蘇青青,酈春蓉,王先云,張 東,黃 鑫

(1.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,上海200444;2.城市水資源開發(fā)利用(南方)國家工程研究中心,上海200082)

隨著經(jīng)濟發(fā)展和排污工作的展開,城市水源地的富營養(yǎng)化問題日益突出.如果不重視預(yù)警監(jiān)測,那么后期可能會面臨藻類爆發(fā)風(fēng)險[1-2].因此,水中藻的快速定量成為一個重要命題.傳統(tǒng)的藻定量方法包括藻顆粒計數(shù)法、以葉綠素chla為代表的色素定量法、干重法等[3-4].傳統(tǒng)的藻顆粒計數(shù)法將水中藻打散后對單藻進行計數(shù),工作量大,計數(shù)誤差也較大.葉綠素a法和干重法無法實現(xiàn)連續(xù)測定;直接熒光探頭法和庫爾特細胞計數(shù)法測定簡單,適宜監(jiān)測,但易受其他因素如渾濁度、水質(zhì)等影響;流式細胞計數(shù)顯微計數(shù)法[5]在監(jiān)測藻團密度和大小分布方面準(zhǔn)確性較高,但無法對水中龐雜的藻種進行分類.

在自然水體中,數(shù)量占優(yōu)的藻種往往容易聚集成藻團[6].在局部水域遷移聚集過程中,粒徑較大的藻團易于在水體表層聚集[7-8].受風(fēng)的影響,漂浮于水體表面的藻易積聚成帶團狀聚集體,沿下風(fēng)向運動遷移,從而形成水華[9].從供水角度出發(fā),水中不同大小、形態(tài)特征各異的顆粒物與自來水廠的凈化效率有直接的聯(lián)系.顆粒大小是影響水處理工藝效率的關(guān)鍵因素,由于水體中藻類顆粒的大小大多在2～200μm,極少數(shù)小于2μm,因此含藻原水進入水廠后水質(zhì)將惡化,干擾水處理,具體表現(xiàn)為濾料層堵塞、老化池壁及致臭等.利用計算機圖形圖像算法,快速檢測水中聚集成團藻的形態(tài)學(xué)特征值,能在現(xiàn)有藻密度、種屬檢測基礎(chǔ)上形成新的數(shù)據(jù),為水中藻形態(tài)的自動快速測定提供前期研究,為水庫及下游水廠的藻類防控工作提供技術(shù)支持.本工作于2015年3～7月對華東某水源水庫進行采樣,通過顯微鏡檢測水中藻種,獲取清晰圖像照片,并定量水中團簇藻團的2維投影特征值,進而開展數(shù)據(jù)相關(guān)性分析,以及利用特征值統(tǒng)計學(xué)算法進行藻的定量分析.

1 材料與方法

1.1 采樣點設(shè)置

圖1為華東某水源采樣點分布圖.該水源水庫水量豐富、水質(zhì)優(yōu)良,是該地區(qū)供水的戰(zhàn)略儲備.但其庫容較大,水體流速相對緩慢,藻類容易增殖.該水庫地處長江口,水質(zhì)受到上游長江來水和人類活動的影響.監(jiān)測表明,該水庫總磷平均質(zhì)量濃度為0.10 mg/L,最高為0.15 mg/L,總氮平均質(zhì)量濃度為1.80 mg/L,最高為2.00 mg/L[10].考慮該水源水庫的水文、地形和供水區(qū)域等因素,在庫區(qū)設(shè)置6個監(jiān)測點,各監(jiān)測點分布如圖1所示.圖中1#、2#為庫尾站點;3#為庫中站點;4#為墾區(qū)站點;5#為庫首站點.

1.2 樣品采集與分析

2015年3～7月,該水庫為人工水庫,水深3～8 m.為減小采樣誤差,現(xiàn)場采用多層采樣方法,同一取樣點采集表層(0.5 m)、中層(3.0～5.0 m)和底層(沉積物以上0.5 m)水樣進行混合,后期頻率為每月一次;水樣采集后立即用魯哥式碘液固定(10 mL碘液加入到1 000 mL水樣中),固定后的水樣靜置沉淀24～36 h;充分沉淀后取底部沉淀和上浮邊壁藻濃縮液20～25 mL,加入質(zhì)量分數(shù)為3%的福爾馬林溶液保存并盡快測定.上述過程參照《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》和《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第二版)》.

1.3 數(shù)據(jù)采集和處理

將濃縮沉淀后的水樣充分搖勻后,光學(xué)顯微鏡(LAO-1100B,上海)下開展藻類形態(tài)學(xué)觀察,依據(jù)《中國常見淡水藻志》[11]對每個藻種進行辨別鑒定至屬或種水平,統(tǒng)計藻種數(shù)量.每個樣品重復(fù)計數(shù)3次,取平均值.同時通過與顯微鏡連接的數(shù)碼攝像頭進行圖像采集,分辨率為2 592(H)×1 944(V).圖像后期處理經(jīng)Image-Pro Plus 6.0軟件測定面積、圓度、長短軸等8種2維平面形態(tài)學(xué)指標(biāo).所有指標(biāo)的統(tǒng)計分析在R語言平臺實現(xiàn),利用Rpart包實現(xiàn)分類回歸樹(classification and regression tree,CART)方法構(gòu)建優(yōu)勢藻種識別模型.

圖1 華東某水源水庫采樣點分布Fig.1 Distribution of sampling sites in a water source reservoir of East China

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢藻種分析

2015年3～7月藻種分布的演替規(guī)律明顯(見圖2).在門水平上,3、4月份黃藻門占據(jù)絕對優(yōu)勢,占總藻密度的78.9%～92.6%,對應(yīng)的藻密度在1.59×106～7.03×107cell/L之間;5月份氣溫上升,黃藻門數(shù)量急劇減少,同時綠藻門、隱藻門比例有所增大,黃藻門仍占據(jù)相對優(yōu)勢;6、7月份綠藻門及硅藻門占據(jù)優(yōu)勢,藍藻數(shù)量隨時間推移有一定增加.具體到種屬層面,3、4月份黃絲藻占總藻密度比例超過90%;5月份開始急劇減少;6月份達到最低值后,7月份又略有增加.期間,硅藻門中的小環(huán)藻、冠盤藻在5月份后數(shù)量有較明顯的增加.而該年度秋冬季(9月份之后),硅藻門的小環(huán)藻成為優(yōu)勢藻種(數(shù)據(jù)未列出).藻種分布變化的原因顯然受氣溫影響較大,黃絲藻呈現(xiàn)春季多夏季少的特點,原因是春季水溫適宜,適合黃藻門的黃絲藻生長;但夏季光照充足,水溫相對較高,對黃絲藻生長不利,這與文獻[12]中黃絲藻適宜低溫生長的結(jié)論一致.

2.2 主要藻種的藻團形態(tài)學(xué)特征

2015年2～12月間,除少數(shù)難以鑒定的藻種外,本工作共計辨識出93種藻種,累計處理圖形對象5 952個,其中出現(xiàn)頻次最高的是黃藻門的黃絲藻,其次是硅藻門的小環(huán)藻.考慮到藻種種類繁多,本工作選取前20種出現(xiàn)頻次不小于10的藻種(圖3中自上而下排列)作為主要藻種,考察其面積、圓度、長徑、長短徑比值等形態(tài)特征(見圖3).

圖3中,不同藻種4種參數(shù)相差顯著.面積上,黃絲藻和偽魚腥藻的藻團面積分別為(555.0±397.0)μm2和(318.0±293.0)μm2,面積平均值大,說明藻種自身體型較大;而小的藻種如小環(huán)藻僅為(55.2±54.4)μm2,是黃絲藻的六分之一,偽魚腥藻的十分之一左右(見圖(a)).藻團2維投影的長徑數(shù)據(jù)也表明黃絲藻和偽魚腥藻顯著高于其他藻類(見圖(b));藻團長短徑比值上,除黃絲藻和偽魚腥藻,其余藻團的長短徑的比值都小于3,而黃絲藻和偽魚腥藻分別達到7和30左右(見圖(c)).黃絲藻和偽魚腥藻的圓度值也較高.圖4為黃絲藻、小環(huán)藻和偽魚腥藻的顯微鏡檢圖,從圖中可以直觀地看出三者自身形態(tài)及藻團面積的明顯差異.

圖2 2015年3～7月藻種分布Fig.2 Distribution of algal species from March to July 2015

圖3 主要藻種的形態(tài)參數(shù)分布特征對比Fig.3 Comparisons of morphological parameter distribution characteristics of main algal species

圖4 主要藻種的顯微鏡檢圖Fig.4 Microscopic pictures of main algal species

2.3 藻團2維投影形態(tài)特征值的應(yīng)用

優(yōu)勢藻種中的黃絲藻為長鏈型絲狀藻,藻團體形狹長,形態(tài)學(xué)特征與其他藻種的藻團差異明顯.理論上,藻團投影面積側(cè)面反映了藻種數(shù)量的多少.在藻數(shù)量增加的同時,藻團投影面積也必然增大.如有學(xué)者建立微囊藻群體投影面積與細胞數(shù)之間的回歸方程,以估算藻細胞數(shù)[13].但是否在實際水樣中適用,還需要進一步檢驗.

選取水中的優(yōu)勢藻種,包括出現(xiàn)頻次較高的小環(huán)藻、黃絲藻,以及形態(tài)學(xué)上有顯著不同的偽魚腥藻.對每個水樣中3種藻的藻團投影面積與藻團密度展開相關(guān)性分析(見圖5),其他藻類全部歸在第4類中.圖5中,只有黃絲藻的密度和投影面積呈現(xiàn)較高的相關(guān)性(R2=0.712),而藻的總密度和總面積之間的相關(guān)性不高(R2=0.430,數(shù)據(jù)未作圖).顯然由于藻種種類繁多(顯微鏡檢下能辨識的多達93種),形狀規(guī)則程度不同(見圖3),因此與文獻中的結(jié)論并不完全一致[14].而對單一藻種,如因密度大而為優(yōu)勢藻的黃絲藻,其藻團狹長、投影面積大,具有較好的辨識度,因此與藻密度具有較好的相關(guān)性.進一步地,二者的關(guān)聯(lián)隨時間變化呈現(xiàn)基本同步的特征(見圖(a)),3、4月份藻密度和藻團面積均最大,此后逐步降低.這與溫度升高后,水庫中優(yōu)勢藻種更替有關(guān).5月開始藍藻、硅藻增多,8月后優(yōu)勢藻不再是黃絲藻.由此可見,形態(tài)學(xué)特征顯著是顯微鏡自動辨識的基本要求.藻團2維投影面積定量藻種密度具有不確定性,作為單一指標(biāo)不夠精確,故需要引入藻團形態(tài)特征等其他參數(shù)以進一步提升辨識精度.

圖5 黃絲藻、小環(huán)藻和偽魚腥藻藻種投影面積與藻種密度的相關(guān)性Fig.5 Correlation between the projected area and algal species density of Tribonema,cyclotella and Pseudoanabaena

進一步參照文獻[15-17]中的參數(shù)選取,考察面積、圓度、長短軸比等2維平面形態(tài)學(xué)指標(biāo),作為優(yōu)勢藻種鑒別參數(shù)的可行性.于2015年2月～2016年8月(為期18個月),水庫內(nèi)的所有點位水樣顯微鏡檢測藻團對象共計9 438個,按照小環(huán)藻、黃絲藻、偽魚腥藻和其他4種分類對象進行分類(見圖6).選擇黃絲藻和小環(huán)藻是因為調(diào)研中出現(xiàn)的頻次較高,而考慮到夏季偽魚腥藻疑似為水中2-甲基異莰醇(2-methylisoborneol,2-MIB)的來源藻種[18],且是大型絲狀藻種,藻團面積較大,因此在上述2種優(yōu)勢藻種外加入偽魚腥藻,其余藻種一律歸為“其他”類別.最終,將9 438個藻團對象分成4類,作為因變量y.將長徑、短徑、長短徑比、圓度、面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)作為輸入數(shù)據(jù),同時考慮時間也是主觀判斷的一個重要因素,故月份數(shù)據(jù)也作為輸入變量之一,上述數(shù)據(jù)為自變量x.構(gòu)建通過X(自變量)計算得到Y(jié)(因變量,藻種類別)的分類回歸樹.

從分類效果看(見圖6),黃絲藻、偽魚腥藻和小環(huán)藻3個藻種顯微圖片的總體加權(quán)分辨率分別達到83%、86%和68%,其中前二者的辨識率較高,與黃絲藻和偽魚腥藻藻團面積大、形狀狹長、容易辨認有關(guān).因此,基于藻團輪廓的形態(tài)學(xué)特征可達到部分辨識優(yōu)勢藻團目的,提供包括藻團面積、粒徑、形狀及上述參數(shù)時空分布的有用信息.

圖6 優(yōu)勢藻種顯微圖的分辨效果(2015年2月～2016年8月)Fig.6 Resolution effect of microscopic pictures of dominant algal species(February 2015～August 2016)

本工作基于顆粒物大小對水廠水處理的影響,著重解決水中藻團粒徑分布的快速檢測.本工作重點不是藻的分類,而是快速檢測出優(yōu)勢藻種,為2維投影作為藻的圖形圖像學(xué)特征提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為水中藻形態(tài)的自動快速測定提供前期研究,最終化繁為簡,實現(xiàn)藻種辨識和統(tǒng)計分析目標(biāo).圖4中藻細胞的輪廓大小清晰可見,甚至部分大型藻細胞的內(nèi)部細節(jié)也可看到.但不可否認,清晰的圖像能夠提供更多的細節(jié),從而為后期的模型提供更多的圖像特征值.例如,通過對比度的閾值設(shè)置,提取有內(nèi)部氣泡的藻類,或通過藻細胞體內(nèi)色素的熒光特性,獲取熒光特征值,從而提升模型準(zhǔn)確度[19-22].靳雪萊等[23]建立了基于熒光比值特征和多元線性回歸的識別方法,其實地采集樣品的誤差僅為10.86%.

不僅僅是監(jiān)測儀器的升級,模型測試集和訓(xùn)練集的合理劃分、藻細胞特征值的挖掘等也都是未來亟待研究的內(nèi)容.值得注意的是,實際研究中需要動態(tài)監(jiān)測1 mL水樣中數(shù)以萬計的藻類.如何在圖像準(zhǔn)確度與快速測定之間取得平衡,也是研究中需要考慮的.

3 結(jié)論

(1)2015年3～7月開展某水源水庫優(yōu)勢藻種顯微圖像數(shù)字化分析.出現(xiàn)頻次最高的是黃藻門的黃絲藻,其次是硅藻門的小環(huán)藻和冠盤藻.

(2)通過圖形圖像數(shù)字化分析,得到藻團2維投影面積.其中優(yōu)勢藻種黃絲藻的投影面積和藻密度呈現(xiàn)較高的相關(guān)性(R2=0.712),而其他藻種的相關(guān)性均較小.因為黃絲藻為長鏈型絲狀藻,藻團體形狹長,所以其2維投影的面積、長徑及長短徑比值等顯著高于其他藻種,形態(tài)學(xué)特征明顯.

(3)采用分類回歸樹方法開展2015年3～12月期間原水樣品中黃絲藻、小環(huán)藻和偽魚腥藻3種典型藻種的統(tǒng)計回歸分類,分辨效果良好,分辨率分別達83%、68%和86%.

(4)藻團2維投影特征度量方法結(jié)合圖像識別技術(shù),可提供藻團面積、粒徑、形狀參數(shù)及這些參數(shù)的時空分布,同時辨識優(yōu)勢藻團.后續(xù)將獲取更多圖像特征值結(jié)合算法優(yōu)化,有望實現(xiàn)水中藻團的快速識別與特征測量.