組數(shù)據(jù)對比顯示，經(jīng)過手術干預治療后，患者各項代謝水平正逐步恢復。Ma[26]綜合使用了 GCMS 與模式識別技術，引入了30名研究對象，分析了手術干預前后的代謝水平變化，結果顯示：經(jīng)過手術治療后，患者七大類代謝水平降低，如：L-纈氨酸、1-脫氧葡萄糖等等，但是L-酪氨酸代謝水平卻增強了這為精準診斷和治療提供了依據(jù)。

抗腫瘤藥物基本治療原理是抑制腫瘤生長，但是很難將腫瘤縮小。通過影像檢查可以看出腫瘤變化情況，但是影像卻不能全面揭示抗腫瘤藥物的療效，為此需要借助其他分析手段和技術，了解藥物進入人體后的變化及過程，從而判斷出藥物的療效[27]，以減少對病患的副作用，為臨床用藥提供指導，從而設計個性化的治療方案。比如：國外學者Backshall[28]研究中引入了54名結直腸癌患者，這些患者都沒有經(jīng)過手術治療，觀察了患者化療前后的代謝水平，得出了一系列實驗數(shù)據(jù)，經(jīng)過分析得出：化療前患者的低密度脂蛋白衍生脂質(zhì)越高，越容易產(chǎn)生化療后的不良反應。

2.3 監(jiān)測耐藥情況

代謝組學在腫瘤的耐藥性方面的研究是目前臨床研究的一個熱點課題。腫瘤耐藥是目前臨床上面臨的一個棘手問題，也是導致患者化療失敗的重要原因。還有研究得出，一旦腫瘤細胞出現(xiàn)了耐藥性，那么這些細胞就會在蛋白、半胱氨酸等通路上增加代謝能力，因此通過代謝組檢測數(shù)據(jù)可以及時發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞是否具有耐藥性，從而為臨床用藥提供指導[29]。

3 代謝組學在CRC的中醫(yī)辨證論治中的應用

結直腸腫瘤屬中醫(yī)“臟毒”、“鎖肛痔”范疇。結腸是大腸的一部分，在中醫(yī)理論中與脾腎密切相關。中醫(yī)認為結直腸腫瘤的病理因素主要是濕、毒、瘀、虛。憂思抑郁，脾胃不和，濕熱蘊結，日久化毒，乘虛下注，浸淫腸道，氣滯血瘀，濕毒瘀滯凝結而成腫瘤；或飲食不節(jié)，久痢久瀉，息肉蟲積，損傷脾胃，運化失司，濕熱內(nèi)生，熱毒蘊結，流注大腸，蘊毒積聚，結而為腫?？傊?，濕熱下注、火毒內(nèi)蘊，結而為腫是病之標；正氣不足、脾腎兩虧乃病之本。

大腸癌辨證關鍵在于首辨寒熱虛實，次辨在氣在血。大腸癌的病情復雜，臨床表現(xiàn)形式多種多樣，目前尚無統(tǒng)一的辨證分型。各位醫(yī)家[30,31]在傳承名家經(jīng)驗基礎上結合自身臨床體會，在對大腸癌的認識上具有一些相同點，如均認為病機為正虛邪實，虛實夾雜。中華中醫(yī)藥學會發(fā)布的《中華中醫(yī)藥學會標準-腫瘤中醫(yī)診療指南》[32](08版)將大腸癌分為如下六種證型：脾虛氣滯證、濕熱蘊結證、瘀毒內(nèi)阻證、脾腎陽虛證、肝腎陰虛證、氣血兩虛證。這是目前較有影響力的分類規(guī)范。

傳統(tǒng)中醫(yī)望聞問切的診病方法因其主觀性和缺乏統(tǒng)一的標準而被現(xiàn)代醫(yī)學所質(zhì)疑，辨證結果更是與醫(yī)生的自身水平密切相關[33]。代謝組學方法可動態(tài)研究復雜條件下機體病理生理狀態(tài)變化，揭示代謝相關疾病本質(zhì)。這與中醫(yī)“證”的概念十分契合?！白C”是疾病發(fā)生和發(fā)展過程中某一階段的病理概括。“證”不是一成不變的。代謝組學顯示，隨著時間的變化，代謝物的種類、濃度、比例也有變化。由此觀之，代謝組學與中醫(yī)癥候存在很多相似之處，二者可以相互結合使用，將代謝組學用于中醫(yī)癥候研究中，有助于揭示中醫(yī)證候的本質(zhì)，為中醫(yī)的現(xiàn)代化研究提供了新思路。

魏濱[34]等在對大腸癌和肝癌術后患者的血漿進行代謝組學分析后發(fā)現(xiàn)濕熱證影響人體的糖代謝，并且以影響糖類物質(zhì)分解和供能過程為主要特征(糖酵解和TCA是實現(xiàn)人體能量供給的重要通路)，包括氨基酸和嘌呤的轉(zhuǎn)化和降解也受到濕熱證的影響。馬乃霞[35]通過HPLC-MS技術對晚期腸癌偏實證與偏虛證患者血清樣品進行代謝組學分析，利用PCA、OPLS-DA分析法，得出結論：與偏虛證患者對比，偏實證患者血清中異亮氨酸、天冬氨酸、牛磺酸代謝水平較高，但是丙酮、乙酰乙酸以及阿洛酮糖代謝量較低。蔣鑫超[36]使用了超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜技術，對正常組與實驗組對象的代謝情況展開了分析，實驗中分別對正常人組和脾虛濕郁證大腸癌組患者的血漿和尿液進行檢測分析，結合偏最小二乘法-顯著性分析聯(lián)合法尋找脾虛濕郁證大腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的生物標志物群。經(jīng)過研究得出大腸癌脾虛濕郁證的標志物簇，分別是：血清中的甘氨酸、L-絲氨酸、膽堿、精氨酸、檸檬酸五大類，尿液中的丙氨酸、檸檬酸、苯乙酰基谷氨酰胺三大類，同時實驗中還發(fā)現(xiàn)了代謝物三羧酸循環(huán)情況，代謝物色氨酸的通路變化情況，從而為大腸癌疾病診斷或是脾虛濕郁證的證型鑒別提供了客觀化和量化的一個標準。

4 討論

代謝組學技術通過對代謝產(chǎn)物的分析，明確生物體的代謝水平，有利于探索生命調(diào)節(jié)中完整的代謝調(diào)控網(wǎng)絡，對進一步了解疾病本質(zhì)、藥物的顯效機制及潛在的生物標志物提供了新的思路[37]。但是目前代謝組學尚有許多不足之處[38-40]，如：①關于代謝組學檢測數(shù)據(jù)較繁冗龐大，數(shù)據(jù)分析消耗時間成本較大，發(fā)展至今依然沒有建設數(shù)據(jù)庫，很難精準快速地找到對比標記物數(shù)據(jù)；②目前代謝組學研究樣本量小，證候診斷無統(tǒng)一標準導致實驗可重復性差，缺少驗證性研究；③生物體代謝易受環(huán)境、心理等多種復雜因素影響，對實驗結果都會產(chǎn)生一定的影響，結果會存在誤差，加上各種分析技術的限制，至今還沒有一項分析精準全面的方法，需要綜合多種方法進行分析，且很多研究都是運用了動物做實驗對象，構建的動物模型難以得到行業(yè)公認，且人與動物之間具有本質(zhì)區(qū)別，動物實驗指導臨床缺乏說服力；④對于同個體的不同樣本檢測結果會存在差異，如：血液檢測和尿液檢測結果差異較大，結論就會產(chǎn)生分歧，給制定合理精準的治療方案帶來困難。將中醫(yī)證型引入大腸癌模型中，研究其對大腸癌治療和預后的影響并不多見。

現(xiàn)代醫(yī)療模式正逐漸從重視疾病向重視預防發(fā)展，《素問》有云：“圣人不治已病治未病”，這正是中醫(yī)“未病先防”預防保健觀念的體現(xiàn)。大腸癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療對于預后十分重要。雖然代謝組學技術并不完全成熟，但不可否認代謝組學技術在結直腸癌的預防和治療方面有著其它組學無法取代的優(yōu)勢。代謝組學已經(jīng)成為傳統(tǒng)中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學交流融合的橋梁。如果能夠?qū)⒋x組學與其他生物學科、技術融合，這對于中醫(yī)領域的證候整體、動態(tài)、全面發(fā)展將會大有裨益，也將可以走出一條獨具中國特色的中醫(yī)治療路徑[41]。