程 思，王 超，沈仁芳*

高耐鋁紅酵母RS1的紅外光譜和拉曼光譜研究①

程 思1,2，王 超1，沈仁芳1,2*

(1土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所)，南京 210008；2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

微生物菌株RS1是從江西鷹潭油茶酸性土壤中篩選獲得的一株高耐鋁紅酵母，能夠忍耐高達(dá)200 mmol/L以上的鋁濃度。前期研究表明RS1可以把鋁固定在細(xì)胞表面，阻擋其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，但是細(xì)胞表面何種基團(tuán)參與鋁的固定并不清楚。本文綜合采用傅里葉紅外光譜和拉曼光譜技術(shù)研究了鋁脅迫下紅酵母RS1細(xì)胞表面官能團(tuán)變化，以期從光譜學(xué)角度來探索RS1的高耐鋁機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，70 mmol/L鋁處理24 h后RS1紅外光譜中1 403 cm–1處的吸收峰紅移到1 397 cm–1處，這可能是羧基峰；在1 706 cm–1處出現(xiàn)新的吸收峰，這可能是羰基峰；酰胺I帶吸收峰強(qiáng)度顯著上升，且甘露聚糖的吸收峰消失。拉曼光譜在779、856 cm–1處和1 270 cm–1處出現(xiàn)新的吸收峰，可能分別為核糖核酸、酪氨酸和酰胺Ш帶的吸收峰。綜合結(jié)果表明，RS1細(xì)胞表面與鋁吸附相關(guān)的物質(zhì)主要是細(xì)胞壁多糖和蛋白質(zhì)，主要涉及的官能團(tuán)包括羧基、羰基和酰胺基。這些細(xì)胞表面官能團(tuán)對(duì)鋁的固定作用可能是紅酵母RS1高耐鋁的一個(gè)重要機(jī)制。

紅酵母；鋁毒；傅里葉紅外光譜；拉曼光譜

全球酸性土壤面積約為39.5×108hm2，占可耕地土壤面積的40% 左右[1]。我國(guó)酸性土壤主要分布在南方各省，在熱帶和亞熱帶地區(qū)土壤酸化問題尤為嚴(yán)重，酸性土壤總面積約為218 km2，約占我國(guó)陸地面積的22.7%，而且面積不斷在擴(kuò)大[2]。當(dāng)土壤pH<5時(shí)，土壤中的鋁會(huì)從固相釋放進(jìn)入土壤溶液或以交換性鋁吸附于土壤表面的陽(yáng)離子交換位上，使土壤鋁活性增加，進(jìn)而產(chǎn)生毒害[3]。鋁毒被認(rèn)為是酸性土壤生物生長(zhǎng)的主要限制因子之一[4]。植物忍耐鋁的濃度一般小于0.1 mmol/L。近年來，一些土壤高耐鋁微生物被發(fā)現(xiàn)，它們能夠在幾十甚至幾百毫摩爾的鋁濃度下生長(zhǎng)[5-9]。這些微生物菌株對(duì)鋁的忍耐程度遠(yuǎn)大于植物，其中必然存在有別于植物的耐鋁機(jī)制。由于微生物具有生長(zhǎng)快、周期短、易變異等優(yōu)點(diǎn)[10]，因此可以作為研究生物高耐鋁機(jī)制的良好試驗(yàn)材料。對(duì)其高耐鋁機(jī)制的闡明一方面可很好地補(bǔ)充生物的耐鋁機(jī)制，另一方面有助于酸性土壤生產(chǎn)力及生態(tài)系統(tǒng)的維持，改善生態(tài)環(huán)境[11]。

本實(shí)驗(yàn)室前期從江西鷹潭油茶土壤中篩選獲得一株高耐鋁紅酵母RS1，在200 mmol/L的鋁濃度中仍可以生長(zhǎng)[12]。前期研究表明，RS1可有效阻擋胞外高濃度鋁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)胞壁表面含有較少負(fù)電荷和結(jié)構(gòu)修飾密切相關(guān)[13]。細(xì)胞壁表面較少的負(fù)電荷可降低鋁在細(xì)胞表面的吸附能力，進(jìn)而減少鋁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的機(jī)會(huì)，降低毒害作用。酵母細(xì)胞壁主要由β-葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)，以及少量幾丁質(zhì)組成[14]。這些細(xì)胞壁表面結(jié)構(gòu)存在多種官能團(tuán)，通過去質(zhì)子化作用，使得菌體帶負(fù)電[15]，帶負(fù)電的官能團(tuán)可以參與對(duì)鋁的吸附固定。但是，何種官能團(tuán)的存在或含量差異使得RS1細(xì)胞壁表面具有較少的負(fù)電荷尚不清楚。

光譜檢測(cè)技術(shù)是一種確定官能團(tuán)存在和化合物類別的技術(shù)手段，常見的光譜檢測(cè)技術(shù)包括紅外光譜和拉曼光譜。這兩種光譜技術(shù)均為測(cè)量分子振動(dòng)光譜的方法，但機(jī)理不同且能相互補(bǔ)充[16]，結(jié)合采用兩種技術(shù)能更全面地研究分子振動(dòng)狀態(tài)，提供更多分子結(jié)構(gòu)信息。紅外光譜技術(shù)已廣泛用于研究酵母對(duì)金屬離子的吸附試驗(yàn)中[17-18]，而拉曼光譜技術(shù)多用于對(duì)酵母發(fā)酵、凋亡等生理過程中生物大分子變化情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。孫素琴等[19]運(yùn)用這兩種光譜技術(shù)對(duì)中藥材真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn)拉曼光譜可提供對(duì)紅外光譜表現(xiàn)弱吸收或無(wú)吸收的官能團(tuán)信息；黃皓等[20]運(yùn)用紅外和拉曼光譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母細(xì)胞表面的羥基、羧基參與鉛和鎘的吸附過程。可見，綜合運(yùn)用這兩種技術(shù)能夠?qū)Ψ肿咏Y(jié)構(gòu)有更加完整的分析。

在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，本文綜合利用紅外和拉曼光譜技術(shù)以探究紅酵母RS1高耐鋁過程中，細(xì)胞表面官能團(tuán)及相應(yīng)生物大分子的光譜信息變化，期望對(duì)酵母鋁吸附基團(tuán)具有更加全面準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)，以進(jìn)一步探索紅酵母RS1的高耐鋁機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造公司；D-8PC分光光度計(jì)，南京菲勒儀器有限公司；HVE-50滅菌鍋，日本株式會(huì)社平山制作所；SIGMA 4-16K離心機(jī)，美國(guó)默克公司；LABCONCO 2.5L凍干機(jī)，美國(guó)Labconco公司；Nicolet 8700紅外光譜儀，美國(guó)尼高利儀器公司；DXP 780拉曼光譜儀，美國(guó)尼高利儀器公司；六水合氯化鋁(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；酵母提取物(IVD)，OXOID；蛋白胨(生物試劑)，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；瓊脂(IVD)，OXOID。

1.2 試驗(yàn)材料

采用高耐鋁紅酵母RS1(RS1)(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)2.4753)為試驗(yàn)材料。

1.3 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)采用低pH低磷低鎂培養(yǎng)基(LPM)，其中鎂、磷濃度均為 0.1 mmol/L，pH為3.5，具體組分參照文獻(xiàn)[21]。采用 50 mmol/L 琥珀酸作為 pH 緩沖液。將1 mol/L的鋁母液抽濾滅菌后加入高溫滅菌后的LPM培養(yǎng)基，獲得不同鋁濃度的LPM培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)在 30℃、200 r/min下進(jìn)行。固體培養(yǎng)基采用酵母浸提粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)，包含1% 酵母提取物、2% 葡萄糖、2% 蛋白胨和1% 的瓊脂粉，pH為自然pH。固體培養(yǎng)在30℃倒置靜止進(jìn)行。

1.4 酵母菌RS1的培養(yǎng)過程

從YPD平板上挑取單個(gè)RS1菌落，活化至對(duì)數(shù)期后接種到LPM液體培養(yǎng)基中。前期研究表明，在LPM培養(yǎng)基中70 mmol/L的鋁濃度對(duì)RS1產(chǎn)生顯著抑制作用[13]。故將RS1菌體分別接入鋁濃度為0和70 mmol/L的LPM培養(yǎng)中。培養(yǎng)24 h后取樣，通過檢測(cè)OD600確定菌株的生長(zhǎng)狀況。然后，3 000離心 5 min收集菌體，除去上清液，用滅菌的去離子水清洗3次后，對(duì)菌體進(jìn)行冷凍干燥處理。冷凍干燥后的菌體樣品進(jìn)行光譜分析。

1.5 光譜測(cè)定及光譜數(shù)據(jù)處理

傅里葉紅外光譜(FTIR)測(cè)定：稱取2 mg菌體與200 mg溴化鉀混勻、壓片，制備好后，用Nicolet 8700紅外光譜儀測(cè)定，測(cè)量范圍為4 000 ~ 400 cm–1，每次試驗(yàn)對(duì)信號(hào)進(jìn)行32次掃描累加，儀器分辨率為 4 cm–1。

拉曼光譜(Raman)測(cè)定：稱取適量菌體放于平板式通用樣品架上，置于樣品室內(nèi)，采用DXP 780拉曼光譜儀檢測(cè)，用波長(zhǎng)為780 nm的激光激發(fā)，積分時(shí)間5.0 s，測(cè)量范圍為3 500 ~ 160 cm–1。

每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)重復(fù)，譜圖均采用OMNIC 9.0軟件進(jìn)行處理，自動(dòng)基線校正、自動(dòng)平滑后取平均光譜進(jìn)行分析，繪圖采用Origin 8.0軟件。所得數(shù)據(jù)采用WPS 2019和SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(unpaired Student's t-test)來檢測(cè)不同處理在<0.05條件下的顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅酵母RS1對(duì)鋁的耐性

在LPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組的OD600值為1.599，而70 mmol/L 鋁處理組的OD600值為1.001(圖1)?？梢?，相應(yīng)濃度的鋁處理顯著抑制了RS1菌體的生長(zhǎng)量，約抑制了RS1菌體37% 的生長(zhǎng)量。

(圖中*表示處理間差異在P<0.05水平顯著，下圖同)

2.2 紅酵母RS1菌體的傅里葉紅外光譜

圖2為紅酵母RS1在無(wú)鋁和70 mmol/L鋁處理下的傅里葉紅外光譜圖?？梢钥闯觯t酵母RS1的傅里葉紅外光譜吸收峰種類較多，在整個(gè)波數(shù)范圍內(nèi)均有吸收。表1列舉了RS1酵母細(xì)胞主要紅外光譜信號(hào)峰可能對(duì)應(yīng)的生物大分子。由表1可見，RS1的光譜圖主要包括幾丁質(zhì)的O–H和仲胺的N–H的伸縮振動(dòng)峰(3 283 cm–1)、蛋白質(zhì)特征峰(1 645、1 543、1 240 cm–1)、甲基和亞甲基的吸收峰(2 923、1 455 cm–1)，2 853 cm–1處的峰可能為脂肪酸C–H骨架的吸收峰，1 076 cm–1處的峰可能是細(xì)胞壁中碳水化合物的C–O伸縮振動(dòng)峰，1 403 cm–1處的峰可能是羧基的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1 744 cm–1處的峰可能是酯羰基峰[22]。此外，還有1 377 cm–1和2 923 cm–1處的吸收峰，表明RS1細(xì)胞表面含有β-1,3葡聚糖，804 cm–1處的吸收峰可能為甘露聚糖峰[23]。

圖2和表1結(jié)果還顯示，在鋁處理后，804 cm–1處的吸收峰消失，推測(cè)甘露聚糖與鋁結(jié)合使得結(jié)構(gòu)發(fā)生變化以致吸收峰消失；1 403 cm–1處的吸收峰移至1 397 cm–1，表明羧基的C–O鍵發(fā)生位移，且吸收峰強(qiáng)度降低至對(duì)照的44.3%(圖3)。鋁處理后在1 706 cm–1處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，這可能來自羰基基團(tuán)。為了描述紅酵母RS1鋁處理后細(xì)胞中生物大分子的變化規(guī)律，本文總結(jié)了鋁處理后主要特征峰的強(qiáng)度變化(圖3)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，鋁處理后多糖類吸收峰強(qiáng)度無(wú)顯著變化(1 076 cm–1)，酰胺I帶吸收峰(1 645 cm–1)強(qiáng)度顯著上升，這個(gè)蛋白質(zhì)特征峰強(qiáng)度的增加，暗示RS1在鋁脅迫下蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)。

圖2 RS1傅里葉紅外光譜圖

2.3 紅酵母RS1菌體的拉曼光譜

圖4為紅酵母RS1在無(wú)鋁和70 mmol/L鋁處理下的拉曼光譜圖。表2列舉了RS1酵母細(xì)胞主要拉曼光譜信號(hào)峰可能對(duì)應(yīng)的生物大分子。如圖4和表2所示，紅酵母RS1拉曼譜光圖中1 002 cm–1處的峰來源于苯丙氨酸單基取代苯基環(huán)，1 083 cm–1處的峰屬于核酸和脂類，1 153 cm–1處的峰屬于蛋白質(zhì)，1 289 cm–1處的峰屬于脂類，1 450 cm–1處的峰屬于脂類和蛋白質(zhì)，1 656 cm–1處的峰主要來自蛋白酰胺I的C=O伸縮振動(dòng)，屬于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋結(jié)構(gòu)[24-26]。

圖4和表2還顯示，鋁處理后RS1出現(xiàn)了3個(gè)新的特征峰，分別是779 cm–1核糖核酸(RNA)峰、856 cm–1的酪氨酸峰和1 270 cm–1酰胺Ш帶峰。然而，檢測(cè)到的特征峰并無(wú)明顯漂移現(xiàn)象，也無(wú)顯著強(qiáng)度變化(圖5)。

表1 RS1酵母細(xì)胞傅里葉紅外光譜主要信號(hào)峰可能對(duì)應(yīng)的生物大分子(基團(tuán))[22-23]

注：–表示未檢測(cè)到此峰，下表同。

(圖中顯示的峰位置為對(duì)照組峰位置，下圖同)

圖4 RS1拉曼光譜圖

表2 RS1酵母細(xì)胞拉曼光譜主要信號(hào)峰可能對(duì)應(yīng)的生物大分子(基團(tuán))[24-26]

圖5 RS1鋁處理及對(duì)照的拉曼光譜特征峰強(qiáng)度

3 討論

傅里葉紅外光譜結(jié)果顯示，紅酵母RS1的無(wú)鋁對(duì)照組在804 cm–1處檢測(cè)出甘露聚糖吸收特征峰，但鋁處理后此峰消失，推測(cè)甘露聚糖參與對(duì)鋁的固定過程使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。Kapoor和Viraraghavan[27]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁甘露聚糖對(duì)金屬離子表現(xiàn)出很強(qiáng)的吸附能力。鋁處理下RS1羧基的C-O鍵發(fā)生位移，由1 403 cm–1移至1 397 cm–1，紅移6 cm–1，同時(shí)峰強(qiáng)度減弱。這種位移歸屬于羧基陰離子與陽(yáng)離子的結(jié)合，說明羧基基團(tuán)可能參與了對(duì)鋁的吸附作用。已有研究報(bào)道，釀酒酵母細(xì)胞表面羧基基團(tuán)在對(duì)銅離子和鉛離子等金屬離子吸附中起重要作用[28-29]，表明羧基對(duì)酵母抵御金屬離子脅迫的貢獻(xiàn)可能具有廣泛性。同時(shí)在1 706 cm–1處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，可能來自羰基基團(tuán)，說明羰基也是RS1對(duì)鋁的吸附位點(diǎn)。而拉曼光譜中RS1鋁處理組在1 270 cm–1新出現(xiàn)的酰胺Ш帶吸收峰，在856 cm–1處出現(xiàn)酪氨酸吸收峰，表明酰胺基和酪氨酸也是鋁離子吸附位點(diǎn)。任錚宇等[30]也發(fā)現(xiàn)，嗜重金屬菌菌體表面的羰基和酰胺基等官能團(tuán)在對(duì)金屬離子的吸附中起關(guān)鍵作用。前人大量研究表明，細(xì)胞表面羥基是酵母吸附金屬離子的一個(gè)重要位點(diǎn)[17-18, 28-29]，但在本研究中并未發(fā)現(xiàn)RS1的羥基峰對(duì)鋁處理有明顯響應(yīng)，這可能與吸附的金屬離子不同，或與不同菌株之間的差異相關(guān)。

鋁處理后的RS1紅外光譜特征峰酰胺I帶吸收峰(1 645 cm–1)和酰胺Π帶吸收峰(1 543 cm–1)吸收強(qiáng)度均顯著增加，這兩個(gè)蛋白質(zhì)特征峰強(qiáng)度的變化表明鋁處理后RS1細(xì)胞的部分蛋白質(zhì)合成增加。李金金等[31]采用拉曼光譜對(duì)鋁處理后土生隱球酵母檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)類峰強(qiáng)度下降，這是鋁毒誘導(dǎo)土生隱球酵母細(xì)胞發(fā)生凋亡引起的。鮑改玲等[32]用ZnSO4處理啤酒酵母時(shí)，發(fā)現(xiàn)處理后蛋白質(zhì)特征峰的吸光度下降，認(rèn)為是蛋白質(zhì)參與結(jié)合Zn2+所致。鋁脅迫下RS1蛋白質(zhì)增加或許與RS1高耐鋁性相關(guān)。

傅里葉紅外光譜和拉曼光譜研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了可能參與鋁吸附的不同官能團(tuán)，傅里葉紅外光譜主要有羧基和羰基，拉曼光譜主要是酰胺基。因此，傅里葉紅外光譜和拉曼光譜技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，能夠更加全面地揭示RS1細(xì)胞表面與鋁吸附相關(guān)的官能團(tuán)，充分發(fā)掘其耐鋁機(jī)制。黃皓等[20]曾將紅外和拉曼光譜技術(shù)結(jié)合用于對(duì)釀酒酵母吸附Pb2+、Cd2+的相互作用機(jī)理研究，通過紅外光譜發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對(duì)Pb2+、Cd2+的吸附主要與羥基和羧基官能團(tuán)有關(guān)，然后通過這兩個(gè)基團(tuán)對(duì)應(yīng)的拉曼光譜峰強(qiáng)度的增加進(jìn)一步確定其參與釀酒酵母的吸附過程。由此可見，兩種光譜技術(shù)所得結(jié)果既可以相互驗(yàn)證，也可以相互補(bǔ)充，結(jié)合起來使用增強(qiáng)了研究結(jié)果的可信度，也使得研究結(jié)果更加全面。綜上所述，紅酵母RS1細(xì)胞表面對(duì)鋁有吸附固定作用的生物大分子主要是細(xì)胞壁多糖以及蛋白質(zhì)，羧基、羰基、酰胺基對(duì)鋁的吸附固定作用可能是RS1具有高耐鋁性的重要機(jī)理之一。這些基團(tuán)或許也參與了其他耐鋁微生物對(duì)鋁的吸附過程，對(duì)研究其他耐鋁微生物對(duì)鋁吸附基團(tuán)有一定借鑒和參考作用，并為微生物的耐鋁性研究提供了一定的理論依據(jù)。對(duì)于高耐鋁微生物耐鋁機(jī)制的研究，不僅補(bǔ)充了生物的耐鋁機(jī)制，為植物耐鋁毒機(jī)制的研究提供一種新視角，而且高耐鋁特征有助于篩選和通過遺傳改良獲得抗鋁毒害能力較強(qiáng)的植物品種，這是解決酸性土壤中鋁毒害的高效途徑之一。因此，高耐鋁微生物的特性研究對(duì)酸性土壤的改良與修復(fù)、生產(chǎn)潛力提升有重大意義。

4 結(jié)論

紅酵母RS1細(xì)胞表面與鋁吸附相關(guān)的物質(zhì)主要是細(xì)胞壁葡聚糖,主要涉及的官能團(tuán)包括羧基、羰基和酰胺基。這些細(xì)胞表面官能團(tuán)對(duì)鋁的固定作用可能是紅酵母RS1高耐鋁的一個(gè)重要機(jī)制。

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Infrared Spectroscopy and Raman Spectroscopy Study on High Resistant AluminumRS1

CHENG Si1,2,WANG Chao1,SHEN Renfang1,2*

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

RS1 is a high aluminum resistantstrain selected from acid soil of oil tea in Yingtan of Jiangxi Province, which can tolerate aluminum concentration up to 200 mmol/L. Previous studies have showed that RS1 can immobilize aluminum on the cell surface and block it from entering the cell. However, it is unclear what kind of group on the cell surface is involved in aluminum fixation. In this paper, Fourier transform infrared spectroscopy and Raman spectroscopy were used to study the surface functional group changes of RS1 cells under aluminum stress in order to explore the high aluminum resistance mechanism of RS1 from the perspective of spectroscopy. It was found that the absorption peak at 1 403 cm–1in the IR spectrum of RS1 was red shifted to 1 397 cm–1after treatment with 70 mmol/L aluminum for 24 h, which may be a carboxyl group. A new absorption peak appeared at 1 706 cm–1, which may be a carbonyl peak. The absorption peak intensities of amide I band in the IR spectrum with aluminum treatment were significantly increased and the mannan peak disappeared. The new absorption peaks of the Raman spectrum at 779 cm–1, 856 cm–1and 1 270 cm–1may be the absorption peaks of RNA, tyrosine and amide Ш band, respectively. The results of IR and Raman spectroscopy show that the substances related to aluminum adsorption on the surface of RS1 cells are mainly polysaccharides and proteins of cell wall, and the main functional groups include carboxyl groups, carbonyl groups and amide groups. The immobilization of aluminum by these functional groups on cell surface may be an important mechanism for the high aluminum tolerance ofRS1.

; Aluminum toxicity; Fourier transform infrared spectrum; Raman spectroscopy

S154.3

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.06.009

程思, 王超, 沈仁芳. 高耐鋁紅酵母RS1的紅外光譜和拉曼光譜研究. 土壤, 2020, 52(6): 1158–1163.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41501328)和中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目(XDB15030302)資助。

(rfshen@issas.ac.cn)

程思(1994—)，女，安徽滁州人，碩士研究生，主要從事生物逆境機(jī)制研究。E-mail：chengsi@issas.ac.cn