程少浩，蘇艷軍，程若川

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650031

甲狀腺球蛋白（Tg）作為一種甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞分泌的特異性蛋白（660 kDa），通常儲存在甲狀腺濾泡中，在正常甲狀腺濾泡細(xì)胞或分化型甲狀腺癌（DTC）細(xì)胞中均可分泌。甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）屬于G 類免疫球蛋白，主要來源于浸潤甲狀腺組織的淋巴細(xì)胞，常見于自身免疫性甲狀腺疾病。Tg 作為DTC 患者甲狀腺全切或近全切除術(shù)后（不論是否行131I治療）常規(guī)而有效的監(jiān)測指標(biāo)，易受到TgAb 的干擾；其次，DTC患者血清TgAb陽性率達(dá)30%，TgAb可干擾血清Tg 檢測導(dǎo)致Tg 假陰性，使得Tg 不能作為TgAb 陽性DTC 患者隨訪監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)的血清標(biāo)志物。本研究對TgAb 干擾血清Tg 檢測的相關(guān)因素作一綜述，以期提高Tg 檢測的準(zhǔn)確性，為臨床醫(yī)師對TgAb陽性患者的管理提供參考。

1 血清TgAb檢測方法的干擾

1.1 TgAb 的異質(zhì)性 TgAb 的異質(zhì)性可導(dǎo)致同一樣本用不同方法測定的TgAb 相差100 倍，當(dāng)血清TgAb 較低（1～2 IU/mL）時部分血清表現(xiàn)出這種檢測結(jié)果的差異性，而TgAb 值很高（＞1 000 IU/mL）的血清則差異性較?。?-2］。SPENCER 等［1］對 785 例患者用4 種不同免疫測定法檢測血清TgAb，發(fā)現(xiàn)用不同方法檢測同一樣本的TgAb值不一致，反映了血清TgAb的異質(zhì)性，認(rèn)為是由于循環(huán)TgAb對Tg抗原、檢測試劑和各種方法使用標(biāo)準(zhǔn)的特異性不同而造成的。PICKETT 等［3］也發(fā)現(xiàn)了相似的觀點，認(rèn)為TgAb不是單一的分子實體，而是免疫球蛋白混合物，具有與Tg 相互作用的能力。對于測定結(jié)果的不一致，在排除了研究對象特異性、Tg 干擾程度以及抗體陽性或陰性樣品的特定臨界值、TgAb 敏感性等因素外，多考慮與內(nèi)源性TgAb 具有不同表位有關(guān)。目前為止沒有一項免疫測定法可以檢測出所有的TgAb，大多數(shù)的免疫測定法只是檢測出了TgAb 的一個子集［1，3］，而其余 TgAb 子集即使沒有被檢測到，實際上也能干擾Tg的測定。

1.2 TgAb的臨界值

1.2.1 TgAb 臨界值的分類 目前臨床常采用的血清TgAb 截點值包括檢測限（LoD）≥0.07 U/mL、功能敏感性（FS）≥0.31 U/mL、制造商臨界值（MCO）≥4.11 U/mL、機(jī)構(gòu)臨界值（ICO）≥10 U/mL。

1.2.2 TgAb 臨界值選取的意義 TgAb 臨界值的選取是一個重要而又有爭議的問題。根據(jù)截點值選取的不同，有研究發(fā)現(xiàn)針對不同的TgAb 臨界值，所測得的TgAb 狀態(tài)（陽性或陰性）不同［4-5］。SPENCER等［2］的研究中，當(dāng)用MCO 作為臨界值用于確定TgAb的存在時，許多顯示干擾的樣本被錯誤地歸類為TgAb 陰性，并且在某些情況下，這些錯誤分類的樣本對 Tg 測定顯示出顯著干擾。DEKKER 等［6］對 230例患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用LoD＞0.07 U/mL及FS≥0.31 U/mL 分別作為TgAb 陽性的臨界值時，所有患者被歸類為 TgAb 陽性；而采用 MCO≥4.11 U/mL 時有23.9%的患者為TgAb 陽性，采用ICO≥10 U/mL時僅14.8%患者為TgAb 陽性；該研究認(rèn)為LoD 和FS 作為定義DTC 患者放射性碘消融治療期間TgAb陽性的臨界水平，在臨床實踐中并不實用，因為其對Tg 測定值存在嚴(yán)重干擾，使Tg 不能作為腫瘤標(biāo)記物。由于幾乎所有患者的TgAb高于這些臨界值，在臨床實踐中使用MCO 或ICO 作為臨界值似乎更合理。與此同時，基于MCO 或ICO 為臨界值定義的TgAb 陽性患者與TgAb 陰性患者相比，在腫瘤特征和危險性方面沒有差異，這意味著TgAb陽性不應(yīng)被視為單獨的危險因素，也不應(yīng)該被視為危險分層的獨立因素。但是目前為止，尚無關(guān)于TgAb陽性定義的臨床共識，因為這些研究都是基于所在實驗室定義的TgAb臨界值來進(jìn)行的。

2 不同TgAb檢測方法間的干擾

2.1 Tg 恢復(fù)實驗的干擾 目前，TgAb 的檢測方法主要是通過Tg 恢復(fù)實驗間接測定TgAb 和免疫測定法。Tg 恢復(fù)實驗是將外源性Tg 添加到等分量的血清試劑中，經(jīng)免疫測定法測定添加前后的Tg 值，添加后與添加前測定的Tg 值比值大于80%則表示無TgAb 干擾［7］。在恢復(fù)實驗的過程中必須保證添加的外源性Tg 和內(nèi)源性Tg 在免疫學(xué)上表現(xiàn)一致；其次，對于添加的Tg 類型和數(shù)量也要嚴(yán)格控制，因為Tg 具有表位特異性，所以正常甲狀腺組織、切除后殘留甲狀腺組織以及腫瘤細(xì)胞分泌的Tg 可表現(xiàn)出不同的檢測結(jié)果；最后，免疫測定法優(yōu)先測定游離Tg，對于添加外源性Tg 數(shù)量過多時，TgAb 結(jié)合位點趨于飽和，容易造成游離的外源性Tg 過量，從而使添加前后Tg比值過高，相對于等量外源性Tg來說具有顯著的TgAb 干擾作用［7-8］。雖然Tg恢復(fù)實驗操作簡單，但其判斷TgAb 干擾的可靠性較差，現(xiàn)已很少應(yīng)用［3，9］。

2.2 TgAb 免疫測定法的誤差 對于TgAb 免疫測定法，由于各個實驗室有自己的參考標(biāo)準(zhǔn)，即使大部分的TgAb 檢測試劑盒都是根據(jù)國際IRP-65/93 參考制劑作為一級標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)的，但也有研究顯示不同的TgAb測定方法間差異較大，使用不同方法測定同一樣本中的TgAb存在100倍誤差［1］。最近的一項研究評價了11 種自動化免疫檢測方法對TgAb檢測的一致性，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果的第25百分位數(shù)相差48 倍（0.24 IU/mLvs11.5 IU/mL），第75 百分位數(shù)相差30 倍（0.59 IU/mLvs17.97 IU/mL），表明不同方法測定的TgAb 結(jié)果差異較大［10］。造成這種不一致的原因可能與Tg 特異性、檢測試劑差異、TgAb 敏感性和異質(zhì)性以及TgAb臨界值選取差異等有關(guān)，這種方法間的差異極易使血清Tg 檢測受到影響，造成DTC 術(shù)后管理不當(dāng)。針對這種差異，臨床醫(yī)生在DTC 患者的隨訪中必須使用相同方法來監(jiān)測TgAb水平，另一方面，實驗室必須及時通知臨床醫(yī)生TgAb方法的改變，以便重新定義基線。

3 血清Tg檢測方法的干擾

Tg分析的功能敏感性定義為在6～12個月內(nèi)使用至少兩個不同批次的試劑和兩臺儀器校準(zhǔn)，測量變異系數(shù)為20%的人血清中最低Tg 濃度［13］。對于TgAb 陰性患者的血清Tg 來說，造成Tg 測量誤差的原因主要是Tg 的功能敏感性在不同測定方法間的差異以及Tg 的特異性。目前第一代Tg 免疫測定法功能敏感性為0.5～1.0 mg/L，第二代Tg 免疫測定法功能敏感性≤0.1 mg/L，兩者相差了至少 5 倍［14］。由于試劑批次和校準(zhǔn)器、儀器因素和其他變量的影響，以及DTC 患者血清Tg監(jiān)測的臨床周期較長（6～12 個月），均會導(dǎo)致檢測精確度下降，對患者的管理產(chǎn)生負(fù)面影響，所以建議實驗室使用TgAb陰性患者血清校準(zhǔn)該檢測的功能靈敏性［15-16］。

不同的Tg 檢測方法均需經(jīng)過BCR?457 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，在此之前不同方法間的Tg 檢測結(jié)果差異高達(dá)60%［15］。BCR?457 在 Tg 測定標(biāo)準(zhǔn)化中的使用大大降低了方法間的變異性，但是當(dāng)采用不同方法測定同一樣品時，測得的Tg 水平仍然具有顯著差異［12］。這些方法間的差異反映了Tg 的特異性，使得不同的檢測試劑和檢測方法可檢測出不同的Tg 亞型。而對于腫瘤來源的Tg，方法間的不一致反映在不同方法報告值之間的異常比率上，這表明當(dāng)Tg 結(jié)構(gòu)異常時不同的表位可能被掩蓋或暴露。

4 TgAb陽性對Tg檢測的干擾

TgAb 以定性、定量和方法依賴的方式干擾Tg測定，采用RIA 和IMA 兩種方法檢測同一血清樣本時，Tg IMA 值是降低的，而Tg RIA 值升高或者降低取決于患者TgAb和試劑之間的相互作用。

RIA 是一種非自動化、非同位素且需要較長時間才能達(dá)到最高功能敏感性的Tg 分析方法，且在檢測過程中可以導(dǎo)致Tg 的假陽性或假陰性。IMA 是一種實驗周期短、自動化、功能敏感性高（0.05～1.0 μg/L）的 Tg 測定法，相對于 RIA 來說，IMA 對TgAb 干擾的抵抗力較差，即便是低濃度的TgAb 也會引起Tg 降低甚至檢測不到，其原因可能是TgAb結(jié)合Tg 時掩蓋了單克隆抗體試劑識別所需的表位［5，8］。目前最新的檢測方法是 LC-MS/MS，該方法利用胰蛋白酶切割包括TgAb 和其他抗體在內(nèi)的一切蛋白質(zhì)，以降低 TgAb 對血清 Tg 的干擾［12］。NET?ZEL 等［12］研究比較了 3 種不同的 Tg 檢測方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于大多數(shù)TgAb 陽性的血清樣品來說，LCMS/MS 檢測的 Tg 值明顯高于 IMA 和 RIA；在 IMA 無法檢測到Tg 的情況下，LC-MS/MS 可將檢測Tg 的效率提高22%；但是，LC-MS/MS 檢測TgAb 陽性患者復(fù)發(fā)或殘留甲狀腺癌的臨床敏感性卻低于功能敏感性≤0.1 mg/L 的IMA（42%vs55%），只有當(dāng)LC-MS/MS 和IMA 使用相同的功能敏感性（0.5 mg/L）時，LC-MS/MS 檢測的敏感性略高于IMA，具有相當(dāng)?shù)奶禺愋浴ZMAT 等［17］也發(fā)現(xiàn)了相似的敏感性結(jié)果。盡管LC-MS/MS的檢測效率較高，但價格昂貴，且無法完全避免TgAb 對血清Tg的干擾，因此LC-MS/MS在臨床上的實用性問題仍有待解決［18］。

5 TgAb 對頸部淋巴結(jié)細(xì)針穿刺（FNA）洗脫液中Tg（FNA-Tg）的干擾

FNA-Tg 檢測在鑒別頸部DTC 的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移方面的作用已經(jīng)得到了證實［19-20］，然而在這些洗脫液中也存在TgAb。目前TgAb對血清Tg的干擾是眾所周知的，而TgAb 是否會干擾FNA-Tg 的評估也備受學(xué)者關(guān)注。

5.1 TgAb陰性對頸部淋巴結(jié)FNA-Tg的干擾 TgAb陰性時不會對頸部淋巴結(jié)FNA-Tg 產(chǎn)生干擾。JO等［21］對 273 例 DTC 患者的 370 枚可疑頸部淋巴結(jié)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在惡性淋巴結(jié)中，TgAb 陰性組單獨采用 FNA-Tg 與 FNA-TgAb 聯(lián)合 FNA-Tg 的診斷效果無明顯差異；此外，相對于TgAb 陽性組的FNA-Tg（2.5～6.0 ng/mL），TgAb 陰性組在FNA-Tg 為6.0～8.5 ng/mL 時的診斷效能最高。DUVALMA 等［22］對119例可疑的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移DTC患者進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)65例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中TgAb陽性和陰性者FNA-Tg無顯著差異，提示TgAb水平對FNA-Tg無明顯干擾，其原因可能與細(xì)胞內(nèi)Tg不與循環(huán)中的TgAb接觸有關(guān)。

5.2 TgAb 陽性對頸部淋巴結(jié)FNA-Tg 的干擾 由于臨床數(shù)據(jù)的缺乏，目前關(guān)于TgAb陽性對頸部淋巴結(jié) FNA-Tg 的干擾尚存在爭議［21，23-24］。一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)，TgAb 陽性組和TgAb 陰性組惡性淋巴結(jié)內(nèi)FNA-Tg 水平無明顯差異，提示TgAb 陽性不會影響 FNA-Tg［24］。同樣，DUVALMA 等［22］也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。此外，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中FNA-Tg水平遠(yuǎn)高于FNA-TgAb 水平，說明轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中Tg 可以克服由于飽和的TgAb結(jié)合位點而引起的干擾，并且洗脫液中稀釋的TgAb 可以導(dǎo)致頸部淋巴結(jié)內(nèi)TgAb缺失或減少［26］。

但 SHIN 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中 TgAb陽性組的FNA-Tg 值明顯低于TgAb 陰性組，且FNATg 與血清TgAb 之間存在顯著相互作用。此外，在1例份TgAb 陽性的轉(zhuǎn)移性頸部淋巴結(jié)中未檢出FNA-Tg，但病理上Tg染色較強(qiáng)，提示血清TgAb水平過高干擾了FNA-Tg 測定，從而導(dǎo)致假陰性FNA-Tg值，且高濃度TgAb 也與FNA-Tg 敏感性和陰性預(yù)測值顯著降低相關(guān)。同樣，JO 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，良性淋巴結(jié)中TgAb 陽性組和TgAb 陰性組的FNA-Tg 無顯著差異，而在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中TgAb 陽性組FNA-Tg 水平明顯低于TgAb陰性組；且在TgAb陽性患者中，無論是否聯(lián)合FNAC，F(xiàn)NA-Tg的診斷準(zhǔn)確率都比較低。因此，仍然需要更多的前瞻性研究來評估TgAb陽性對頸部淋巴結(jié)FNA-Tg的干擾。

6 FNA-TgAb對FNA-Tg的干擾

BOI 等［26］的一項小樣本研究同時測定了穿刺洗脫液中的TgAb 和Tg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有25%的患者FNATgAb陽性，濃度分別為722、162 IU/mL；對于穿刺液中存在TgAb，可能的原因為淋巴細(xì)胞的分泌以及穿刺對血液的污染。此外，該研究在穿刺液中檢測到TgAb 的2 例患者FNA-Tg 水平明顯降低，提示穿刺洗脫液中的TgAb 實際上可能干擾了Tg 的檢測。但是，這種干擾似乎對TgAb 陽性患者的FNA-Tg 水平影響很小，因為FNA-Tg 水平均遠(yuǎn)高于臨界值水平，其原因可能是高水平FNA-Tg 患者中高濃度的Tg 能夠飽和TgAb的結(jié)合位點。

綜上所述，血清TgAb 和Tg 是DTC 患者隨訪中的兩個重要血清學(xué)指標(biāo)，TgAb 可對DTC 患者Tg 的測定產(chǎn)生干擾，在TgAb 陽性時導(dǎo)致Tg IMA 值降低，而Tg RIA 值升高或者降低導(dǎo)致Tg 不能作為DTC 隨訪的可靠腫瘤標(biāo)記物；FNA-TgAb 陽性可干擾FNATg 值，導(dǎo)致 FNA-Tg 下降，使得 FNA-Tg 在預(yù)測頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面效果不佳；而穿刺洗脫液中的TgAb雖可降低FNA-Tg，但這種干擾似乎對TgAb 陽性患者的FNA-Tg影響很小，需要更多的前瞻性研究來探討。盡管已知TgAb 會干擾Tg 的檢測結(jié)果，但目前尚無TgAb 陽性的共識性標(biāo)準(zhǔn)，也未能解決關(guān)于TgAb干擾Tg的臨界水平等相關(guān)問題。因此，DTC患者的隨訪除結(jié)合常規(guī)的隨訪指標(biāo)外，還應(yīng)進(jìn)行抗TgAb 干擾的Tg 檢測實驗，并開展新型的預(yù)后指標(biāo)，如循環(huán)上皮細(xì)胞、分子標(biāo)記、DNA測序等。